の可視化

本実験の全体的な目的は、感染マウスの心臓内において、ESMOによる心臓微小病変形成の再現可能なプロトコルを実証することです。これは、マウスにESMOを感染させ、菌血症の発症を促すことで達成されます。これにより、細菌が心血管系へ到達し、心筋に侵入して微小病変を形成することが可能になります。その後、心臓はパラフィン埋込を行い従来の方法で染色するか、あるいはOCTコンパウンドに固定して免疫蛍光染色に供します。

染色した切片を評価することで、心筋全体にランダムに分布する心臓の微小病変、コラーゲン沈着、回復期の心筋切片、および心臓微小病変内の肺炎球菌カプセルを確認することができます。手順を実演しているのは、私の研究室の大学院生であるArmand Brownです。この手法により、マウスにおける侵襲性肺炎球菌感染症中のS. pneumoniaによる心臓への損傷効果についての知見を得ることができます。

本手法は、非ヒト霊長類やヒトなどの他の系の心臓サンプルにも適用可能です。まず、ESMO Serotype four strain Tiger fourをTodd Hewitt brothで培養し、620 nmでの光学密度（OD）を0.5まで上昇させます。適切な密度に達したら、培養液を3,500 Gで10分間遠心分離してペレット化します。

次に、吸引ラインを用いて上清を除去し、滅菌PBSを用いて細菌を1 mLあたり10,000個のコロニー形成単位に再懸濁します。次に、10〜12週齢のvalve Cマウスを麻酔し、鈍端ピンセットで足指を軽くつまんで麻酔状態にあることを確認します。細菌懸濁液をシリンジに充填し、27〜30ゲージの針を取り付けます。片手で麻酔状態のマウスの項皮を保持しながら、もう一方の手で懸濁液100 µLを腹腔内投与し、各マウスをケージに戻します。

マウスは通常、注入後30～40秒で覚醒します。S. pneumoniaeの投与量を正確に調整することが極めて重要です。さもなければ、マウスが感染から回復するか、あるいは病変が形成される前に急激に侵襲性肺炎球菌疾患に進行する可能性があります。細菌株によって毒性のレベルが異なるため、適切な投与量を特定するには試行錯誤が必要な場合があります。

感染を少なくとも24時間進行させて初期段階にするか、あるいは30時間進行させて高度感染段階にします。その後、各感染マウスを安楽死させます。まず、尾をアルコール綿で消毒し、2〜3 mmの部位を切断して血液サンプルを採取します。

耳切断部位から2 µLの血液を採取します。1 U/mLのナトリウムヘパリンを含むPBSを用いて、血液を10倍段階希釈します。5段階の希釈液をトリプチコン大豆血液寒天培地に塗布し、一晩インキュベートします。

翌日にコロニー数を計測します。次節に記載する方法に従って心臓を採取してください。あるいは、感染から30時間後に実施します。

生理食塩水100 µLに溶解したアンピシリンを腹腔内投与し、マウスの救済を試みます。36時間にわたり12時間ごとにアンピシリンの投与を継続し、目的のタイムポイントで心臓を採取します。まず、心臓を摘出してください。

安楽死させたマウスを手術台の上に仰向けに固定し、胸部を70% ethanolでスプレーして拭き取ります。外科用はさみとピンセットを用いて胸腔を開きます。肋骨を取り除き、横隔膜を切断して心臓と肺を露出させます。

次に、心臓に接続している血管を切断し、ピンセットを用いて心臓を挫傷させないように慎重に摘出します。心臓をPBSで洗浄し、冠状断切片作成のために組織標本回収カセットに入れます。その後、カセットを10%緩衝ホルマリン溶液に移し、翌日にパラフィン包埋に回します。

初期段階では、心臓病変は色の変化や、場合によっては免疫細胞の存在によって識別できます。進行した病変では、免疫細胞は消失し、巨大化します。その代わりにVA様病変が認められます。

正電荷ガラススライド上の5 µm厚の心臓切片を用い、まず切片を凍結させ、次に融解させて自然乾燥させます。25 °Cで10分間、10%中性緩衝ホルマリンでスライドを固定します。その後、PBSで5分間ずつ3回洗浄し、固定液を除去します。

続いて、0.2% Triton X-100含有PBSを用いて組織を15分間透過処理します。PBSでさらに3回洗浄し、界面活性剤を除去します。その後、PBSで洗浄し、10%コート血清含有PBSを用いて組織を1時間ブロッキングします。最後に、抗血清を滴下し、37 °Cで2時間反応させます。

陰性コントロールには、未処理のウサギ抗血清を使用します。心臓組織はXI免疫蛍光染色を吸収しやすく、バックグラウンドが高くなるため、抗体の種類に応じて、インキュベーション時の濃度と時間を最適化する必要があります。2時間後、PBSで抗血清を洗い流します。次に、溶液を二次抗体に交換し、スライドを37 °Cで30分間インキュベートします。続いて、5 mg/mLのDPIを塗布し、スライドをPBSで洗浄します。

最後に、スライドを封入し、保存して共焦点顕微鏡で撮像します。まず、パラフィンを除去し、組織切片を親水化します。キシレンで洗浄した後、段階的なアルコール系列で洗浄します。

次に、切片を0.2%リン酸に5分間浸し、続いて5分間の水洗いの後、0.1%シリウスレッドとピコリン酸で2時間染色します。その後、切片を0.01 N塩酸で3分間洗浄し、70%エタノールで1分間すすぎます。次に、段階的なアルコール系列を逆順に辿って切片を脱水し、キシレンで洗浄した後、光学顕微鏡を用いてスライドを封入し、評価します。

Tiger 4株によるチャレンジ後、マウスに侵襲性肺炎球菌感染症が発症した。心室に心臓の微小病変が観察され、感染後24時間から30時間にかけて病変のサイズと数が増加した。病変内に実際にS. pneumoniaeが存在することを確認するため、Tiger 4によって産生されるセロタイプ4のカプセル多糖体を用いて切片を染色した。

これにより、マイクロ病変部位に密に詰まった高密度の凝集塊が存在することが確認されました。アンピシリンで救済したマウスおよび非感染コントロールの心臓切片に対して、ピクロ酸シリウスレッド染色を行いました。救済群において。

かつての病変部位と思われる脳室からバンド状の染まりが広がっており、染色の存在感と強度が劇的に増加していました。この手順を実施する際は、菌血症および心臓の微小病変が形成されるのに十分な時間を確保するため、S pneumoniaeを十分に接種し、感染後少なくとも28〜30時間は経過させる必要があることに留意してください。