Name: プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶプローブベースのリアルタイムPCR法による血漿・血清中マイクロRNAの定量測定手法。蛍光プローブを用いた高感度検出で、がんや糖尿病などの疾患バイオマーカー発見に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

すべての著者はNHMRC CTC、シドニー大学、若年性糖尿病研究財団（JDRF）、オーストラリア、レベッカクーパー財団、オーストラリアのインフラ支援を認める。本研究は、WWをAAH、オーストラリア研究会議（FT110100254）とJDRF、オーストラリア（CRN201314）からの補助金により資金を調達し、RJFとMVJは、すべての湿ったラボ実験を行った、ASJはデータ分析を行った。 WWは最初の草案を書いた。 AAHは、研究を計画し、データを分析した。すべての著者は、読んで、出版のために提出された原稿、図面およびワークシートの最終版に合意した。

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478(2010).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development%2C+regeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li>
<li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Endocrinol+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li>
<li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24(2006).</li>
<li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89(2009).</li>
<li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li>
<li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Endocrinol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148(2008).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li>
<li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292(2014).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294(2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li>
<li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury%3A+A+TaqMan%28R%29+Low+Density+Array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms%3A+microarray%2C+beads+array%2C+and+quantitative+real-time+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167(2011).</li>
<li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123(2006).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li>
<li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR%2C+how+to+use+it+and+what+is+available%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li>
<li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368(2012).</li>
<li>TPF & SPF File Download Options [Internet]. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html">http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html</a> (2014).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
</ol>

物品処理/出版費用は、出版物のために、この原稿の受け入れを、以下、Life Technologies社覆われていた。

正確で再現性のある結果を得るために、プローブベースの定量PCRプロトコル内の重要なステップはRT-製品の同じ体積および濃度は、それぞれのqPCR反応にロードされる）ことを確認1を作ることであり、2）成分の正しい比率とボリュームのために必要定量PCR反応を調製してよく混合し、3）正確かつ一貫性のあるボリュームは、各定量PCR反応に添加され、および、まだ心に留めながら、4）各サンプルと反応混合物の調製および負荷は、可能な限り最短の時間で完了している上記の重要なステップは、先に述べた。 マイクロ流体アレイカードは、適切な遠心分離し、特定のバケットが必要です。各バケットは3カード（空/ロードされた）を保持できます。常にバケットのすべての3つのスロットが占有されていることを確認し、バケットは遠心機の反対スロットに（このバケットが空またはフルいずれか3枚のカードを、また含まれている必要があります）同じようなバケツを置くことでバランスされている。 buckeにカードを配置しながらTホルダーは、8貯水池が上向きに突出して反応ウェルは遠心機の外壁に直面していることを確認してください。室温で1分間331×gでのカードをスピン。最初のスピンの後、遠心分離を開き、視覚的に、反応混合物を確保する384ウェルを介して分配されている。 1より多くの時間のために同じ設定でスピンを繰り返します。バケツからカードを取り出し、8貯水池の各反応混合物のレベルが均一であることを確認してください。貯水池に残った液体ボリューム内の任意の矛盾がさらに使いのカードが不適切にする。 RT-製品の同じ濃度を有するように、RNAの同一の入力濃度は、各RT反応に添加される。総RNA濃度は、マイクロvolumespectrophotometerを用いて測定される。観察260/280比は、血漿/血清から単離されたRNAは1.3と低くすることができる。これは、下流のqPCR関連プロセスに影響を与えるようには見えない、またはデータ30を生成した。同様に、の260/280比ここにテストされたRNAサンプルを観察し、定量PCRんの異常な効果を1.3から1.7の間であった。 そのような生体液からのもののような低RNA含有量のサンプルを使用する場合には、処理の前にRNAを定量することは困難である。私たちは、RNA単離での合成スパイクでの使用だけでなく、逆転写ステージをお勧めします。我々の経験では、 シロイヌナズナのmiRNA候補（ATH-のmiR-159AとATH-のmiR-172A）は、我々の経験では、より高いがある可能性があり（例えばCEL-のmiR-39またはCEL-のmiR-54のような） 線虫（Caenorhabditis elegans）の miRNAは、より好ましいAからのものよりも相同性シロイヌナズナ 。このような時期特異的スパイクインの使用は、異なる時点でアッセイし、複数の試料にわたってmiRNAのデータの正規化を考慮することができる。 cDNA合成反応のためのRNAの固定入力ボリュームを使用すると、32,33とが推奨される。 ここで説明したmiRNA定量化のための3つのプローブベースのプロトコルは、様々な量を必要とするトータルRNAインプット、異なるワークフローとコストの。ワークフローの各々は、miRNA標的の数と分析されるサンプルの数に基づいて、異なるスループットに対応するために設計されている。スループットを向上させる（384 rxnの3072 rxnは96 rxnが）で、反応あたりのコストは、単位時間にわたって得られたデータの量の増加に伴って減少する。これらのプラットフォームのすべてのTaqMan化学を利用するので、得られたデータの品質が類似していることが期待できる。のTaqMan qPCRに、血清/血漿試料9,11,27におけるmiRNAの存在量を同定するための十分に確立された方法である。ここで説明した3つのプラットフォームは、同じ化学的性質を共有するが、反応体積の減少は、転写産物の検出のダイナミックレンジの低下（ファーRJ ら 、未発表データ）につながる。 96ウェルのqPCRプラットフォームは低いスループットが、高感度·プラットフォームと我々の見解では、すべてのプローブベースのための「ゴールドスタンダード」（または系色素）をPCRプラットフォームです。しかし、これはよいサンプルの数百または数千のアッセイし、複数のマイクロRNAのためにされている場合、最も経済的または効率的なプラットフォームではない。マイクロフルイディクス（TLDA）およびナノ流体工学（OA）のプラットフォームは、より短い時間で大量のデータの取得を可能にするように設計された高スループット/コンテンツ·プラットフォームである。バッチ差がTLDAカードで観察されているが、これは、同じバッチからTLDAカードを要求することによって最小化することができる。本件契約カードの異なるバッチで同じサンプルを用いて試験した場合に低量miRNAは-私たちは、本件契約のプラットフォーム（ 図3）は半ばの17％の大幅な変動を示したことを観察。そこで、本件契約カードを使用して分析のための同じバッチ番号を使用することをお勧めします。この変化はまた、任意の潜在的なロードやペッティングエラーを含む技術的な変動に起因する可能性があります。しかし、我々は、本件契約カードの同じバッチを要求/ご注文をお勧めします。有意なバッチ変動はOAプラットフォーム上で観察されなかった。これにもかかわらず、TaqManに基づくexperimenTAL定量PCRは、血漿/血清サンプルにおけるmiRNAの豊かさを測定するためにオファーしやすさに近づく。ここで説明した低、中、高スループットのアプローチは非常に効率的で再現性のあるクリーンな（低バックグラウンドノイズ）化学を用いて試料およびmiRNAの範囲を分析するための柔軟性を提供する。

マイクロRNA（miRNA）は、遺伝子発現1-3の調節因子として機能する、約22ヌクレオチドの非コード（ncの）RNAである。動物におけるほとんどのmiRNAは、遺伝子発現2-4の負の調節をもたらす3 &#39;UTRを標的とする、mRNAとの配列特異的塩基対形成を介して機能する。これは通常、mRNAの翻訳の阻害を介してまたはリボソームドロップオフによって起こる。循環中のmiRNAは、糖尿病5-7、卵巣8、9前立腺および乳癌10,11、B型肝炎12及び他の自己免疫疾患13として種々の疾患の研究および臨床分野における新規バイオマーカーであることが示されている。研究は、よりアクセス可能と9,11-15低侵襲であり、ヒト血漿および血清試料から異なる細胞または組織における、ならびに循環中の豊富なmiRNAを同定するために行われている。 のmiRNA定量化するさまざまな方法は、電子てきたそのような標準的な96ウェルプレートプラットホーム4,12,16-18、マイクロ流体カードプラットフォーム12,18-23とナノ流体工学アレイプラットフォーム17,24などの複数のプラットフォームを使用して、定評。定量的リアルタイムPCR（定量PCR）は、複数の（色素増またはプローブベース）の化学を用いて転写物の相対または絶対数を測定する能力を提供しています。プローブベースのリアルタイムPCR化学は、単一の転写コピーを検出するために、低バックグラウンド蛍光と高感度の利点を提供しています。これは、比較的それmiRNA発現25を定量化し、決定するための好まれる方法作る、効果的な使い方が簡単かつ再現性の高いコストです。プローブベースの定量PCR法は、一般的に2つのステップを含む：転写（RT）および定量PCR 4,26,27を逆転。ステム - ループRTプライマーは、成熟またはプライマリmiRNA分子にハイブリダイズし、相補的な（c）のDNAに変換されるRTある。 cDNA産物の定量は、その後miRNA特異的PCRプライマーを用いて行われる26-28。プローブベースの定量PCRの原理は、蛍光タグ化プローブの加水分解を伴うリアルタイムで相補鎖伸長の検出に基づいている。これらのプローブは、蛍光レポーターおよびFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）できるようにするだけ離れている消光剤を含むように設計されている。蛍光レポーター（エミッタ）からの発光の検出は、クエンチャー分子に近接によってマスクされます。 Taqポリメラーゼ（polの）を上流プライマーから延びており、フォーク（プローブの5 &#39;末端）に達すると、Taqポリメラーゼのpolエキソヌクレアーゼ活性は、消光剤からの蛍光発光の物理的な解離/分離をもたらす、プローブを加水分解する。蛍光発光体の単一分子のこのリリースでは、検出器によって記録され、そのほか/反応からの蛍光シグナルの増加分として提示されている。蛍光の増加は、正確なquのを可能にする、生成されたPCR産物の量に比例する増幅された標的26,28のantification。 miRNAの定量における需要の増加とともに、ハイスループット技術の媒体は、多くのサンプルを短時間で処理することができるように開発されてきた。のTaqMan低密度アレイ（TLDA）は一方のプレート上で分析したmiRNAの数の増加を提供するプローブベースの定量PCR化学に基づく培地スループット革新的なマイクロ流体設計である。 TLDAは、cDNAを合成するために使用されるRT-プライマーの事前定義されたプールの使用を含む。これらのcDNAは、その後のqPCR 22,26,29を使用して、複数のmiRNAの発現を決定するために、カスタマイズされた384ウェルマイクロ流体カードに紡糸される。カードの各ウェルは、したがって、最大384の反応は、単一のTLDAカード26で処理することができ、特定のmiRNA（単数または複数）を増幅するために乾燥されたプライマーおよびプローブを含んでいる。 ナノ流体アレイは、遺伝子転写物の検出のために使用されるハイスループットプラットフォームである<sup&gt;同一のプローブベースの化学を用いて24。また、貫通孔ステンレス鋼スライド24上の3072の配列に33ナノリットルの反応混合物の簡単な取り付けを容易にするために、疎水性-親水性相互作用を提供する独自のマトリックスを利用する。この記事では、血清/血漿中のmiRNAを定量化するため、これらのメソッドを実行し、実行し、このようなデータを解釈する際に考慮しなければならない重要な要因であるかを証明するに焦点を当てています。アカウントに連れて行かれ、彼らの個々の利点と制限は、この記事で説明します。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプラットフォーム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆転写</td><td></td><td></td><td></td>用</tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&nbsp;</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 このアッセイは、RTプライマーとPCRプライマーのパックとして提供されます。</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 逆転写キット</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4366597または4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 または http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit は、96 ウェルプラットフォーム、TLDA、OpenArray の 3 つの TaqMan プラットフォームすべてで逆転写に使用されるのと同じキットです。</td></tr><tr><td>96ウェルプラットホーム</td><td></td><td></td><td></td>でのqPCR実験の場合</tr><tr><td>、2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix、AmpErase UNG&nbsp;</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix は、qPCR on&nbsp;2 つの TaqMan プラットフォーム - 96 ウェルプラットフォームと TLDA。</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学接着フィルム</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Microfluidics platform (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆転写</td><td></td><td></td><td></td>について</tr><tr><td>96ウェルプラットフォーム TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (上記参照) を参照してください。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT プライマー、Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 は RT に使用されます。2 つの TaqMan プラットフォーム (TLDA と OpenArray)。</td></tr><tr><td>Megaplex RT プライマー、Human Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 は、RT on&nbsp;2 つの TaqMan プラットフォーム (TLDA と OpenArray)。</td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メガプレックス プライマー プール、ヒューマン プール セット v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0は、RTに使用されます。2 つの TaqMan プラットフォーム (TLDA と OpenArray)。</td></tr><tr><td>プリアンプ</td><td></td><td></td><td></td>用</tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128または4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 または http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 TaqMan PreAmp Master Mix は、qPCR のプレアンプに使用されます。2 つの TaqMan プラットフォーム (TLDA と OpenArray)。</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp プライマー、Human Pool B v3.0&nbsp;</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 は、qPCR on&nbsp;2 つの TaqMan プラットフォーム (TLDA と OpenArray)。</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp プライマー、Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 は、qPCR on&nbsp;2 つの TaqMan プラットフォーム (TLDA と OpenArray)。</td></tr><tr><td>1x TEバッファー(100 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 1x TE Buffer は、qPCR のプレアンプに使用されます。2 つの TaqMan プラットフォーム (TLDA と OpenArray)。</td></tr><tr><td>384 well microfluidics (TLDA) カードを</td><td></td><td></td><td></td>ロードして実行するには</tr><tr><td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆転写</td><td></td><td></td><td></td>については</tr><tr><td>、96ウェルプラットフォームTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597または4366596) (上図参照)を参照してください。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレアンプ</td><td></td><td></td><td></td>については</tr><tr><td>、TLDA Pre-amplification Reagents (上記参照)をご参照くださいスライド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>を</td><td></td><td></td><td></td>ロードして実行するには</tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex OpenArray アクセサリーキット&nbsp;</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td></tr><tr><td>OpenArray 384ウェルサンプルプレート&nbsp;&nbsp;</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>OpenArray AccuFill システムのヒント&nbsp;</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

プローブベースのリアルタイムpcrは、マイクロrnaの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

プローブベースの定量的PCR（qPCRに）それが正確で再現性のある分析を提供する最も高感度な検出方法の一つであるので、転写産物量を測定するための好まれる方法である。プローブベースの化学は、他の（染料系）の化学的性質と比較して、少なくともバックグラウンド蛍光を提供しています。現在、転写産物量を定量するためにプローブベースの化学を使用して利用可能ないくつかのプラットフォームがあります。 96ウェルプレート中のqPCRしかし96サンプルまたはmiRNAの最大値のみが単一のランで試験することができる最も日常的に使用される方法である。多数のサンプル/ miRNAが分析される場合、これは時間がかかり、面倒である。そのようなマイクロフルイディクス（ 例のTaqManアレイカード）などの高スループットプローブベースのプラットフォームとナノ流体工学アレイ（ 例えば OpenArray）を提供し、再現性と効率的に短時間で多数の試料内の複数のマイクロRNAの存在量を検出することが容易になります。ここでは、実験aを実証血清または血漿、EDTA試料からのmiRNAの定量のため番目プロトコル、スループットの増加レベルを提供するプローブベースの化学3つの異なるプラットフォーム（96ウェルプレート、マイクロ流体及びナノ流体アレイ）を使用。

miRNAプローブに基づくアッセイの定量PCR反応のための推奨される容量は20μlである。注：我々は、5μlの反応体積は20μl容量4,7,30を使用して達成されるものと同様の結果を生成することが可能であることを確認した。 5μlに反応容量を小さくすると感度がかなりの損失なしに、試薬コストの75％の減少を可能にする。 図2に示されたように、反応を20μlの体積および5μlをアップ（0.92のR 2、P = 0.0002で）39サイクルまで、強力な共同関係を示している。 マイクロ流体アレイは、従来の96ウェルプレートのPCRと比較して複数のサンプルを分析するより効率的な方法であり、（AカードとカードBの場合）約5時間で、サンプル中で発現されたmiRNA 754上のデータを取得するためのツールを提供する。私たちは（試料Aと繰り返しサンプル）同じサンプル用のmiRNAマイクロ流体アレイカードを比較した図3A - 。Bは、ブランド·アルトマンプロットを示している（&lt;これらのサンプルのために試験されたすべての754のmiRNAのための強力な&gt; 3A）および相関プロット（3B）。 3異なる制御のmiRNA（U6、RNU44とRNU48）が複数の場所にカード（カードAとB）の両方にランダムに配置されています。 U6サイクル閾値（Ct）値は2実行の間を比較すると、我々は、値（ 表4）の間に有意差は観察されなかった。これは、U6を評価サンプルにおいてより豊富（低いCt値）で発現されることをここで留意することも重要である。私たちは、その後の共同効率的な98パーセント（図3C-D）の決定に全体的なmiRNAの同様の発現を持っていたラン（N = 150）の両方で0から19.99の間のCt値を持つすべてのmiRNAを、比較した。 betwee有意差とのmiRNAの数。 -両方のランで20と29.99の間のCt値を持つすべての277のmiRNAの、16のmiRは、オリジナルを繰り返し実行する（F図3E）との間で有意に異なっCt値は、両方のラン（ - H図3G）のために30〜40の間で選択されたときのnランは（327の89）増加した。 ナノ流体アレイプラットフォームは、図4Aに示されるように、試験した各血清/血漿試料からの754のmiRNAのためのデータを提供する。なお、これらの増幅曲線を検討することが重要である-それは、すべてのqPCRであるように-結果が真の増幅の指標であることを保証する。 48サブアレイの各（ 図1）は、3最も人気のある「ハウスキーピング」のncRNAのアッセイが含まれています。U6は、RNU44とRNU48 図4Bは、U6の典型的なクラスタリングは、単一のサンプルから複製し示しています。これらの複製は、低い標準偏差（SD &lt;0.5）を表示するので、信頼性の指標である。また、 図4Cは、第二の試料中のU6の複製物（SD&gt; 0.5）の増加の変動を示しています。これは妥当Oを否定するものではない残りのアッセイF、それはより徹底的な批判を必要としませんが。 U6は、生物学的流体中で最も「ハウスキーピング」のmiRNAと同様に、変数式を持つことができます。これは、 図4Cに概説試料の一つは、 図4Bに示すものよりも4倍未満U6コンテンツを表示することに留意すべきである。 （c）に提示され、サンプル中のU6のレベルは、パネル4Bに提示され1よりで始まる75％未満であることから、より大きな技術的変動が小さいため反応容量17によって悪化する転写産物のポアソン分布に期待されている。 実行が完了すると別の有用なツールでは、輸出のために利用可能な品質管理（QC）の画像、である。これらの選択は、各貫通孔が正常（ 図5）にロードされたことを確認するために、ROX、定量PCR試薬混合物中に見出さ受動染料の蛍光を使用する。エンスルーホール、または実際に<html>タイヤのサブアレイは、不十分な試料体積、蒸発、384ウェルサンプルプレート、完全Accufillシステムまたはそのチップ内のサンプルプレートシール、または欠陥を除去するための失敗のウェル中に存在する気泡によって読み込まれない場合があります。実際に検定がロードされなかったときに貫通孔アンロードはいずれも、「検出できない」として、標識miRNAを回避するために識別されなければならない。この問題が発生した場合、サンプル/マスターミックスの少なくとも5μlを384ウェルサンプルプレートの各ウェルにロードされていることを確認し、サンプルプレートが適切に装填する前に遠心分離し、ホイルシールが完全に除去され、そしてロードOpenArrayスライドを密封し、すべての連続した​​ランの割り当てられた時間内に実行されます。負荷の問題がまだ解決しない場合は、これらは、より可能性が高い特定のバッチや配列または関連消耗品の多くは、さらなる支援に関連することができる製造業者を通じて求められるべきである。 「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg&quot; /&gt; 図1：ナノ流体アレイワークフローのサンプルのレイアウト：（A）各384ウェルサンプルプレートは、最大8ナノ流体工学アレイのためのサンプルを保持することができる。 （B）で希釈し、事前に増幅されたcDNAは、隣接する8ウェルのグループにプールAとプールBで、8ウェル（4行による2列）に配置されます。各円は、1つのウェルを表す。 （C）サンプルプレートの各ウェルは、ナノ流体工学アレイの一サブアレイにロードされる。各小正方形は1部分配列を表す。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> 図2：従来の96ウェルPCRプラットフォームの共同関係の分析：20μLとCT値（39サイクル）における標準的な96ウェルプレートプラットフォームを使用したTaqManリアルタイム定量PCRに5μlの反応ボリューム間の共同関係。私たちは、4種類のマイクロRNAを比較した（のmiR-375、4種類のヒト血清および血漿試料におけるmiR-30C、のmiR-30DとのmiR-7）。他は検出できなかったので、唯一の11のデータ点がプロットされている。 R 2 = 0.92のp = 0.0002。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> 。図3：（ - B A）マイクロ流体アレイカードを使用してmiRNAプロファイリング循環 2マイクロ流体カード（カードAとカード-B）を使用して、754のmiRNAプロファイルが生成される。ここに示されているように、我々は、マイクロ流体カード結果の再現性を確認するために2マイクロ流体アレイを実行するために、同じサンプルを使用した。私たちは、0から19.99の間のCt値と、全体的なmiRNAの同様の発現を観察した（C - D）。繰り返し実行間20から29.99と有意差（ - F E）間のCt値を持つ少数のmiRNA（277の16）があります。 327の八十9より高いCt値を持つマイクロRNA（30〜40）は、両方のラン（ - H G）の間に有意差を示した。 &#160;データは、対応のあるt検定を用いて分析している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> 図4：PCR産物の増幅曲線の代表的なプロフィール：ヒト血漿サンプルのためのすべてのmiRNA標的の組み合わせ（A）の増幅曲線の代表図である。 U6のためのアッセイ（共通制御ncRNAの）は、すべての部分配列に配置されます。 &lt;（0.5（C）は 、高い標準偏差SD）を示している（0.5（B）のサンプルは低い変動SD）を&gt;示していU6内で複製されます。両サンプルを踏太ですヒト血漿から分離され、LのRNA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> 図5：ナノ流体工学配列のQC分析：正しくロードされたナノ流体工学アレイ（左）と間違ってロードされたナノ流体工学アレイ（右）の品質管理（QC）の画像。 （定量PCR試薬混合物中に存在する）受動染料、ROXは、正しくセットされた貫通孔を示すために蛍光を発する。右側のアレイは、貫通孔定量PCR試薬混合物を装填していないと、これらは偽陰性PCR反応として特定されるべきいくつかのサブアレイ/持つ。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 5μlの反応あたり容量（μL） </td></TR&gt; <tr><td> RTバッファー（10倍） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>のdNTP（100 mM）を</td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNaseインヒビター</td><td> 0.6 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 1.39 </td></tr><tr><td>逆転写酵素</td><td> 0.33 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> 表1A：RT試薬混合物の成分のTaqManリアルタイム定量PCRのために、5μlのRT反応の調製における標準的な96ウェルプレートプラットホームを使用する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>コンポーネント</td><td> 5μlの反応あたり容量（μL） </td><td> 20μlの反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>ファストPCRマスターミックス（2×） </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td>のTaqMan定量PCRアッセイ（20X）* </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td>総容積： </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> *テストし、選択したmiRNAに基づいたアッセイ成分。 表1B：標準的な96ウェルプレートプラットホームを用いたTaqManリアルタイム定量PCRのために5または20μlの定量PCR反応の調製における定量PCR試薬混合成分。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>メガプレックスRTプライマー（10倍） </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td>のdTTP（100 mM）を持つのdNTP </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe逆転写酵素（50 U /μL） </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 0.8 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25 mM）の</td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNアーゼ阻害剤＆＃<html> 160。 （20 U /μL） </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> 表2A：本件契約のmiRNAパネルの5μlのRT反応の準備におけるRT試薬混合コンポーネント。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>のTaqMan PreAmpのマスターミックス（2×） </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td>メガプレックスプリアンププライマー（10倍） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 7.5 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> 表2B：本件契約のmiRNAパネル用の25μlのプレamplication反応準備プリアンプ試薬混合コンポーネント。 「CELLSPACING = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>メガプレックスRTプライマー（10倍） </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td>のdTTP（100 mM）を持つのdNTP </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe逆転写酵素（50 U /μL） </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 0.75 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25 mM）の</td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNアーゼ阻害剤（20 U /μL） </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 0.35 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> 表3a：プローブベースのナノ流体工学のmiRNAのパネルの5μlのRT反応の準備におけるRT試薬混合コンポーネント。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネントS </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>のTaqMan PreAmpのマスターミックス（2×） </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td>メガプレックスプリアンププライマー（10倍） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 7.5 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> 表3B：プローブベースのナノ流体工学のmiRNAのパネル用の25μlのプレamplication反応準備プリアンプ試薬混合コンポーネントは、注：3つのプラットフォームのために提供インタラクティブな補助的なExcelスプレッドシートは、すでにペッティング誤差を補償するために5％の追加を占める。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> サンプルA </td><td> リピートサンプル </td></tr><tr><td> 15.535 </td><td> 16.156 </td></tr><tr><td> 15.471 </td><td> 15.652 </td></tr><tr><td> 15。623 </td><td> 16.063 </td></tr><tr><td> 15.963 </td><td> 15.889 </td></tr><tr><td> 14.006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14.502 </td><td> 14.623 </td></tr><tr><td> 14.907 </td><td> 14.384 </td></tr><tr><td> 13.732 </td><td> 14.946 </td></tr></tbody></table> 表4：マイクロ流体アレイカードを使用してのmiRNA U6プロファイリングを循環。 2マイクロ流体アレイカード（AおよびB）を使用して。サンプルAからU6制御miRNAのCtの値（合計= 8）。ランの間で観察一貫したU6制御のmiRNA豊富。

循環マイクロRNAは、最近様々な癌および他の疾患のための有望で新規なバイオマーカーとして浮上している。この記事の目的は、マイクロRNAの循環の豊富さを定量化し、決定するために利用可能である三つの異なるプローブベースのリアルタイムPCRプラットフォームと方法を議論することです。

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

次の実験の全体的な目標は、血漿および血清サンプル中のマイクロRNAの定量に使用される3つの異なるプローブベースのリアルタイムPCR法を実証することです。プローブベースのリアルタイムPCRは、蛍光レポーターとクエンチャーを含む蛍光タグ付きプローブの加水分解と検出によって達成されます。タックポリメラーゼが上流のプライマーから伸びてプローブの5つのプライムエンドに達すると、蛍光エミッターがクエンチャーから物理的に解離します。次に、フルオロ4の単一分子が放出され、検出器によって記録され、その反応による蛍光シグナルの漸進的な増加として示されます。最終的には、蛍光の増加に基づいて生成されたPCR産物の量を測定できるため、増幅された標的増幅を正確に定量することができます。この方法は、さまざまながんや糖尿病などの他の疾患の新しいバイオマーカーを発見するための有望な方法として浮上しています。この方法は、血清や血漿中のマイクロRNAの存在量についての洞察を得ることができますが、末梢細胞や組織などの他のサンプルにも適用できます。ナノ流体アレイスライドのシーリングに関与するステップの一部は、単にプロトコルを読むだけで学ぶのが難しい場合があるため、このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは重要です プローブベースのリアルタイム定量的PCR成熟マイクロRNA検出 4.2マイクロリットルの個々のQPCR試薬は、光学96ウェルプレートの各ウェルに混合します。 続いて、0.8マイクロリットルの適切な新たに調製したCDNA反応溶液を添加します。プレートを適切な光学カバーで密封し、リアルタイムPCRシステムでQPCRを開始します。1〜1000ナノグラムの全RNAを含むマイクロ流体アレイカードを調製するには、最初にプールAおよびBプライマーバッファー、デオキシヌクレオチドリン酸塩、塩化マグネシウム、およびRNA阻害剤を氷上で解凍します。次に、逆転写を行うには、各RNAサンプルの100ナノグラムをプールAまたはプールBチューブに分注し、続いて適切な量のヌクレアーゼ遊離水を加えて、各チューブ内の総量を3マイクロリットルにします。次に、適切な逆転写試薬の4.5マイクロリットルを適切な対応するチューブに混合して分注する。次に、サンプルをサーモサイクラーに入れ、逆転写を開始します。逆転写が進行している間。1ナノグラムから350ナノグラムの全RNAサンプルインプットの場合、サンプルの準備ができたら、氷上で事前に定義されたプレアンププライマーのプールを解凍し、適切なプリアンプ試薬を22.5マイクロリットル分注します。プールAチューブとプールBチューブに混合し、それぞれに2.5マイクロリットルの逆転写CDNAサンプルを加えます。次に、サンプルをサーモサイクラーにロードし、プリアンプサイクルを開始します。サイクルの最後に、75マイクロリットルの0.1 x tris EDTAバッファーを事前に増幅されたCDNAに追加して、マイクロ流体カードをロードします。次に、カードA用の希釈PREPL増幅CDNAの9マイクロリットルに450マイクロリットルのQPCR試薬混合物を加え、プライマープールAを使用して調製したPREPL増幅製品を使用し、441マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて最終容量900マイクロリットルにします。次に、室温に達したら、タックマン低密度アレイカードをパッケージから取り出し、ホイルを下にして清潔な場所に置きます。100マイクロリットルのPCR反応を加えます。カード上の8つの充填ポートのそれぞれに混ぜます。カードを331GSおよび室温で1分間回転させます。次に、ゆっくりと、着実に、1回の均一なストロークで、シーラーの終点に到達するまでキャリッジをカード全体に押し込みます。密封されたアレイカードを取り外し、リザーバーを切り取ります。次に、正しいブロック加熱蓋とサンプルキャリアがマイクロ流体アレイリアルタイムPCRシステムに取り付けられていることを確認します。ナノ流体アレイをロードするには、希釈したprepl、増幅CDNAを解凍し、タックマンリアルタイムQPCR試薬をタックマンします。QPCR試薬ボトルを渦巻かせて混合します。次に、22.5マイクロリットルのQPCR試薬ミックスを22.5マイクロリットルの希釈されたプレプラス増幅CDNAに加えます。次に、各サンプルのプールAとプールBを配置するように注意しながら、ナノ流体アレイワークフロー384ウェルサンプルプレートの8つのウェルに各サンプルの5マイクロリットルを追加します。隣接する8つのウェルブロックで、すべてのサンプルが移されたら、プレートの各セクションをオープンアレイサンプルプレートシーラーで覆います。次に、最初のナノ流体アレイスライドを約15分後に室温まで解凍します。ナノ流体アレイシステムに正しいブロック編集蓋とサンプルキャリアが取り付けられていることを確認し、液浸液シリンジのプランジャーを軽く引っ張って緩めます。キャップを取り外し、先端を所定の位置に置き、先端から空気を洗い流します。次に、ローディングシステムチップをローディングシステム内に配置します。蓋を開けて、サンプルプレートをローディングシステムに入れます。次に、ぴったりとフィットする手袋を着用します。スライドパッケージを慎重に開き、上部に触れずにスライドをパッケージからゆっくりと傾けます。スライドをローディングシステムに配置し、バーコードを左側に置きます。次に、ローディング用のサンプルプレートの部分からシーラーを取り外し、ローディングシステムソフトウェアを使用してスライドバーコードスライド位置、サンプル位置、およびチップ構成を入力します。スライドのロード中に、スライド蓋の底から透明で赤いプラスチックを取り外します。次に、ローディングプロセスの終了から90秒以内にスライドを慎重に取り外して密封します。スライドをプレートclの中に置きますclamp スライドの蓋をスライドに30秒間置き、バーコードが正しく表示されるように蓋が配置されていることを確認します。次に、液浸液シリンジをスライド内に配置して、先端が蓋に押し付けられるようにし、液剤が蓋に沿って流れるように注意しながら、スライドに液浸液をゆっくりと充填します。スライドがいっぱいになったら、プラグで密封し、ハンドルが折れるまでネジを回します。最後に、スライド蓋の上部にあるプラスチックカバーを取り外し、スライドをリアルタイムPCRシステムのスライドキャリアに慎重に配置します。スライドの上部に触れないようにスライドの底を下げているので、スライドの底を支えるように注意してください。次に、PCRシステムを初期化し、サンプルをロードしてから1時間以内に定量PCRプログラムを開始します。この手順を使用すると、5マイクロリットルの反応容量で、強い相関関係を持つ20マイクロリットルの容量で達成された結果と同様の結果が得られます。ここでは最大39サイクル、当たり障りのないAltmanおよび相関プロットは、マイクロ流体アレイカードを使用して同じサンプルでテストされたすべての754マイクロRNに対して示され、ちょうど実証されたマイクロRNAは、両方のトレイルでゼロから19.99の間のCT値を持つ同様の発現も98%の決定係数で同様の発現を示しますさらに、30〜40のCT値が選択されると、試験間で観察された有意差を持つマイクロRNAの数が増加します。このグラフでは、754種類のmicroRNAすべてのナノ流体アレイプラットフォームデータを示しています。増幅曲線を調べて、結果が真の増幅を示していることを確認することが重要です。U sixなどのハウスキーピングマイクロRNAも、ばらつきについて調べる必要があります。たとえば、このグラフでは、低い標準偏差を示す U 6 回の反復の典型的なクラスタリングが示されており、データの信頼性を示しています。最後に、これらのデータは、2 番目のサンプルでの U 6 回の反復の変動性の増加を示しています。マイクロフルイディクスやナナフルイディクスアレイなどのハイスループットプローブベースのテクノロジーは、多数のサンプル中の複数のマイクロRNAを非常に短時間で再現性よく効率的に検出することを容易にします。各ワークフローは、microRNAターゲットの数と分析するサンプルの数に基づいて、異なるスループットに対応するように設計されています。このビデオを見れば、マイクロNAの存在量をメジャーにするためのさまざまなプローブベースのリアルタイムPCR技術をどのように行うかを十分に理解できるはずです。

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、事前にマイクロRNAの設定と分析サーモ科学マトリックスマルチチャンネルピペットで手でだけでなく、ロボットを使用してQPCR用96穴の配列のデモンストレーションを行います。...

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。...

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。...

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

色素ベースの化学および液滴デジタルPCR技術を使用した無細胞マイクロRNA定量のための高感度で正確な方法が説明されています。...

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

このレポートでは、中古増幅の有無、定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコル プラズマ miRNAs...

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

ここでは、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ベースのプロトコルが、リポタンパク質粒子の天然マイクロ RNA 含量 (絶対/相対) の決定のために提示される。加えて、マイクロ RNA...

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。...

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶプローブベースのリアルタイムPCR法による血漿・血清中マイクロRNAの定量測定手法。蛍光プローブを用いた高感度検出で、がんや糖尿病などの疾患バイオマーカー発見に応用可能です。

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

さらに動画を探す