プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ
2015年4月14日
循環マイクロRNAは、最近様々な癌および他の疾患のための有望で新規なバイオマーカーとして浮上している。この記事の目的は、マイクロRNAの循環の豊富さを定量化し、決定するために利用可能である三つの異なるプローブベースのリアルタイムPCRプラットフォームと方法を議論することです。
次の実験の全体的な目標は、血漿および血清サンプル中のマイクロRNAの定量に使用される3つの異なるプローブベースのリアルタイムPCR法を実証することです。プローブベースのリアルタイムPCRは、蛍光レポーターとクエンチャーを含む蛍光タグ付きプローブの加水分解と検出によって達成されます。タックポリメラーゼが上流のプライマーから伸びてプローブの5つのプライムエンドに達すると、蛍光エミッターがクエンチャーから物理的に解離します。
次に、フルオロ4の単一分子が放出され、検出器によって記録され、その反応による蛍光シグナルの漸進的な増加として示されます。最終的には、蛍光の増加に基づいて生成されたPCR産物の量を測定できるため、増幅された標的増幅を正確に定量することができます。この方法は、さまざまながんや糖尿病などの他の疾患の新しいバイオマーカーを発見するための有望な方法として浮上しています。
この方法は、血清や血漿中のマイクロRNAの存在量についての洞察を得ることができますが、末梢細胞や組織などの他のサンプルにも適用できます。ナノ流体アレイスライドのシーリングに関与するステップの一部は、単にプロトコルを読むだけで学ぶのが難しい場合があるため、このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは重要です プローブベースのリアルタイム定量的PCR成熟マイクロRNA検出 4.2マイクロリットルの個々のQPCR試薬は、光学96ウェルプレートの各ウェルに混合します。 続いて、0.8マイクロリットルの適切な新たに調製したCDNA反応溶液を添加します。プレートを適切な光学カバーで密封し、リアルタイムPCRシステムでQPCRを開始します。
1〜1000ナノグラムの全RNAを含むマイクロ流体アレイカードを調製するには、最初にプールAおよびBプライマーバッファー、デオキシヌクレオチドリン酸塩、塩化マグネシウム、およびRNA阻害剤を氷上で解凍します。次に、逆転写を行うには、各RNAサンプルの100ナノグラムをプールAまたはプールBチューブに分注し、続いて適切な量のヌクレアーゼ遊離水を加えて、各チューブ内の総量を3マイクロリットルにします。次に、適切な逆転写試薬の4.5マイクロリットルを適切な対応するチューブに混合して分注する。
次に、サンプルをサーモサイクラーに入れ、逆転写を開始します。逆転写が進行している間。1ナノグラムから350ナノグラムの全RNAサンプルインプットの場合、サンプルの準備ができたら、氷上で事前に定義されたプレアンププライマーのプールを解凍し、適切なプリアンプ試薬を22.5マイクロリットル分注します。
プールAチューブとプールBチューブに混合し、それぞれに2.5マイクロリットルの逆転写CDNAサンプルを加えます。次に、サンプルをサーモサイクラーにロードし、プリアンプサイクルを開始します。サイクルの最後に、75マイクロリットルの0.1 x tris EDTAバッファーを事前に増幅されたCDNAに追加して、マイクロ流体カードをロードします。
次に、カードA用の希釈PREPL増幅CDNAの9マイクロリットルに450マイクロリットルのQPCR試薬混合物を加え、プライマープールAを使用して調製したPREPL増幅製品を使用し、441マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて最終容量900マイクロリットルにします。次に、室温に達したら、タックマン低密度アレイカードをパッケージから取り出し、ホイルを下にして清潔な場所に置きます。100マイクロリットルのPCR反応を加えます。
カード上の8つの充填ポートのそれぞれに混ぜます。カードを331GSおよび室温で1分間回転させます。次に、ゆっくりと、着実に、1回の均一なストロークで、シーラーの終点に到達するまでキャリッジをカード全体に押し込みます。
密封されたアレイカードを取り外し、リザーバーを切り取ります。次に、正しいブロック加熱蓋とサンプルキャリアがマイクロ流体アレイリアルタイムPCRシステムに取り付けられていることを確認します。ナノ流体アレイをロードするには、希釈したprepl、増幅CDNAを解凍し、タックマンリアルタイムQPCR試薬をタックマンします。
QPCR試薬ボトルを渦巻かせて混合します。次に、22.5マイクロリットルのQPCR試薬ミックスを22.5マイクロリットルの希釈されたプレプラス増幅CDNAに加えます。次に、各サンプルのプールAとプールBを配置するように注意しながら、ナノ流体アレイワークフロー384ウェルサンプルプレートの8つのウェルに各サンプルの5マイクロリットルを追加します。
隣接する8つのウェルブロックで、すべてのサンプルが移されたら、プレートの各セクションをオープンアレイサンプルプレートシーラーで覆います。次に、最初のナノ流体アレイスライドを約15分後に室温まで解凍します。ナノ流体アレイシステムに正しいブロック編集蓋とサンプルキャリアが取り付けられていることを確認し、液浸液シリンジのプランジャーを軽く引っ張って緩めます。
キャップを取り外し、先端を所定の位置に置き、先端から空気を洗い流します。次に、ローディングシステムチップをローディングシステム内に配置します。蓋を開けて、サンプルプレートをローディングシステムに入れます。
次に、ぴったりとフィットする手袋を着用します。スライドパッケージを慎重に開き、上部に触れずにスライドをパッケージからゆっくりと傾けます。スライドをローディングシステムに配置し、バーコードを左側に置きます。
次に、ローディング用のサンプルプレートの部分からシーラーを取り外し、ローディングシステムソフトウェアを使用してスライドバーコードスライド位置、サンプル位置、およびチップ構成を入力します。スライドのロード中に、スライド蓋の底から透明で赤いプラスチックを取り外します。次に、ローディングプロセスの終了から90秒以内にスライドを慎重に取り外して密封します。
スライドをプレートclの中に置きますclamp スライドの蓋をスライドに30秒間置き、バーコードが正しく表示されるように蓋が配置されていることを確認します。次に、液浸液シリンジをスライド内に配置して、先端が蓋に押し付けられるようにし、液剤が蓋に沿って流れるように注意しながら、スライドに液浸液をゆっくりと充填します。スライドがいっぱいになったら、プラグで密封し、ハンドルが折れるまでネジを回します。
最後に、スライド蓋の上部にあるプラスチックカバーを取り外し、スライドをリアルタイムPCRシステムのスライドキャリアに慎重に配置します。スライドの上部に触れないようにスライドの底を下げているので、スライドの底を支えるように注意してください。次に、PCRシステムを初期化し、サンプルをロードしてから1時間以内に定量PCRプログラムを開始します。
この手順を使用すると、5マイクロリットルの反応容量で、強い相関関係を持つ20マイクロリットルの容量で達成された結果と同様の結果が得られます。ここでは最大39サイクル、当たり障りのないAltmanおよび相関プロットは、マイクロ流体アレイカードを使用して同じサンプルでテストされたすべての754マイクロRNに対して示され、ちょうど実証されたマイクロRNAは、両方のトレイルでゼロから19.99の間のCT値を持つ同様の発現も98%の決定係数で同様の発現を示しますさらに、30〜40のCT値が選択されると、試験間で観察された有意差を持つマイクロRNAの数が増加します。このグラフでは、754種類のmicroRNAすべてのナノ流体アレイプラットフォームデータを示しています。
増幅曲線を調べて、結果が真の増幅を示していることを確認することが重要です。U sixなどのハウスキーピングマイクロRNAも、ばらつきについて調べる必要があります。たとえば、このグラフでは、低い標準偏差を示す U 6 回の反復の典型的なクラスタリングが示されており、データの信頼性を示しています。
最後に、これらのデータは、2 番目のサンプルでの U 6 回の反復の変動性の増加を示しています。マイクロフルイディクスやナナフルイディクスアレイなどのハイスループットプローブベースのテクノロジーは、多数のサンプル中の複数のマイクロRNAを非常に短時間で再現性よく効率的に検出することを容易にします。各ワークフローは、microRNAターゲットの数と分析するサンプルの数に基づいて、異なるスループットに対応するように設計されています。
このビデオを見れば、マイクロNAの存在量をメジャーにするためのさまざまなプローブベースのリアルタイムPCR技術をどのように行うかを十分に理解できるはずです。
概要
本記事では、血漿および血清サンプル中の循環microRNAを定量するための、プローブを用いたリアルタイムPCR法の使用について解説します。これらの手法は、がんや糖尿病を含むさまざまな疾患の新規バイオマーカーを同定するための有用なツールとして注目されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- バイオマーカー
- リアルタイムPCR
- microRNA定量
背景
- 血中microRNAは、疾患の潜在的なバイオマーカーとなります。
- リアルタイムPCRは、核酸を定量するために広く用いられている手法です。
- プローブを用いた手法により、PCRの特異性と感度が向上します。
- microRNAの存在量を把握することは、疾患の診断やモニタリングに寄与します。
研究目的
- プローブを用いた3種類の異なるリアルタイムPCR法を実演すること。
- 血漿および血清サンプル中のmicroRNAを定量すること。
- プロトコルの視覚的なデモンストレーションを提供し、理解を深めること。
使用された手法
- 蛍光標識プローブの加水分解および検出。
- PCR反応用光学96ウェルプレートの使用。
- サンプルロード用マイクロ流路アレイカードの調製。
- RNAサンプルの逆転写およびプレアンプリフィケーション。
主要な結果
- さまざまなサンプルタイプにおけるmicroRNAの定量への成功。
- プローブベースのPCR法の効率性の実証。
- 血清および血漿中のmicroRNA量に関する知見。
- 視覚的なデモンストレーションによるプロトコル手順の明確化。
結論
- プローブを用いたリアルタイムPCRは、バイオマーカー探索のための有望な手法です。
- microRNAの定量により、疾患状態に関する貴重な知見を得ることができます。
- 視覚的な補助資料は、複雑な実験プロトコルの理解を深めます。
よくある質問
産業上の重要性
プローブを用いたリアルタイムPCRにより、血中microRNAの高感度かつ再現性のある定量が可能となり、腫瘍学および代謝性疾患におけるバイオマーカーの探索が促進されます。この手法は、増幅に基づく定量的なリードアウトを提供するため、初期探索段階におけるターゲットの検証やメカニズムのリスク低減に寄与します。マイクロフルイディクスやナノフルイディクスアレイなどのハイスループットプラットフォームは、大規模なサンプルセットにおいてアッセイの再現性を維持しつつ、スクリーニング能力を向上させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：疾患関連の生体試料中のmicroRNA量を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：想定ターゲットの生物学的リスク低減を裏付ける、再現性のある測定値を提供する。
- 予測的価値：バイオマーカーの発現パターンに基づいたポートフォリオの選別に有用な定量データを生成する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：増幅ベースの読み出しを実現し、microRNAターゲットに対する化合物またはモジュレーターの信頼性の高いスクリーニングを可能にする。
- 運用的価値：96ウェル、マイクロ流体、およびナノ流体プラットフォームにわたるワークフローを標準化し、拡張可能なアッセイ展開を実現する。
- 技術的価値：アッセイ間の比較およびデータの正規化を可能にするサイクル閾値（CT）値を算出する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 前臨床モデルおよびヒト検体におけるmicroRNAレベルを測定することにより、トランスレーショナルな連続性を支援する。
- 運用の価値： 疾患進行研究におけるバイオマーカーダイナミクスの縦断的なモニタリングを可能にする。
- リスク軽減： テクニカルリプリケート間での再現性のある定量化により、標的選択における偽陽性を減少させる。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの仮説検証からリード化合物の同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合し、go/no-go判断の根拠となる定量的なバイオマーカーデータを提供します。また、疾患モデル間で適用可能な標準化されたmicroRNA発現プロファイルを生成することで、スクリーニングへの移行を可能にします。本アッセイの出力データは、正規化された蛍光定量を用いることで、解析に基づいた実験条件間の比較を支援します。
- 探索生物学： 摂動に対するmicroRNA発現変化を精密に測定することで、仮説検証を促進します。
- スクリーニング： ハイコンテントスクリーニングに適合する、定量的な増幅依存性シグナルを提供します。
- 分析： 統計的比較と再現性評価を可能にするCT値および増幅曲線を出力します。
- トランスレーショナルリサーチ： 様々なサンプルタイプにわたる一貫したmicroRNA測定を通じて、探索フェーズの知見を前臨床検証へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 複数のmicroRNAパネルやサンプルコホートに適用可能な、再利用可能な定量化プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 低発現転写物の感度高く特異的な検出により、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用の価値： プローブベースの化学反応と規定のサーマルサイクリングパラメータにより、施設間での再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値： 少量の試薬量で数百種類のmicroRNAの並列試験を可能にし、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 適応症選択のための定量的なバイオマーカーデータを提供することで、リスク調整後の開発推進決定を支援します。
実施上の検討事項
- 核酸抽出、逆転写、およびqPCRの最適化に関する専門知識が必要です。
- 96ウェル、マイクロフルイディクス、およびナノフルイディクス形式に対応したリアルタイムPCRシステムへのアクセスに依存します。
- 生体試料における分析前変動を最小限に抑えるため、標準化された試料調製プロトコルが必要です。
- コンタミネーションを防ぎ、適切な密封を確実にするために、マイクロフルイディクスおよびナノフルイディクスチップの慎重な取り扱いが必要です。
- 正規化の適合性と技術的再現性を評価するため、ハウスキーピングmicroRNA（例：U6）のベースライン特性評価が求められます。
