イメージングカルシウム

本手順の総合的な目的は、蛍光バイオセンサーを用いて、マウス網膜の錐体光受容器から光刺激誘発性カルシウム信号を記録することである。これは、錐体光受容器にのみ遺伝子符号化カルシウムセンサーを発現する遺伝子組み換えマウス系統から網膜を単離することで達成される。次のステップとして、網膜組織の垂直切片を作成する。

次に、網膜切片をカバーガラスに固定し、2光子顕微鏡下に設置します。最後のステップは、光刺激に応答する錐体光受容体の個々のシナプス末端からカルシウム信号を記録することです。最終的に、記録されたカルシウム信号をオフラインで解析します。

この手法を用いることで、多くのトウモロコシの光受容体活性を、サブセルラー分解能で同時に記録することが可能です。これは、より困難で時間を要する電気的な単一細胞記録などの既存技術に対する主な利点です。したがって、我々が解決したい課題は、光受容体の変性にカルシウムが関与しているか、またどのように関与しているかということです。

この手法により、カルシウム流入が光受容体変性を促進しているのか、あるいは細胞死の結果として生じているのかを判断することが可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、網膜の光感受性を維持する必要があるため、網膜の摘出やスライス作成を含むすべての繊細な工程を緑色または赤色光の下で行わなければならない点に最も苦労します。この手順を開始するには、マウスの眼球を、新鮮なカルボゲン飽和細胞外液を含むペトリ皿に移してください。

鋭い注射針を用いて、角膜と強膜の境界線上の任意の点を刺します。次に、ピンセットで強膜側から眼球を固定し、ハサミの片方の刃を慎重に穴に挿入します。鋸状縁に沿って切断し、眼球の前部を眼杯から切り離します。

その後、網膜の背側を示すペンマークの位置で、アイカップを放射状に切開します。次に、背側の切開面が外側を向くようにアイカップを配置します。ピンセットの先を網膜と強膜の間に挿入し、アイカップの左側と右側の強膜を掴みます。

その後、iicaの強膜部分をそっと反転させて、網膜を剥離します。最後に、視神経を切断して、網膜を強膜から切り離します。ピンセットで網膜の端を保持し、別のピンセットを用いて網膜表面から残渣と硝子体をそっと取り除きます。

網膜表面が清潔であることを確認し、さらに3本の短い放射状の切開を加えます。次に、組織の近くにある細胞外液中に、ガラススライドをゆっくりと浸します。機械的な損傷や組織の折り畳みを軽減するため、端を掴み、神経節細胞側を上にして網膜をゆっくりとガラススライド上に引き上げます。

次に、湾曲したメスを用いて、選択した網膜領域から約1×2 mmの長方形を切り出し、組織周囲の余分な溶液を拭き取ります。その後、あらかじめ準備したニトロセルロースファイバーメンブレンを網膜片の上に載せ、神経節細胞側がメンブレンに密着するようにします。直ちにメンブレン上に細胞外液を1滴滴下し、組織をメンブレンにしっかりと固定させます。

膜に固定した網膜組織を、新鮮な細胞外液を含むスライスチャンバーに移します。次に、網膜を厚さ200 µmの垂直スライスに切断します。組織チョッパーを使用し、膜に固定された1枚のスライスを、高真空グリースで事前に準備したガラスカバースリップに接着させます。

網膜の下にあるガラス表面を清潔に保ち、油脂が付着していない状態にします。その後、室温の保持チャンバーに装着された各カバーガラス上のスライスに、細胞外液を1滴加えます。少量の水リザーバーをバブリングさせてカーボゲンをチャンバー内に導入し、保持チャンバー内の雰囲気を加湿状態に保ちます。

スライスを保持チャンバー内で10〜15分間静置した後、1枚ずつ記録チャンバーへ移します。保持チャンバーから記録チャンバーへスライスを移し、直ちに炭酸ガス飽和細胞外液での還流を開始します。還流速度は2 mL/min、温度は37 °Cに維持してください。

記録チャンバー内において。20倍・0.95 NAの水浸対物レンズとCCDカメラを、記録チャンバー下方の赤外線LEDと組み合わせて使用します。網膜スライスを特定するために、製造元の指示に従って2光子イメージングシステムを起動してください。

次に、レーザーをオンにし、波長を860 nanometersに設定します。ECFPおよびcitrineの蛍光イメージング用として、2つの検出チャンネルをオンにします。次に、画像取得ソフトウェアを用いて二光子顕微鏡を操作し、記録対象となる錐体終末の列をスキャンして選択します。画像取得の設定を128×16ピクセルまたはそれに準ずる構成にし、外節の光受容色素の退色を防ぐため、スキャン領域を錐体終末に限定してください。

レーザーをオンにします。光刺激の提示または薬理剤の投与を行う前に、20〜30秒間、錐体細胞をスキャンレーザーと刺激背景光に順応させます。その後、任意の刺激の提示を開始します。

刺激は、カスタムソフトウェアで制御されるマイクロプロセッサボードを用いて、2つのLEDの強度を時間的に変調させることで生成します。次に、それぞれの画像取得ソフトウェアを使用して、2つの蛍光チャンネルを同時に記録し始めます。記録は、網膜切片における錐体光受容細胞のシナプス末端に焦点を当てて行いました。

これは、7つの個別の端子を持つ記録領域の例です。蛍光は2つのチャンネルを使用して記録されました。1つはfre scepter citrine用、もう1つはfretドナーであるECFP用です。ここに、単一の関心領域で記録された、光誘発によるcitrineおよびECFP蛍光の変化を示します。

ここでは、5秒間隔で1秒間の強光フラッシュを連続的に与えた際の、錐体終末のカルシウム応答を示します。この図は、光誘発錐体カルシウム応答の代表的な定量分析を示しています。そして、ここでは単一の錐体終末からの光誘発カルシウム応答を示します。

この図は平均カルシウム応答の決定を示しています。静止カルシウムレベルは光刺激前のベースラインを表し、応答サイズはraであり、これは静止カルシウムレベルとピーク振幅の間、および応答の立ち上がりと立ち下がりのキネティクスの間の面積です。この手順はさらに拡張することが可能です。

例えば、適応の調査や光変換のさまざまな段階の詳細な研究など、多様な薬理学的条件や強力な刺激条件下では、光受容体カルシウム信号が主役となることがあります。本手法を用いることで、正常な生理学的条件下における錐体光受容体のカルシウムダイナミクスを調査することが可能です。これは、アクロトピアや網膜色素変性症などの、失明に至るヒトの疾患における一次性および二次性の錐体光受容体変性を理解する上で特に重要です。