イメージングカルシウム 2+ダイナミクス
May 6th, 2015
我々は、マウス網膜のex vivoでのスライス標本を用いて、錐体光受容体の軸索末端におけるCa 2+動態を監視するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、重要な哺乳動物モデル系におけるコーンのCa 2+シグナル伝達の包括的研究、マウスを許可します。
この手順の全体的な目標は、蛍光バイオセンサーを使用して、マウス網膜のコーン光受容体から誘発される光刺激誘発カルシウムシグナルを記録することです。これは、遺伝子にコードされたカルシウムセンサーをコーン光受容体のみに発現するトランスジェニックマウス系統から網膜を単離することによって達成されます。2番目のステップは、網膜組織の垂直スライスを切断することです。
次に、網膜スライスをカバースリップに取り付け、2光子顕微鏡下に置きます。最後のステップは、光刺激に応答して、コーン光受容体の個々のシナプス終末からのカルシウムシグナルを記録することです。最終的に、記録されたカルシウムシグナルはオフラインで分析されます。
この方法により、多くのトウモロコシ食品受容体の活性を細胞内分解能で同時に記録することができます。これは、電気的シングルセル記録などの既存の技術に比べて、より困難で時間がかかる主な利点です。ですから、私たちが取り上げたいのは、カルシウムが光受容体の変性に関与しているかどうか、そしてどのように関与しているのかということです。
この方法により、カルシウムの流入が光受容体の変性を引き起こしているのか、それとも細胞が死にかけているという事実の結果なのかを判断できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、主に網膜の光に敏感な毎週を保存する必要があるため、網膜、解剖、スライスイオンを含むすべての繊細なステップを緑色の赤色光の下で実行する必要があるため、苦労します。この手順を開始するには、マウスの眼球を、新たに炭水化物を酸素化した細胞外溶液を含むシャーレに移します。
角膜と強膜の間の境界に沿った任意の点で眼球を鋭い注射針で突き刺します。次に、一対の鉗子で強膜に目を留め、1つのはさみの刃を穴にそっと挿入します。オーラセラータに沿ってカットして、目の前部をアイカップから分離します。
その後、アイカップをペンマークの位置で放射状にカットして、網膜の背側位置を示します。次に、背側の切り口が離れるようにアイカップを配置します。網膜と強膜の間に鉗子の先端を挿入して、アイカップの左側と右側の強膜をつかみます。
その後、iicaの強膜部分を静かに反転させて網膜を剥離します。最後に、視神経を切断して網膜を強膜から解放します。一対の鉗子で網膜の端を保持し、2番目の鉗子のペアを使用して網膜表面から破片と硝子体をそっと取り除きます。
網膜表面がきれいなら、さらに3つの短い放射状カットを行います。次に、スライドガラスを組織に近い細胞外溶液にゆっくりと浸します。神経節細胞の面を上にして、網膜をスライドガラスにそっと引っ張り、端をつかんで、組織の機械的損傷と折り畳みを減らします。
次に、湾曲したメスの刃を使用して、選択した網膜領域から約1×2ミリメートルの長方形を切り取り、組織の周りの余分な溶液を拭き取ります。次に、事前に準備したニトロセルロース繊維膜を網膜の上に置き、神経節細胞側が膜に付着するようにします。すぐに細胞外培地を膜に一滴加えて、組織をメンブレンにしっかりと付着させます。
メンブレンマウントされた網膜組織を、新鮮な細胞外溶液を含むスライスチャンバーに移します。次に、網膜を厚さ200マイクロメートルの垂直スライスに切断します。ティッシュチョッパー接着剤を使用して、高真空グリースで事前に準備されたガラスカバースリップにシングルメンブレンマウントスライス
。ガラス面を網膜の下に置き、グリースが付着しないようにしてください。その後、室温で保持チャンバー内の各カバースリップマウントスライスに細胞外溶液を一滴加えます。小さな貯水池を泡立ててカルボゲンをチャンバーに導入し、保持チャンバー内の雰囲気を保ちます。加湿。
スライスを10〜15分間保持チャンバーで休ませてから、1つずつ記録チャンバーに移します。保持チャンバーから記録チャンバーにスライスを移し、すぐに炭酸細胞外溶液で灌流を開始します。毎分2ミリリットルの灌流流量と摂氏37度の温度を維持します。
録音室内。20 x 0.95 NAの水浸対物レンズとCCDカメラを、記録チャンバーの下の赤外線LEDと組み合わせて使用します。網膜スライスを見つけるには、製造元の指示に従って2光子イメージングシステムを起動します。
次に、レーザーをオンにして、860ナノメートルに設定します。ECFPとシトリンの蛍光イメージング用の2つの検出チャンネルをオンにします。次に、画像取得ソフトウェアを使用して、2つの光子顕微鏡を制御してスキャンし、記録用のコーン端子の列を選択して、画像取得を128 x 16ピクセルの画像または同様の構成に設定し、スキャン領域をコーン端子に制限して、外側のセグメントでの写真顔料の漂白を防ぎます。
レーザーをオンにします。光刺激を提示したり、薬理学的薬剤を適用したりする前に、コーンが走査型レーザーと刺激背景光に20〜30秒間適応するのを待ちます。次に、任意の刺激のプレゼンテーションを開始します。
刺激は、カスタマイズされたソフトウェアによって制御されるマイクロプロセッサボードを使用して、2つのLEDの強度を経時的に変調することによって生成されます。次に、それぞれの画像取得ソフトウェアを使用して、2つの蛍光チャンネルの同時記録を開始します。記録は、網膜切片の錐体光受容体のシナプス終末に焦点を当てました。
これは、7 つの個別のターミナルを持つ記録された領域の例です。蛍光は、フレセプターシトリン用とフレットドナー用の2つのチャンネルを使用して記録しました。ECFPです。表示。これは、単一の関心領域で記録されたシトリンとECFP蛍光の変化を誘発する光です。
そして、これは、5秒間隔で一連の1秒間の明るい光の点滅に対するコーン端末のカルシウム応答です。この図は、光誘発コーンカルシウム応答の例示的な定量分析を示しています。そして、これが単一のコーンターミナルからの光誘発カルシウム応答です。
この図は、平均カルシウム反応の決定を示しています。安静時カルシウムレベルは光刺激前のベースラインを表し、応答サイズは ra であり、これは安静時カルシウムレベルとピーク振幅の間、および応答開始とオフセットの速度論の間の領域です。この手順は、さらに拡張できます。
例えば、光受容体カルシウムシグナルは、適応のような研究や光伝達のさまざまなステップを詳細に研究するために、多様な薬理学的および大規模な刺激条件下で主要なものとなり得ます。この技術により、正常な生理学的条件下でのコーン光受容体のカルシウム動態を調査することができます。そして、これは、アクロトピアや網膜色素変性症などのヒト失明性疾患における一次および二次錐体光受容体変性を理解するために特に重要です。
概要
この記事では、マウスの網膜のex-vivoスライスを使用して、コーン光受容体の軸索末端におけるCa2+ダイナミクスをモニタリングするためのプロトコルについて説明します。この方法により、哺乳類モデルシステムにおいてコーンCa2+シグナリングの包括的な研究が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 光受容体機能
背景
- カルシウムシグナリングは光受容体の機能に不可欠です。
- Ca2+ダイナミクスの理解は光受容体の変性を解明する手がかりとなります。
- これらのダイナミクスを研究するための既存の技術は複雑で時間がかかることが多いです。
- このプロトコルは、高解像度のデータを提供しながら、プロセスを簡素化することを目的としています。
研究の目的
- コーン光受容体からの光誘発カルシウムシグナルを記録すること。
- 光受容体の変性におけるカルシウムの役割を調査すること。
- サブセルラー分解能で複数のコーン末端からの同時記録を可能にすること。
使用された方法
- 遺伝子的に符号化されたカルシウムセンサーを発現するトランスジェニックマウスからの網膜の分離。
- 網膜組織の垂直スライスの準備。
- カルシウムシグナルのイメージングのための2光子マイクロスコピー。
- 光刺激に対するカルシウム応答の分析。
主要な結果
- コーン光受容体におけるカルシウムダイナミクスの成功的な記録。
- 様々な光刺激に対するカルシウム応答を分析する能力の実証。
- カルシウムの流入と光受容体の健康状態の関係についての洞察の提供。
- 従来の技術に対するこの方法の利点の強調。
結論
- このプロトコルは、コーン光受容体のCa2+ダイナミクスを研究するための信頼できる方法を提供します。
- 光受容体の変性におけるカルシウムの役割の探索を促進します。
- この方法は網膜シグナリングメカニズムの理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals addresses a critical gap in understanding the mechanistic basis of retinal degeneration. This protocol enables high-resolution, multiplexed measurement of stimulus-evoked Ca2+ responses, supporting predictive confidence in target validation for neurodegenerative disease research. The approach is positioned to inform early discovery and translational strategies for vision restoration portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of Ca2+-dependent signaling pathways implicated in photoreceptor degeneration.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing between causative and consequential Ca2+ influx in disease models.
- Facilitates functional target validation in genetically engineered mouse lines relevant to human retinal disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated ex vivo system for quantitative, reproducible Ca2+ readouts in cone terminals.
- Enables assay standardization and scalability for compound or genetic modifier screening.
- Delivers subcellular resolution data to support reliable evaluation of candidate interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying primary and secondary cone degeneration mechanisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-breeding with degeneration models.
- Offers predictive value for translational biomarker development in retinal disease pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational research in retinal disease.
- Discovery Biology: Quantifies stimulus-evoked Ca2+ changes to clarify photoreceptor signaling pathways and degeneration triggers.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative endpoints for evaluating pharmacological or genetic interventions.
- Analytics: Provides absolute and relative Ca2+ concentration measurements for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Enables alignment with disease models and supports biomarker strategy development.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse mouse models and experimental conditions for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of retinal degeneration.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows for cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in vision restoration programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and interventions in neurodegeneration pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, two-photon microscopy, and genetically encoded biosensor handling.
- Demands specialized imaging instrumentation and fluorescence analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mouse models, but sensitive to tissue handling and light exposure conditions.
- Dependent on availability of transgenic lines and calibration protocols for absolute Ca2+ quantification.
