筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

この手順の全体的な目標は、タールDNA結合タンパク質に対する形態特異的試薬を単離することです。2相A FMベースのラジオパンニング技術を利用してLSに存在する43の変異体。これは、まず、免疫チューブを使用して、多様なファージライブラリをオフターゲット抗原に対する複数のラウンドのネガティブパンニングにさらすことによって達成されます。

ネガティブパンニングは、ウシ血清アルブミン、凝集アルファシヌクレイン、および健康なヒト脳組織に対して順次行われます。2番目のステップは、ネガティブパンニングの各セットの後にFM検証を完了し、不要なファージをすべて正常に除去することです。このネガティブパンニングの例では、凝集したαシヌクレインファージを使用すると、1ラウンド後には表示されますが、10ラウンド目以降は見えなくなります。

次に、サンプルの可用性が限られているため、残りのネガティブ パン ラウンドは MICA で実行されます。免疫沈降TDP 43に反応するファージは、健康な組織および前頭側頭型認知症またはFTD組織から採取されます。最後のステップは、免疫沈殿したLSに結合するファージを単離することです。

マイカ結合ファージを用いたTDP 43は、トリプシン、トリエチル、アミン、およびTG One細胞を用いて言及されています。最終的に、これらのポテンシャルであるLSクローンの特異性は、間接的なファエリザとドットブロットを使用して検証され、均質化されたA-L-S-F-T-Dと健康なヒト脳組織は両方のアッセイで固定化されます。LS組織に対する反応性が高いことは、通常、他の試験群と比較して検出されます。

従来のファージバイオパニングに対するこの手法の主な利点は、FMによって検証された徹底的なネガティブパニングプロトコルを使用して、低濃度で存在する場合でも、複雑な生物学的サンプルから直接疾患特異的タンパク質変異を選択的に認識する試薬を確実に分離できることです。FMは、生体分子の特徴や相互作用の調査に関する洞察を得ることができますが、バイオペニングの進行のモニタリングや単一CLOの特異性の確認など、他のシステムにも適用できます。この手順は、テキストプロトコルで詳述されているようにファージ産生から開始し、最初にBSAに対してネガティブパンニングを行い、1ミリリットルあたり1ミリグラムの4ミリリットルを追加します。

リン酸緩衝生理食塩水またはPBS中のBSA溶液を12本の免疫チューブに注入し、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、3つのライブラリのそれぞれからファージ粒子を結合し、このファージ混合物を少量取っておいて、ネガティブパンニングプロセスの将来の検証に備えます。次に、最初のチューブからBSA溶液を廃棄し、チューブをPBSで2〜3回洗浄して未結合のBSAを除去し、結合したファージライブラリをこの最初のチューブに追加し、ローテーターで室温で30分間インキュベートしてから、未結合のファージを収集します。

各ターゲットに対する多数のネガティブパンニングを終えた後、パンニングプロセスの成功を確認するために少量のファージを保存することが重要であり、汚染が発生した場合は、BSA溶液の残りのチューブで毎回ネガティブパンニングプロセスを繰り返すことが重要です。前のチューブのインキュベーション後に採取した非結合ファージを使用してください。次に、ビデオの次のセクションで詳しく説明するA FM手順を使用して、すべてのBSAファージバインダーの除去を確認します。

FMを使用してファージ結合を可視化するには、10〜20マイクロリットルの標的抗原をCleaved、Micaに添加し、5〜10分間インキュベートします。MICAを水で5回洗浄し、10〜20マイクロリットルのファージをMICAに加え、5〜10分間インキュベートします。マイカをさらに5回水で洗い、風乾させます。

室温の空気中でnano scope three、コントローラーであるnano scope threeを使用したFMタッピングモードを使用して、FMイメージングプロセスを実行します。FMプローブのシリコンは、共振周波数が300キロヘルツで、スプリング定数は40ニュートン/メートルです。FMチップをチップローダーに挿入します。

チップローダーをAFM顕微鏡に取り付けます。サンプルをAFM顕微鏡の下に置きます。ノブを使用して、レーザーをAFMチップに合わせます。

スキャン速度を 3.05 ヘルツに設定し、スキャン解像度をラインあたり 512 サンプルに設定します。機械を自動調整して、シリカの振動を最適化します。チップの周波数で、サンプルスキャンを開始します。

チップはMICAの表面をスキャンし、結合したファージの高さを測定します。ファージは、取得プロセスに続く長い白い線で、背景を基本的に平坦化して画像を平坦化し、各画像内ですべての粒子サイズが同等になるようにします。ファージ幅は、他の粒子サイズやスキャン領域により画像ごとに異なる場合がありますが、ファージが抗原に結合するかどうかの精度を損なうことはありません。

画像は A 2D 画像に平坦化され、PEG 汚染によって引き起こされた画像化が不十分な領域は、将来のデータ分析から除去するために強調表示されます。免疫沈殿タンパク質の量が少ないため、テキストプロトコルに記載されているように、健康なヒト脳組織から健康なTDP 43タンパク質を免疫沈殿させます。MICAを使用してこれらのネガティブパンニングのラウンドを実行します 免疫沈降タンパク質の約100マイクロリットルで最初のMICAに8つのMICA表面を切断し、インキュベーション後室温で5〜10分間インキュベー

MICAを0.1%リン酸緩衝生理食塩水で5回洗浄し、20の略称PBSTで洗浄します。次に、健康なヒト脳組織に対するネガティブパンニング後に約100マイクロリットルのファージを加え、室温で5〜10分間インキュベートします。インキュベーションの途中で、免疫沈降タンパク質を2番目のマイカに加えます。

最初のMICAからファージを採取してから、MICAを0.1%PBSTで5回洗浄します。2番目のマイカを洗浄した後、以前に収集したファージを追加します。ファージが免疫沈降タンパク質で8つのマイカすべてに対して負にパンニングされるまで、プロセス全体を繰り返します。

テキストプロトコルに記載されているように、LSを持つ個人の脳からTDP 43タンパク質を免疫沈降させるためのFMによるネガティブパンニングの1回目と8ラウンド後にファージを使用してパンニングプロセスの成功を確認し、3つのMICA表面を切断します。次に、室温で5分間インキュベートした後、50マイクロリットルのA LS TDP 43を最初のMICAに加えます。MICAを0.1%PBSTで5回洗浄します。

次に、健康なTDP 43に対するネガティブパンニング後に採取したファージ50μLをMICAに加え、5分間インキュベートします。結合されていないファージを収集します。これらのパンニングステップで収集されたすべてのファージを別々に保持することが重要です。

次に、3つのelucianメソッドを使用して結合したファージを収集します。まず、各MICAに50マイクロリットルのトリプシンを加え、10分以内でインキュベートします。ソリューションを収集して保存します。

次に、50マイクロリットルの100ミリモルトリエチルアミンを各MICAに加え、10分以内でインキュベートします。等量の1モルトリスHCL緩衝液pH 7.4で溶液を収集し、3番目に保存し、50マイクロリットルのTG One細胞を直接MICAに加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。また、最初の2つのelucian法から収集したファージを、同じ濃度のTG one細胞100μLに添加し、摂氏37度で30分間インキュベートします。

次に、2番目のマイカでこのプロセスを繰り返します。A LST DP 43 を含む 1 番目の MICA を使用して収集した未結合ファージを取り出し、それを A-A-L-S-T-D-P 43 を含む 2 番目の MICA に加えて 5 分間インキュベートします。各A LST DP 43 MICAからのトリプシンでほのめかされたファージに感染したTG 1細胞を組み合わせ、アンピシリンまたはLBAプレートですべてのルリアブラニオーガープレート上のプレート

トリエチルアミンとTG 1について同じプロセスを繰り返し、合計3枚のプレートの2セットのA LS TDP 43 MICAからファージを示唆しました。3番目のA LSマイカですべての手順を繰り返しますが、この場合、前頭側頭型認知症に対する2ラウンドのネガティブパンニングの後に収集されたファージを使用します。T DP 43は、感染したTG 1細胞を3つのLBAプレート上にプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日。6つのLBAプレート上のコロニーの数を数え、LSクローンの可能性があります。健康なTDP 43に対するネガティブパンニング後のファージを利用した2ラウンドのポジティブパニングの後、3つのLBAプレートから3つのLBAプレートから3つのLBAプレート上のコロニーが少なくなり、これらのクローンからファージと可溶性一本鎖可変ドメイン抗体フラグメントまたはsのcvsが生成され、LS組織への特異性を確認するために異なるイムノアッセイを使用して分析されます。

FMイメージングは、さまざまなターゲットに対するネガティブパンニングステップをモニターし、すべての反応性ファージが除去されるようにするために使用されます。FMの結果は、凝集したαシヌクレインに対するネガティブパンニングを1ラウンド行った後にファージが結合し、8ラウンド後には結合がないことを示しました。健康なヒト脳組織に対するネガティブパンニングを行い、健康なヒト脳ホモジネートに存在する多くの抗原に結合するファージを除去しました。

ここに示されているのは、1ラウンドのネガティブパンニング後に健康な組織に結合するファージと、10ラウンドのネガティブパンニング後にファージが結合しなくなったことです。潜在的なクローンからファージと可溶性SCFEの両方を調製した後、LS組織に対する特異性について間接的なElizaで試験しました。ほとんどすべてのファージは、健康な組織よりもLS組織を好むことを示しました。

LSへのファージ結合を前頭側頭型認知症またはFTD組織と比較した場合も同様の結果が得られます。健常組織とFTD組織の両方におけるLS組織へのSCFV結合の比較は、ほとんどすべてのクローンでLS組織への選択的結合を再び示しました。ドットブロットイムノアッセイは、LS組織への結合をさらに検証し、他の免疫学的アプリケーションでどのクローンが反応性があるかを確認するために使用されました。

ここでは、LS組織への結合であるクローン2が示されている。このビデオを見れば、FMベースのバイオパンニングを適用して、病気に対する試薬、特定の関心ターゲット、潜在的な診断ツールや治療ツールとして役立つ可能性のある試薬を分離する方法をよく理解できるはずです。