2015年4月7日
Streptococcus pneumoniaeは、心臓に離散的な非化膿性の顕微鏡的病変を形成します。概説されているのは、心臓微小病変形成のマウスモデルのプロトコルです。顕微鏡を用いた微小病変の可視化、早期微小病変と後期微小病変の識別、回復期動物の心臓リモデリングの検出方法について指導します。
次の実験の全体的な目標は、感染したマウスの心臓内でのESMO心臓微小病変形成の再現性のあるプロトコルを実証することです。これは、マウスにESMOを感染させ、菌血症の発症を可能にすることで達成され、細菌が心筋に侵入して微視的な病変を形成することができる心臓血管系にアクセスできるようになります。次に、心臓をパラフィンに包埋して従来どおりに染色するか、免疫蛍光染色のためにOCT化合物に固定します。
染色された切片の評価は、心筋コラーゲン沈着物全体にランダムに分布した心臓微小病変を示すことができ、心臓微小病変内の回復期の私の心臓切片と肺炎球菌カプセルの手順を実証します。Armand Brownは私の研究室の大学院生ですか?この方法は、マウスの浸潤性肺炎球菌性疾患中のS肺炎の心臓損傷効果についての洞察を提供することができます。
また、ヒト以外の霊長類やヒトなどの他のシステムからの心臓サンプルにも適用できます。まず、ESMO血清型4株のTiger four株をTodd Hewittブロスで620ナノメートルで光学密度0.5に成長させます。正しい密度のペレットで、3, 500 Gで10分間培養します。
次に、真空ラインを使用して上清を除去し、滅菌PBSで細菌を10, 000コロニー形成単位/ミリリットルで再懸濁します。現在、10〜12週齢のバルブCマウスに麻酔をかけ、鈍いピンセット、細菌懸濁液付きのロータスシリンジからつま先を優しくつまんで麻酔状態を確認し、27〜30ゲージの針を取り付けます。次に、麻酔をかけたマウスを片手で首筋でつかみ、もう一方の手で100マイクロリットルの懸濁液を腹腔内に注入しながら、各マウスをケージに戻します。
マウスは通常、注射後30〜40秒で目覚めます。S型肺炎の用量を正しく摂取することが重要であり、そうしないとマウスが感染から回復したり、病変が発症するのが早すぎる侵襲性肺炎球菌性疾患に至ったりする可能性があります。各細菌株は耳の水面レンズのレベルが異なるため、正しい用量を特定するには試行錯誤が必要になる場合があります。
感染が早期に少なくとも24時間進行するのを、または進行した感染の場合は30時間進行させます。その後、感染した各マウスを安楽死させます。まず、血液サンプルを採取し、アルコール綿棒で尾を消毒し、2〜3ミリメートルの切片を切り取ります。
切り取り部位から2マイクロリットルの血液を採取します。ヘパリンナトリウムを含むPBSで血液を1ミリリットルあたり1単位に連続希釈します。.三連祭壇画大豆血液寒天培地プレートに5段階の希釈液をプレートし、一晩インキュベートします。
翌日、コロニーカウントを取ります。次のセクションで説明するように、ハートの収穫を進めます。あるいは、感染後30時間。
100マイクロリットルの生理食塩水にアンピシリン腹膜間投与することにより、マウスの救助を試みます。12時間ごとにアンピシリンを36時間提供し続け、希望の時点でハートを収集します。まず、ハートを収穫します。
安楽死させたマウスを手術台の仰臥位に固定し、胸部に70%エタノールをスプレーし、軽くたたいて乾かします。手術用ハサミと鉗子を使用して、胸腔を開きます。胸郭を取り外し、横隔膜を横断して心臓と肺を露出させます。
次に、心臓に接続されている血管を切断し、鉗子を使用して、あざを作らずに心臓を優しく切除します。PBSで心臓をすすぎ、冠状切片用の組織標本収集カセットに入れます。次に、カセットを10%バッファーホルマリン溶液に移し、翌日、パラフィン包埋に送ります。
初期段階では、心臓病変は、色の外観の変化、場合によっては免疫細胞の存在によって識別できます。進行した病変では、免疫細胞は存在せず、大きくなります。VAのような病変がその場所に見られます。
正に帯電したスライドガラスに5ミクロンの心臓切片を使用し、最初に切片を凍結し、次に解凍して風乾させます。スライドを10%中性緩衝ホルミンで摂氏25度で10分間固定します。その後、3回の洗浄とPBSで1回の洗浄につき5分間、固定剤を取り出します。
続いて、PBS中の0.2%トリットン×100で組織を15分間透過させます。ストレートPBSでさらに3回洗って洗剤を取り除きます。次に、PBSですすぎ後1時間、PBS中の10%コート血清で組織をブロックし、摂氏37度で2時間抗血清で切片を覆います。
ネガティブコントロールをナイーブウサギ抗血清で治療する 心臓組織はXI免疫蛍光染色を容易に吸収し、高いバックグラウンドレベルをもたらすため、さまざまな種類の抗体のインキュベーション時間の濃度を最適化する必要があるでしょう 2時間後、抗血清をPBSで洗い流します。次に、溶液を二次抗体と交換し、スライドを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、DPIを5ミリグラム/ミリリットルで適用し、スライドをPBSで洗います。
最後に、スライドを床に取り付け、共焦点顕微鏡で保存して画像化します。まず、パラフィンを取り除き、組織切片を水分補給します。キシレンウォッシュを使用し、その後、段階的な一連のアルコールウォッシュを使用します。
次に、切片を0.2%リン酸化メチン酸に5分間浸し、続いて5分間水ですすぎ、次に0.1%重篤な赤色とリン酸で染色します。次に、切片を0.01の通常の塩酸で3分間洗浄し、70%エタノールで1分間すすぎます。次に、等級付けされたアルコール浴シリーズを逆にして切片を脱水し、続いて光学顕微鏡マウントを使用してキシレン洗浄を行い、スライドを評価します。
マウスは、トラとの挑戦の後に侵襲性肺炎球菌性疾患を発症しました。心室には4つのひずみ心臓微小病変が観察され、感染後24時間から30時間の間に病変のサイズと数の増加が認められ、肺炎が実際に病変内にあることを確認しました。切片は、Tiger fourによって産生された血清型4被膜多糖類について染色されました。
これにより、微小病変部位内に密集した密集した凝集体の存在が確認されました。Piro重篤な赤色染色は、アンピシリンおよび非感染コントロールでレスキューされたマウスの心臓切片に対して行われた。レスキューで。
染色の存在と強度が劇的に増加し、脳室の以前の病変部位と思われるものからバンドが流れ出ていました。この手順を試みる際には、S肺炎の使用が十分であるマウスに感染させ、感染が少なくとも28〜30時間進行するようにして、菌血症と心臓の微小病変が形成されるのに十分な時間を確保することを覚えておくことが重要です。
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この記事では、Streptococcus pneumoniaeに感染したマウスの心臓マイクロレジオン形成を研究するためのプロトコルを概説します。この方法論には、可視化技術や早期および後期マイクロレジオンの区別、および心臓リモデリングを評価する方法が含まれています。
Visualization and quantification of Streptococcus pneumoniae within cardiac microlesions provide a reproducible preclinical model for interrogating host-pathogen interactions and cardiac tissue remodeling. This workflow enables mechanistic de-risking of infection-driven cardiac injury, supporting predictive confidence in translational research and target validation for anti-infective or cardioprotective strategies. The protocol's reproducibility and adaptability across model systems position it as a foundational tool for portfolio triage and early discovery decision-making.
This protocol integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker development for infection-driven cardiac injury.