Name: 筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング技術を用いて、筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43変異体に対する形態学的試薬を分離する方法。この技術は低濃度タンパク質の検出にも応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R21AG042066：この研究は、NIHからの助成金によってサポートされていました。私たちは、画面キャプチャのビデオを作成する際の彼の貢献のためにフィリップ·シュルツに感謝したいと思います。

<ol><li>Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+recombinant+antibodies+against+specific+protein+morphologies+using+atomic+force+microscopy+and+phage+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies.</a> Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).</li>
<li>Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Human+Single+Chain+Antibody+Fragment+Against+Oligomeric+%CE%B1-Synuclein+that+Inhibits+Aggregation+and+Prevents+%CE%B1-Synuclein-induced+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity.</a> Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).</li>
<li>Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Morphologically+Distinct+Oligomeric+Forms+of+%CE%B1-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+specific+for+oligomeric+beta-amyloid+stabilizes+nontoxic+form%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form.</a> Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+antibody+fragments+selective+for+specific+protein+morphologies+from+nanogram+antigen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples.</a> Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).</li>
<li>Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-oligomeric+A%CE%B2+Single-chain+Variable+Domain+Antibody+Blocks+A%CE%B2-induced+Toxicity+Against+Human+Neuroblastoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells.</a> Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+%CE%B2-Secretase+Activity+in+Alzheimer%27s+Disease+Cell+Models+with+Single-Chain+Antibodies+Specifically+Targeting+APP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP.</a> Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+Tandem+Single+Chain+Antibody+Simultaneously+Inhibits+%CE%B2-Secretase+and+Promotes+%CE%B1-Secretase+Processing+of+A%CE%B2PP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).</li>
<li>Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Single-Chain+Fv+Intrabody+Blocks+Aberrant+Cellular+Effects+of+Overexpressed+%5Balpha%5D-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein.</a> Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43-mediated+neurodegeneration%3A+towards+a+loss-of-function+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).</li>
<li>Akamatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+mouse+model+for+investigating+the+properties+of+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+protein+TDP-43%2C+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation.</a> Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).</li>
<li>Keage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+in+the+Population%3A+Prevalence+and+Associations+with+Dementia+and+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).</li>
<li>Honda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALS%2FFTLD-related+RNA-binding+proteins+TDP-43+and+FUS+have+common+downstream+RNA+targets+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons.</a> FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).</li>
<li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43%3A+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li>
<li>Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).</li>
<li>Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+subcellular+localization+of+TDP-43+immunoreactivity+in+the+anterior+horns+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).</li>
<li>Robertson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+TDP-43+abnormalities+in+mutant+SOD1+transgenic+mice+shows+disparity+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS.</a> Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).</li>
<li>Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+of+TDP-43+in+the+G93A+mutant+SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS.</a> Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+processing+of+TDP-43+is+not+an+upstream+event+of+reduced+ADAR2+activity+in+ALS+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons.</a> Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+abolishes+mutant+TDP-43+induced+excitability+in+a+motoneuron-like+cellular+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS.</a> Neuroscience. 272, 141-153 (2014).</li>
<li>Sheets, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library%3A+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li>
<li>Hairul Bahara, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+antibodies+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Phage display antibodies for diagnostic applications.</a> Biologicals. 41, 209-216 (2013).</li>
<li>Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+%28Bt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cry1B+toxin.+Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li>
<li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+salivary-pellicle-binding+peptide+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display.</a> Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).</li>
<li>Adamson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+antibodies+to+the+prion+protein+identified+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display.</a> Virology. 358, 166-177 (2007).</li>
<li>Hebron, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+%28TDP-43%29+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+%28HDAC6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li>
<li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li>
<li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li>
<li>Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages%E2%80%94review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The influence of external factors on bacteriophages—review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li>
<li>Hammers, C. M., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Phage+Display%3A+Technique+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antibody Phage Display: Technique and Applications.</a> J Invest Dermatol. 134, e17(2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

タンパク質変異体は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALS、FTD1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 などの多くの神経変性疾患の進行に関与していることが示されています。 これらの異なるタンパク質変異標的を選択的に認識できる抗体の単離は、そのような病気を研究、診断し、治療するための効果的な試薬となり得ます。 このようなバリアント特異的抗体を生成するために、原子間力顕微鏡を利用して各ステップの進行状況を監視する新しいバイオパニングプロセスを開発しました。 同様のネガティブおよびポジティブのバイオパニングの組み合わせを使用した以前の研究では、オリゴマーベータアミロイド5に結合するクローンが得られました。 ここでは、これらの研究を拡張して、ヒトの脳組織サンプルに存在する疾患特異的タンパク質変異体に選択的に結合する試薬を効率的に生成できることを実証します。ヒトALS脳組織に特有に存在するTDP-43変異体を選択的に認識する形態特異的試薬を単離しました13,14。 今後の研究では、標的となっているTDP-43バリアントの特性評価(凝集型か改変型かにかかわらず)が必要です...

タンパク質変異体の存在は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALSおよび前頭側頭型認知症（FTD）1,2,3,4,5,6,7,8,9などの神経変性疾患を含む多くの疾患の進行の要因として関与している、10,11。タンパク質βアミロイドおよびα-シヌクレインのオリゴマー形態は、それぞれ2,3,4,5、アルツハイマー病及びパーキンソン病の原因で有毒種であると考えられている。 TAR DNA結合タンパク質43（TDP-43）の凝集体は、ALSとFTD 12,13,14にリンクされている。したがってそのような選択的に異なるタンパク質変異体は、診断マーカーおよび潜在的な治療薬として機能するための強力なツールであることができるターゲットにすることができる抗体などの試薬。本研究では、しかし、本論文で概説技術はprotの広い範囲に対して、試薬の分離に適用可能であるべきである、選択的にALSに関与TDP-43タンパク質の変異体を結合した​​試薬の開発に注力EIN変種。 TDP-43の細胞質の凝集は、ALS 15,16,17,18,19における病理学的特徴として同定されている。これは、サイトゾルおよび核15,17間を移動する傾向があるが、典型的にTDP-43は、正常な個体からのすべての細胞の核内に見出される。しかし、ALSにTDP-43の形態は、疾患の進行16,20の間に核から細胞質へのTDP-43の動きを示唆して核内に見つかったより低い濃度で選択したニューロンとグリアの細胞質で検出された集約。 TDP-43の凝集がALS症例の大多数において見出されているが、1％-2合計ALS症例の％（または家族性ALS症例の15％-20％）の変異にリンクされているので、すべての場合を考慮していないスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）遺伝子15,17。そのためALS症例の大多数においてTDP-43の重要な役割のために、ここでは選択的にTDP-43変異体にも結合することができる抗体ベースの試薬の開発に注力私たちの小説AFMベースのバイオパニング技術を利用して、人間のALSの脳組織に存在する。 当初我々は、抗体結合ドメインの多様なレパートリーを必要としています。我々は、3つの異なるファージディスプレイ単鎖可変ドメイン抗体フラグメント（scFvの）ライブラリ（トムリンソンIとJとシートライブラリ21）を合わせた。パニングプロセスは、負および正のパニング段階に分けられる。ライブラリーからのファージを、最初に、複数のオフターゲット抗原が排除されるに反応するファージその間ネガティブパニングプロセスに供される。各オフターゲット抗原に対するネガティブパニングの各ラウンドが終了した後、プロセスは、オフターゲット抗原に結合する全てのファージが除去されたことを確認するためにAFMイメージングによってモニターされる。のみすべての反応性のファージを除去したAFMイメージングによって確認した後、我々は次の目標に進んでください。 ALSに関与TDP-43の変種に対する試薬を分離するために、我々は以下の負のパンニングの抗原を利用：<html>タンパク質に弱く又は非特異的に結合するファージを除去するための1）BSA。凝集したタンパク質のジェネリック構造要素に結合するファージを除去するための2）凝集したα-シヌクレイン。 3）ヒト脳組織ホモジネートは、任意のタンパク質または健康なヒトの脳組織の死後のサンプル中に存在する他の成分に結合するファージを除去する。 4）健康なヒトの脳に関連するすべてのTDP-43のフォームに結合するファージを除去するために健康なヒトの脳からTDP-43を免疫沈降した。 5）非ALSの病態に関連TDP-43変異体を結合するファージを除去するためにFTD脳ホモジネートからTDP-43の単離された免疫沈降した。すべてのオフターゲット抗原に対する反応性のすべてのファージを除去した後、我々は、この場合には、TDP-43は、ヒトのALS脳組織から免疫沈降し、目的の抗原に結合する抗体断片が単離され、その間に正のパニング段階に進む。これらの単離された抗体は、TDP-43の集約または改変された形態への反応性であり得る。 &quot;&gt;従来のファージパニングは正のパニング段階22,23に主に焦点を当てている。通常、目的の標的が固定化され、ファージライブラリーを添加し、結合したファージは、この増幅は、インキュベーション工程をファージを次に増幅される。溶出し、再びターゲットに追加このプロセスのバリエーションは、標的抗原の広い範囲に対する抗体試薬を単離するために広く使用されてきたが、通常は正の結合ファージの割合を増加させるために数回繰り返され、それらは一般的に精製された標的抗原24,25,26を大量に必要とし、本プロセスは、ターゲット抗原の微量必要一方、 図27は 、ここで説明するプロトコルは、精製およびパンを必要とせずに非常に低い濃度で存在している選択的に結合する標的抗原は、に対して直接行うことができる試薬を単離することができる複雑な組織サンプル中に存在する抗原。確認されるように徹底的なネガティブパニングプロトコルの使用AFMにより正の抗原に対する単離されたクローンを選択的に精製または濃縮なくても標的に結合する必要があることを保証します。 Kasturiranganら（2003）は、ターゲット5ナノグラム濃度を用いてオリゴマーβ-アミロイドに対して反応性の抗体を単離するために類似の負及び正のバイオパニングプロセスを行った。ここでは、選択的に結合する疾患特異的タンパク質がヒト組織サンプルから直接改変試薬の生成を有効にするには、このプロセスに展開します。今後の研究では、我々はさらにだけでなく、ここで分離された試薬の診断価値を調査するだけでなく、ALSの治療のためにそれらの治療の関連性を評価していきます。 全体として、本発明の新規なAFMベースのバイオパニング技術は、タンパク質精製または修飾を必要とせずに、任意の生物学的材料の任意の疾患特異的タンパク質変異体の単離に適用可能であるべきである場合でも、標的抗原concentratioナノは極めて低い。

<table><tbody><tr><td>Tomlinson I and J Libraries</td><td>MRC (ケンブリッジ、イングランド)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sheets Library</td><td>MRC (ケンブリッジ、イングランド)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>BD Sciences</td><td>244020</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Amresco</td><td>0188-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>KM13 Helper Phage</td><td>MRC (ケンブリッジ、イングランド)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>OmniPur</td><td>5880</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール8000</td><td>OmniPur</td><td>6510</td>刺激<td>性塩化</td></tr><tr><td>ナトリウム</td>マクロ<td>ン</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性</td><td>Amresco</td><td>0404-1KG</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>EMD</td><td>PX1405-1</td>刺激<td>性</td></tr><tr><td>カリウムリン酸塩一塩基性</td><td>Amresco</td><td>0781-500G</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>TG1細胞</td><td>MRC(ケンブリッジ、イギリス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani寒天</td><td>EMD</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>STEN</td><td>バッファーCrystalgen Inc.</td><td></td><td></td>33429775</tr><tr><td>イムノチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>470319</td><td></td></tr><tr><td>マイカ</td><td>スプルース パイン マイカ</td><td>24365</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>EMD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma</td><td>T-0303</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>Sigma</td><td>T-0886</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>DNAプラスミド調製キット</td><td>qiagen</td><td>27106</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>非脂肪粉乳</td><td>カーネーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル高結合 ELISAプレート</td><td>共催器</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>抗M13 HRP</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>27-9421-01</td><td></td></tr><tr><td>ELISA フェムト化学発光基板キット</td><td>Thermo Scientific</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>抗TDP 43ポリクローナル抗体</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>A/G アガロースビーズ</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>HB 2151 Cells</td><td>MRC (Cambridge, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthiogalactoside</td><td>Teknova</td><td>13325</td><td></td></tr><tr><td>9e10 HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall RC 6+</td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope IIIa 原子間力顕微鏡</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM プローブ</td><td>VistaProbes</td><td>T300R-10</td><td></td></tr></tbody></table>

筋萎縮性側索硬化症におけるtdp-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

タンパク質変異体は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病におけるα-シヌクレインおよびアルツハイマー病におけるβアミロイドおよびタウにおけるTDP-43を含む多くの疾患において重要な役割を果たしているので、選択的に標的とすることができる形態学的試薬を開発することが非常に重要であるこれらの疾患特異的タンパク質が疾患の病状および潜在的な診断および治療用途のためにこれらの変異体の役割を研究する変異体である。我々は、選択的に、疾患特異的タンパク質の変異体を認識する試薬の単離を可能にする新規の原子間力顕微鏡（AFM）ベースのバイオパニング技術を開発した。プロセスに関与する2つの主要な相、負および正のパニング段階がある。負のパン·フェーズでは、オフターゲット抗原に反応性のあるファージは、厳選されたオフターゲット抗原の一連を利用し、サブトラクティブパニングの複数ラウンドを排除している。負の重要な機能パニング段階プロセスを監視し、すべての望ましくないファージ粒子が除去されていることを確認するために、AFMイメージングを利用している。正のパニング段階のために、関心対象の標的抗原は、雲母表面上に固定され、結合したファージを溶出させ、選択的に標的抗原に結合するファージを同定するためにスクリーニングされる。標的タンパク質の変異体は、適切な負のパンコントロールが使用されている提供精製する必要はない。複雑な生物学的物質に非常に低い濃度でのみ存在するタンパク質変異体は、正のパニング段階で利用することができるターゲット。この技術を適用することにより、我々は選択的に、人間のALSの脳組織に見られるTDP-43のタンパク質変異体に対する抗体を獲得した。我々は、このプロトコルは、選択的に異なる生物学的プロセスおよび疾患の多種多様に存在するタンパク質の変異体に結合する試薬を生成することに適用可能であるべきであることを期待する。

図1では、回路図は、我々はイムノを使用して私たちのライブラリからオフターゲット抗原に結合するファージを削除したことにより、負のパニングプロセスを示しています。これは一般的なブロッキング剤であり、このターゲットと非特異的に反応するすべてのファージは将来のイムノアッセイにおいて問題となるので、私たちは、最初にBSAで始めた。次に、凝集したタンパク質（ すなわち、凝集したα-シヌクレインに対する交差反応性であろう抗体は、TDP-43、アミロイドβ など ）の一般構造を有する反応性のファージを除去するために、凝集α-シヌクレインの結合剤を除去した。 AFMの結果は集約されたα-シヌクレインに対する負のパンニング1ラウンド（ 図2A）の後に結合およびno 8ラウンド（ 図2B）の後に結合ファージを示した。次に、負に健康なヒトの脳ホモジネートに存在する多くの抗原に結合するファージを除去するために、健康なヒト脳組織に対してパンニング。 図2C </stronG&gt; 1ネガティ...

原子間力顕微鏡とバイオパニング技術を組み合わせて、低濃度であってもあらゆる生物学的材料に存在する疾患特異的タンパク質変異体に対する抗体を取得するためのネガティブおよびポジティブバイオパニングシステムを作成しました。 筋萎縮性側索硬化症に関与するTDP-43タンパク質変異体に対する抗体を取得することに成功しました。

筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

この手順の全体的な目的は、2相性A FMベースのラジオパニング技術を用いて、LS内に存在する43種類のバリアントから、tar DNA結合タンパク質に対する形態特異的な試薬を単離することである。これは、まず免疫チューブを用いて、多様なファージライブラリをオフターゲット抗原に対する複数回のネガティブパニングに供することによって達成される。陰性パニングは、ウシ血清アルブミン、凝集したα-シヌクレイン、および健康なヒト脳組織に対して順次行われます。第2のステップとして、各セットの陰性パニング後にFM検証を行い、不要なファージがすべて確実に除去されたかを確認します。この陰性パニングの例では、凝集したα-シヌクレインを用いた場合、1ラウンド後にはファージが確認されますが、10ラウンド後には消失しています。次に、サンプルの量に限りがあるため、残りのネガティブパニングラウンドをMICAで実施します。健常者および前頭側頭型認知症（FTD）組織から免疫沈降させたTDP-43に反応するファージを順次除去します。最終ステップでは、α-LS免疫沈降物に結合するファージを単離します。雲母結合ファージを用いたTDP-43の検出には、トリプシン、トリエチルアミン、およびTG1細胞が使用されています。最終的に、これらの潜在的なALSクローンの特異性は、間接ELISAおよびドットブロットを用いて検証されます。両方の分析において、ホモジナイズされたALS-FTDおよび健康なヒト脳組織が固定化されます。通常、他の試験群と比較して、ALS組織に対してより高い反応性が検出されます。本手法の従来のファージバイオパニングに対する主な利点は、FMによって検証された徹底的なネガティブパニングプロトコルを用いることで、低濃度でしか存在しない場合であっても、複雑な生物学的試料から疾患特異的なタンパク質変異体を選択的に認識する試薬の単離を確実にできる点にある。FMはバイオ分子の特徴や相互作用の解析に知見をもたらすだけでなく、バイオパニングの進行状況のモニタリングや、単一のCLOの特異性の確認など、他のシステムにも適用可能である。テキストプロトコルに詳述されているファージ調製から本手順を開始し、まずBSAに対するネガティブパニングを行うため、1 mg/mLの溶液を4 mL加える。12本の免疫チューブにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のBSA溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。次に、3つのライブラリそれぞれからファージ粒子を合わせ、後のネガティブパニングプロセスの検証用に、このファージ混合液のごく少量を取り分けておきます。その後、1本目のチューブからBSA溶液を捨て、PBSで2〜3回洗浄して未結合のBSAを除去します。この1本目のチューブに合わせたファージライブラリを加え、ローテーターを用いて室温で30分間インキュベートした後、未結合のファージを回収します。各ターゲットに対する多数回のネガティブパニングを完了した後、パニングプロセスの成功を確認するために、少量のファージを保存しておくことが重要であることを心に留めてください。また、コンタミネーションが発生した場合に備え、残りのBSA溶液のチューブを用いて、その都度ネガティブパニングプロセスを繰り返してください。その際は、前のチューブのインキュベーション後に回収した未結合ファージを使用します。その後、次のビデオセクションで詳しく説明するA FMの手順を用いて、すべてのBSA結合ファージが除去されたことを確認してください。FMを用いてファージの結合を可視化するには、切断したマイカに10～20 µLの標的抗原を加え、5～10分間インキュベートします。マイカを水で5回洗浄し、次に10～20 µLのファージをマイカに加えて5～10分間インキュベートします。さらにマイカを水で5回洗浄し、風乾させます。NanoScope IIIおよびコントローラーを用い、室温の大気中でAFMタッピングモードによるAFMイメージングプロセスを実行します。シリコン製AFMプローブの共振周波数は300 kHz、ばね定数は40 N/mです。AFMチップをチップローダーに挿入します。チップローダーをA FM顕微鏡に取り付けます。サンプルをA FM顕微鏡の下に配置します。ノブを使用して、レーザーをA FMチップ上に合わせます。走査速度を3.05 hertzに、走査分解能を1ラインあたり512サンプルに設定します。オートチューニングを行い、シリカの振動を最適化します。チップの周波数を調整し、試料の走査を開始します。チップでMICAの表面をスキャンし、結合したファージの高さを測定します。ファージは長い白い線として観察されます。取得プロセス後、各画像内で全ての粒子サイズを比較可能にするため、背景の基本的な平坦化処理を行い画像を処理します。他の粒子サイズやスキャン領域によって、画像ごとにファージの幅が異なる場合がありますが、ファージが抗原に結合しているかどうかの判定精度に影響を与えることはありません。画像は2次元画像にフラット化され、PEG混入によって画質が悪化した領域は、今後のデータ解析から除外するためハイライトされます。免疫沈降タンパク質の量が少ないため、テキストプロトコルに従い、健康なヒト脳組織から正常なTDP 43タンパク質を免疫沈降させます。まず、これらのネガティブパンニングのラウンドをMICAを用いて実施します。8つのMICA表面に対し、約100 µLの免疫沈降タンパク質を最初のMICAに加え、インキュベーション後、室温で5〜10分間インキュベートします。MICAを0.1% phosphate buffered saline with tween 20（略称：PBST）で5回洗浄します。次に、健康なヒト脳組織に対するネガティブパンニング後のファージを約100 µL添加し、室温で5〜10分間インキュベートします。インキュベートの途中で、免疫沈降させたタンパク質を2つ目のMICAに添加します。0.1% PBSTでMICAを5回洗浄する前に、最初のMICAからファージを回収します。2枚目のMICAを洗浄した後、 previously回収したファージを添加します。免疫沈降タンパク質を用いた全8枚のMICAに対してファージがネガティブパンニングされるまで、この全工程を繰り返します。テキストプロトコルに記載されている通り、LS患者の脳からTDP 43タンパク質を免疫沈降させるために、FMを用いた1回目および8回目のネガティブパニング後、ファージを用いたパニングプロセスの成功を確認し、3つのMICA表面を切断します。その後、室温で5分間インキュベートした後、最初のMICAに50 µLのA LS TDP 43を添加します。MICAを0.1% PBSTで5回洗浄します。次に、健康なTDP 43に対するネガティブパニング後に回収したファージ50 µLをMICAに添加し、5分間インキュベートします。未結合のファージを回収します。これらのパニングステップで回収したすべてのファージを別々に保管することが重要です。次に、3種類の溶出方法を用いて結合したファージを回収します。まず、各MICAに50 µLのトリプシンを加え、10分以内にインキュベートします。溶液を回収し、保存します。次に、各MICAに100 millimolarのトリエチルアミンを50 µL加え、10分以内でインキュベートします。1 molarのtris HCL緩衝液（pH 7.4）と同量を加えて溶液を回収し、保存します。続いて、TG1細胞50 µLをMICAに直接加え、37 °Cで30分間インキュベートします。また、最初の2つの溶出方法で回収したファージを、同濃度のTG1細胞100 µLに加え、37 °Cで30分間インキュベートします。次に、2枚目の雲母（mica）を用いてこの工程を繰り返します。1枚目のMICA（A LST DP 43）で回収した未結合ファージを、2枚目のMICA（A-A-L-S-T-D-P 43）に加えて5分間インキュベートします。各A LST DP 43 MICAからトリプシンで遊離させ、ファージを感染させたTG1細胞をまとめ、アンピシリン含有LBプレートまたはLBAプレートに塗布します。2セットのA LS TDP 43 MICAから、トリエチルアミンおよびTG oneを標的としたファージに対して同様の工程を繰り返し、計3枚のプレートを作成します。3枚目のA LS MICAを用いてすべての手順を繰り返しますが、この場合は前頭側頭型認知症に対する2ラウンドのネガティブパニング後に回収したファージを使用してください。T DP 43プレートおよび感染させたTG one細胞を3枚のLBAプレートに播種し、37°Cで一晩培養します。翌日。a LSクローンの候補が含まれる6枚のLBAプレート上のコロニー数をカウントします。健康なTDP 43産生ファージに対するネガティブパニング後、2回にわたるポジティブパニングを行った3枚のLBAプレートと比較して、3回目のa LS MICA後の3枚のLBAプレートのコロニー数は少なくなっているはずです。これらのクローンからファージおよび可溶性シングルチェーン可変領域抗体断片（scV）を作製し、さまざまな免疫アッセイを用いて分析し、a LS組織への特異性を検証します。FMイメージングを用いて、さまざまなターゲットに対するネガティブパンニングのステップをモニタリングし、すべての反応性ファージが除去されていることを確認します。FMの結果、凝集したα-シヌクレインに対する1回目のネガティブパンニング後にはファージの結合が見られましたが、8回目には結合が見られませんでした。また、健康なヒト脳ホモジネートに存在する多くの抗原に結合するファージを除去するため、健康なヒト脳組織に対するネガティブパンニングを実施しました。ここでは、1ラウンドのネガティブパニング後の正常組織へのファージ結合と、10ラウンドのネガティブパニング後にはファージの結合が見られなくなった様子を示しています。候補クローンからファージと可溶性SCFEの両方を調製した後、LS組織に対する特異性を間接ELISAで検証しました。ほぼすべてのファージが、正常組織よりもLS組織を優先的に認識することを示しました。ファージのLSへの結合と前頭側頭型認知症（FTD）組織への結合を比較した場合も、同様の結果が得られています。健常者およびFTD組織の両方のLS組織におけるscFvの結合を比較したところ、ほぼすべてのクローンにおいて、再びLS組織への選択的な結合が示されました。ドットブロット免疫測定法を用いて、LS組織への結合をさらに検証し、他の免疫学的アプリケーションにおいてどのクローンが反応性を持つかを確認しました。ここでは、LS組織に結合するクローンの分離について示します。このビデオを視聴することで、疾患特異的な標的分子に対する試薬を単離するためのFMベースのバイオパンニングの適用方法について、十分な理解を得ることができます。これらの試薬は、潜在的な診断ツールまたは治療ツールとして活用できる可能性があります。

novel-atomic-force-microscopy-based-biopanning-for-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

プラスミドDNA、細胞質タンパク質、およびDNA...

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

出典: Lunelli, L., et.al. 原子間力顕微鏡で脳ポリソームを覗き込む. J. Vis.

原子間力顕微鏡を用いたマウス脳から単離されたポリソームのイメージング

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope...

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

我々は、免疫学的研究のための単一のT細胞およびビーズ粒子を用いて原子間力顕微鏡(AFM)片持ちを機能化するプロトコルを提示する。AFMによる単一対T細胞樹状細胞結合をプローブし、蛍光イメージングを用いてAFMによる単一固体粒子に対するマクロファージのリアルタイム細胞応答を監視する手順が示されている。...

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。...

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

大規模な臨床研究を実施するためには、神経変性疾患の血液ベースのバイオマーカーが不可欠です。信頼性と検証済みの血液検査は、少量のサンプル量を必要とするだけでなく、より低侵襲のサンプリング方法、手頃な価格、再現性が必要です。本論文は、ハイスループットキャピラリー電気泳動免疫アッセイが、潜在的なバイオマーカー開発の基準を満たしていることを実証する。...

ヒト血小板における筋萎縮性側索硬化症の潜在的バイオマーカーを探索するためのキャピラリー電気泳動免疫学的研究法の使用

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

我々は、ゼブラフィッシュをモデルとして用いた脊髄運動ニューロンにおける光によるTARDNA結合タンパク質43(TDP-43)の相転移を誘導するプロトコルを記述する。...

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43の光遺伝学的相転移

本研究は、フィラメントの組み立て、凝集、翻訳後修飾に焦点を当て、GFAPおよびその病原変異を生化学的に特徴づける実験的方法を示しています。高純度のGFAPタンパク質を解析し、アレクサンダー病のメカニズムに関する洞察が明らかになり、潜在的な治療標的の研究やGFAP変異および関連疾患の理解の枠組みとなり得ました。...

グリア線維酸性タンパク質およびその疾患関連変異体の生化学的解析における実験的アプローチ

学ぶ原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング技術を用いて、筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43変異体に対する形態学的試薬を分離する方法。この技術は低濃度タンパク質の検出にも応用可能です。

筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

さらに動画を探す