Name: 地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶ マウス海馬を展開しマイクロ電極アレイで神経活動を記録する手法。カスタムツールで組織を平らにし、貫通型電極で縦横両方向の活動伝播を同時に観測できます。

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この作業は、国立衛生研究所（国立神経疾患・脳卒中研究所）助成金1R01NS060757-01およびE.L.リンドセス寄附講座からドミニク・M・デュランの支援を受けました。OCTイメージングに協力してくれたAndrew M. Rollins博士の研究室に感謝します。

注：動物実験プロトコルを見直し、大学で施設内動物管理使用委員会によって承認された。 P20へP10歳の時にいずれかの性別のCD1マウスをこの研究で使用されている。 手術と実験録音1.ソリューション<ol><li>のNaCl 124、KClの3.75、KH 2 PO 4 1.25、MgSO 4を2、NaHCO 3で26、ブドウ糖10、およびCaCl 2 2：（mm）を含む通常の人工脳脊髄液（aCSFの）バッファを準備します。実験の開始時に切開した後、同様に洗浄システムのための組織の回復のために、この正常なaCSFのに使用します。 </li><li>スクロース220、塩化カリウム2.95、のNaH 2 PO 4 1.3、MgSO 4を2、 炭酸水素ナトリウム26、ブドウ糖10、およびCaCl 2 2：海馬の解剖中に使用して含んでいるショ糖のaCSF（mm）を準備します。無傷の海馬組織標本におけるてんかん様活動を誘導するために、正常なaCSFの少なくとも4アミノピリジン（4-AP）を追加100μMの濃度。 </li></ol>無傷の海馬の準備のために2の外科的処置<ol><li>デシケーターガラスジャー（具体的な材料および装置における第1号）の底でチャンバ内にイソフルラン（1ミリリットル）をドロップし、動物が接触取得していませんので、下段の表面を覆うように、通常の紙タオルを使用液体。その後、瓶にCD1マウスを置き、蓋を閉じます。約1分〜2分間、閉鎖瓶で動物を保​​管してください。息周波数は約1秒あたりのとき、ジャーからマウスを取り外します。 </li><li>手術台の上でマウスを置き、適切なはさみで首を切る。すぐに断頭した後、約30秒間氷冷（3-4℃）に頭部、酸素スクロースaCSFのを置く。 </li><li>頭蓋骨の上に皮膚を除去するために、テンポに近い2つの端部にだけでなく、頭の真ん中の線に沿って頭蓋骨をカットする細かいハサミ（特定の材料および機器で5番）を使用してくださいRAL葉。脳を露出させるために、ヘッドの各側にカット頭蓋骨を剥離する鉗子（具体的な材料および装置で第6）を使用します。 </li><li>慎重に頭蓋骨の底から脳を剥離し、脳と頭蓋骨の頭頂葉の間の隙間にマイクロラボへら（具体的な材料および装置における第8号）を挿入した後、準備された氷のように冷たい上にドロップします（3湿ったろ紙（具体的な材料および装置における第2号）に覆われて-4℃）外科段階。氷冷刃で小脳を外し、脳の正中線を切断して2半球を分離する。その後、氷冷スクロースaCSFのを満たしたビーカー中に分離した2つの半球を配置し、95％O 2/5％CO 2でバブリング。 </li><li>半球の半分を取り、氷冷したろ紙ステージ上に置く。余分なソリューションを吸うために脳を中心に定期的なペーパータオルまたはろ紙を置きます。材料における2ファイアーポリッシュガラスピペットツール（第10号を使用して、脳の中心部の残りの部分から大脳皮質を分離する装置）。 </li><li>海馬は皮質の内側から露出し、氷冷ステージに置かれた後、組織上の氷冷スクロースのaCSFの2〜3滴を配置し、海馬の周りに余分な溶液を除去する。海馬の両端に皮質との接続を切断します。その後、火災研磨されたガラスのツールで脳から海馬を解剖し、脳の残りの部分を削除します。 </li><li>その白板側を上に向けおよび海馬溝を下に向けて全体の海馬を分離します。すぐに再び組織上の氷冷スクロースのaCSFの2〜3滴をドロップし、ペーパータオルの一片を用いて組織の周りに余分な溶液を除去する。溝（ 図1B、C）を公開する全体海馬を裏返しする火災研磨されたガラスツールを使用します。 </li><li>通常の光学顕微鏡下では、具体的なMateriに特注のガラス針（11号を挿入溝の方向（ 図1C）に沿ってALSと機器）溝の一端にと鉤状回する歯状回（DG）から、ファイバ接続を切断したりCA1フィールド、。必要に応じて、海馬の中隔と時間的な端をトリミングするために氷のように冷たい刃を適用します。カット溝に（具体的な材料および装置における第12号）カスタムメイドの金属ワイヤループを挿入し、火災研磨されたガラスツールによって海馬の海馬台/ CA1の端部を保持しながら、組織から離れてDGの上に引き出します（ 図1D） 。 </li><li>上記の展開手順の後、組織上の氷冷スクロースのaCSFの別の2〜3滴を追加し、組織の周りに余分な溶液を除去する。その後、約（エッジ（ 図1E）で氷のように冷たい刃で折り畳まれていない海馬をトリミングし、通常aCSFので満たされた回復室にスパチュラで準備を置き、室温で95％O 2/5％CO 2でバブリング25°C）。去る折り畳ま海馬組織は、記録チャンバーにそれを配置する前に約1時間を回復する。 </li><li>他の脳半球を取り、2.5から2.9のステップを経るためにそれを使用。通常、単一の海馬を展開し、組織酸素化および水和を維持するために継続的に氷のように冷たい蔗糖aCSFのをドロップするように全体の手順を完了するのに約1から2分を取る。 </li></ol> 3.実験システムのセットアップ<ol><li>カスタムは、ピングリッドアレイ（PGA）パッケージPMEAを作製し、パッケージ（ 図3B）上のピンのパッドに単一微小電極の各パッドに接続するために、マイクロワイヤボンディングを使用し接着。その後、カスタムメイドの回路基板13上のソケットに、パッケージを挿入します。 </li><li>個別にカスタムメイドの回路基板13上の100のゲインで4 kHzとアンプに1ヘルツからバンドパスカットオフ周波数とのフィルタに各微小電極を接続してください。 A / D convは回路基板からのアナログ出力をデジタル化システムertingし、コンピュータのデータを取得し、格納する。 </li><li>溶液流（ 図4A）のための入口及び出口管を有するアレイの周りにカスタムメイドのプラスチック記録チャンバーを接着。システム内のさまざまなソリューションを維持し、トライ弁によりボトルの出力管に参加し、制御するために、少なくとも2つのボトルを使用してください。記録室にソリューションをガイドされている点滴室で配管システムにトライバルブの出力を接続します。 </li><li>三バルブと記録チャンバーの入口との間、溶液を記録チャンバーに導かれる前に、制御された温度（35℃）に溶液を加熱する電気ヒータを追加する。フラスコに接続された真空管に液を収集するために真空管に記録チャンバーの出口に取り付ける。この研究では、任意の実験ではすべてのソリューションをリサイクルしないでください。 </li></ol> 4. PMEA上に非折り畳み海馬を配置すると、神経活動を記録するために</p&gt; <ol><li>実験装置を製造するために、通常のaCSFのと4-AP aCSFの持つ別のボトルで1ボトルを埋める。両方のボトル、バブル95％O各実験の当初2/5％CO 2。実験中に選択される解決策を制御するためにトライバルブコネクタを使用してください。集塵容器内に溶液をポンプするチャンバーの出口に真空管を接続します。記録チャンバーにそれを配信する前に、パイプラインを加熱して制御​​された温度レベル（35℃）で溶液を維持する。 </li><li>チャンバ記録の入口と出口が閉じられたときに、記録チャンバー内に折り畳ま海馬を転送し、配置するカスタムメイドガラスピペットスポイトを使用する。顕微鏡下で、組織は溶液中に浮遊している中に、通常の小さなペイントブラシを使用して折り畳まれていない海馬を配置。研究者の方を向いて、下に向けてその白板側に折り畳まれていない海馬を置きCA3エリアまでを指し、およびCA1フィールド。 </lI&gt; <li>注意深くチャンバーを乾燥させ、組織アレイ上に下降するまで溶液のレベルを下げて記録チャンバーの端から真空ピペットを用いてチャンバ内の溶液を離れて吸う。その後、慎重にアレイ上に折り畳まれていない海馬を保持するために組織の上にカスタムメイドの組織アンカー（ 図4）（具体的な材料および装置で第14）を配置します。それを補充する記録チャンバーへの溶液の数滴を入れて、徐々に点滴チャンバ内で毎秒約2滴に流量を調整するための入口および出口を開く。 </li><li> 4-APに溶解するaCSFへの液供給を切り替えて、適切に流量を調整し、その後、回復するために約1分間の通常のaCSFた記録室で組織をインキュベートする。約5から10分間aCSFの溶解した4-APで組織をインキュベートした後、研究者は、自発的な活動が表示されたときに信号を記録するためにソフトウェアを起動できます。 </li></ol> 5.削除実験後にPMEAからの組織<ol><li>マイクロマニピュレータによる組織アンカーを制御し、徐々に記録チャンバーから組織を持ち上げる。記録チャンバー内の流れを停止し、入口と出口の両方をシャットダウンします。記録チャンバーは、ソリューションとの完全であることや、記録室が満杯でない場合室を埋めるために、溶液の数滴を追加する必要があります。 </li><li>組織の各コーナーを持ち上げるために小さなペイントブラシを使用してください。組織は、溶液中に浮遊していない場合、組織は、まだアレイの上に座って注意深くチャンバーを乾燥させるために真空管を使用する。その後、慎重に徐々に室を再充填し、記録室がいっぱいになったときに流れを止めるために注入口をシャットダウンする入口を開きます。再び組織の各コーナーを持ち上げるために小さなペイントブラシを適用します。 </li><li>手順を繰り返し5.2組織がアレイから切り離され、溶液中に浮遊しているまで。組織は、溶液中に浮遊している場合、離れた組織を吸引する真空管を使用する。オープントン彼は、入口に流れと出口に真空を開く。蒸留水でシステムを洗って、それを完全に乾く。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

海馬の縦方向および横軸が貫通する微小電極アレイと組み合わせて保存されて折り畳まれていない海馬調製物の開発が海馬7の解剖接続または神経伝播を研究する強力なツールを提供する。この展開手順は、成体マウスにおける海馬の研究にも適用可能である。この調製物を用いた最近の研究では、4-AP誘発性てんかん様活動は、折り畳まれていない海馬（ 図6）7,8の全領域にわたって対角線波面を伝搬することができることを示した。これらの研究は、フラット海馬神経回路網の神経伝達が（ 図6）を調べることができる場合、無傷折り畳ま海馬、横または縦のいずれかのスライスに対して重要な利点を提供することを示した。 貫​​通微小電極は、既存のMI上の重要な利点を提供しています平らな面11,12,17の上に配置された複数のコンタクトで構成されcroelectrodeアレイ（MEA）。平面電極を有するMEAは、細胞層は、約250~300ミクロン離れた表面（ 図2）...

神経信号の神経伝導または伝播を理解することは、脳1-3の正常な機能および病理学的状態の両方における神経コミュニケーションのメカニズムを決定するために重要である。海馬は、メモリ、および空間追跡などのいくつかの脳機能において基本的な役割を果たしており、劇的に挙動ならびに1,6に影響を与えるいくつかの病理学的変化に関与しているため、脳の中で最も広く研究構造の一つである。海馬は複雑な組織を示すが、その構造の異なる要素は、容易に識別され、スライス標本4-6にアクセスすることができる。海馬の横方向に、神経活動は、歯状回（DG）、CA3、CA1 andsubiculum 4,5を備えてトライシナプス経路を介して伝播することが知られている。これは、シナプス伝達および軸索伝導communicatiために主要な役割を果たすと考えられているこの横方向の回路4,6のオン。しかし、神経信号の伝播が横方向と縦方向4,6の両方で行われます。これは海馬が完全に伝播4の特定の方向に観測を制限スライス標本を使って調べることができないことを意味します。長手方向のスライスは、長手方向軸5に沿って軸索経路を調査するために開発された。研究者は、主に横方向と縦軸にそれぞれ6に沿って行動固有のガンマ及びシータ振動を観測した。これらの動作は別々に研究されてきた、まだ両方向への同時アクセスは、これらの動作を理解することが重要です。でも無傷の海馬製剤の開発は、海馬4の折り畳まれた構造に起因する組織全体を通して伝播を監視することは困難である。折り畳まれていない海馬はパックニューロンへのアクセスを提供します平らな二次元の細胞層7,8の形態である。 歯状回（DG）（ 図1）を展開することによって、海馬は、横方向及び縦方向の両方の接続がCA3およびCA1の両方を含む二次元のシートに配置された錐体細胞層に無傷のままでいる長方形の形状と平坦な形状を採用している神経伝播を研究するために使用することができる神経組織のフラット部分を残して（ 図2）8。神経活動は、個々のガラスピペット、マイクロ電極アレイ、刺激電極、ならびに電圧感受性色素（VSD）、3,7,8でモニターすることができる。また、トランスジェニックマウスの遺伝的にコードされた電圧インジケータは、伝播パターン9を追跡するために使用することができる。 折り畳まれていない海馬ネットワークの平坦な構成は、光学的な方法の記録のためにだけでなく、微小電極アレイに適しています。 M市販の配列のOSTは、平らなまたはロープロファイル電極が製造され、両方の組織スライスと培養神経細胞10-12に神経活動を記録することができます。しかしながら、信号対雑音比（SNR）は、ニューロンの細胞体は、組織内に深く配置されているので、信号が無傷の組織から得られた場合に減少する。高アスペクト比を有する微小電極アレイは、SNRを改善するために必要とされる。 この効果により、貫通微小電極アレイ（PMEA）が我々の研究室で開発され、折り畳まれていない海馬7,13に直径20μmと200μmの高さのスパイク64を挿入することにより、組織に直接プローブする能力を提供する。この微小電極アレイは、電位感受性色素イメージングに比べてより高いSNRを有しており、SNRが、実験7,13の間に安定している。折り畳まれていない海馬準備とPMEAの組み合わせが投資する新しい方法を提供します2次元平面上での神経伝達をIGATE。この技術を用いた実験では、すでに神経活動は、独立して、シナプスや電気シナプス7の伝播することが可能となる海馬における神経信号伝搬のメカニズムについての重要な結果が得られている。

<table><tbody><tr><td>乾燥ジャー</td><td>LABRECYCLERS Inc.</td><td>5410</td>動物<td>麻酔用の瓶の底に通常のペーパータオルを置きます。&nbsp;</td></tr><tr><td>海馬を展開するためのブレードとCustome製の手術ステージ</td>N<td>/A</td><td>N/A</td><td>ペトリ皿を氷の中に逆さま(中央)に置き、その上に濡れた濾紙を置きます。&nbsp;</td></tr><tr><td>カスタムメイドの組織回収チャンバーN</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>プラスチックチューブは、底部にプラスチックメッシュで接着され、aCSFに95%O2/5%CO2で泡立てられました。</td></tr><tr><td>ストレート操作&nbsp;はさみ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S17336B&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;メドコ・インスツルメンツ社 No.:81995&nbsp;</td><td>このハサミは&nbsp;&nbsp;ネズミの首を切る。</td></tr><tr><td>インテグラ・ミルテックス・ゴールドマン・フォックス&nbsp;はさみ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-460-517&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ミルテックス株式会社&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;No.:5-SC-320</td><td>マウスの頭蓋骨を切るためのハサミです。</td></tr><tr><td>Miltex 子宮摘出鉗子クラ</td><td>フリン医療機器</td><td>CESS-722033-00001</td><td>この鉗子は、脳を露出させるためにカットされた頭蓋骨を剥がすために使用されます</td></tr><tr><td>マイクロヘラ</td><td>枢機卿の健康</td><td></td><td>このマイクロヘラは、半球の脳全体を再調整室に移すために使用されます。&nbsp;</td></tr><tr><td>Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>このセミマイクロスパチュラは、展開した海馬を回復チャンバー内のグルコースaCSFに移すために使用されます。</td></tr><tr><td>小さなペイントブラシ</td><td>Lowe's</td><td>tem #:&nbsp;105657&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;モデル #:&nbsp;90219</td><td>通常のペイントブラシパッケージで最小サイズのもの</td></tr><tr><td>ファイヤーポリッシュガラスヘルプツール</td><td>N / A</td><td>N / A このツールは</td><td>ファイヤーポリッシュされ、通常のパスツールガラスピペットから作られました。</td></tr><tr><td>カスタムメイドのガラス針</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>このツールは、通常のパスツールガラスピペットからファイヤーポリッシュされました。</td></tr><tr><td>金属ワイヤーループ付きカスタムメイドガラスツール</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>このツールは、火で磨かれ、通常のパスツールガラスピペットに金属ワイヤーループを再形成して作られました。</td></tr><tr><td>カスタムメイドのガラス溶液スポイト</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>このツールは、通常のパスツールガラスピペットから作られ、先端がカットされ、カットされた端にゴムヘッドが取り付けられています。</td></tr><tr><td>カスタムメイドのティッシュアンカーN</td><td>/ A</td><td>N / A</td><td>ナイロン繊維メッシュは、絶縁銅線リングに接着されました。組織アンカーはマイクロマニピュレーターによって保持されました。</td></tr><tr><td>カスタム作製微小電極アレイ</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>アレイの詳細については、&nbsp;Kibler, et al, 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>アレイのカスタムメイドのフィルターとアンプ回路</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>アレイの詳細については、&nbsp;Kibler, et al, 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>データ収集プロセッサ 3400a</td><td>Microstar Laboratories</td><td>N/A</td><td>A/Dコンバータを搭載した完全なデータ収集システムです。</td></tr></tbody></table>

地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

このプロトコルは、海馬における神経活動をマッピングするための微細加工のアレイと組み合わせる新しいインビトロフラット海馬の準備を調製するための方法を説明します。横断海馬スライス標本は、海馬の電気生理学を研究するための最も一般的な組織調製である。縦海馬スライスはまた、海馬における縦の接続を調べるために開発されました。その厚さは、十分な酸素の拡散を可能にするので、無傷のマウスの海馬はまた、インビトロで維持することができる。組織の一部が欠落している9893のどちらかであるので、これらの3つの調製は、神経伝播への直接アクセスを提供しません。折り畳まれていない無傷の海馬横断し、インビトロで海馬における信号伝搬の全範囲を分析する組織に直接アクセスするための平坦な構成の縦接続の両方を提供する。効果的にtから神経活動を監視するために彼細胞層、カスタムを作製した微小電極アレイ（PMEA）を貫通製折り畳ま海馬に適用する。高さが200μmの64の電極を有するPMEAは、深いマウス海馬の中に神経活動を記録することができます。折り畳ま海馬調製およびPMEAのユニークな組み合わせは、高い信号対雑音比と海馬の二次元CA1-CA3領域における神経活動の伝播速度と方向を研究するための新規のin vitroツールを提供する。

ここで、図面に示されたデータは、4-AP（100μM）を室温で記録チャンバー内の組織のインキュベーションの間に添加するaCSF（25°C）で折り畳ま海馬製剤で記録した。通常、アクティビティが5分以内に開始しますが、高齢の動物からいくつかの海馬組織中でそれは時間がかかることがあります。以前に14,15を報告したようにPMEAで観察4-APによって誘発される神経細胞の発火は同じです。電極は、200μmの高さを有しているので、細胞層は海馬の白板上記通常250~300程度（ 図2）、録音（外57であるため、電極先端がちょうど細胞層（ 図3C）の下方に配置されている異なるチャネルからのサンプル実験では64）は、主に正のたわみを持っている。しかし、これらの陽性録音の一部は、同様に（ 図5B）記録電極先端が細胞層に十分近い場合には、小さい負の偏向を表示することができます。電極先端が右のセル層のレベルに位置している場合は、録音はそれにプラスのシフトか、単に負のスパイク（ 図5C）16</str...

私たちは、ニューロンのCA1-CA3配列を保持するインビトロ折り畳まれていない海馬を開発した。貫​​通微小電極アレイと組み合わせて、神経活動は、長手方向および横方向の向きでモニターすることができる。全体の海馬での伝搬を同時に記録することができますように、この方法は、海馬スライス標本上の利点を提供する。

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

この手順の全体的な目標は、げっ歯類の海馬を広げ、平坦組織調製物を浸透性微小電極アレイに配置するプロセスを導入することです。録音用。これは、最初にマウスの海馬を脳の半分から分離することによって達成されます。2番目のステップは、カスタムメイドのツールで海馬の湾曲した構造を展開することです。次に、展開した海馬を記録室に移し、記録アレイ上に置きます。最後のステップは、実験後に展開された海馬をアレイから取り除くことです。最終的には、個々の正規化マッピング法をデータ解析に使用して、貫通する微小電極アレイによって記録された神経活動の伝播を示します。さて、この手法の主な利点は、横方向と縦方向の2方向の神経活動を記録できることです。神経活動の実際の伝播を見るためには、無傷の海馬が必要であり、へこんだ瓶を広げて記録室に平らに横たわると、伝播は横方向と縦方向の両方で行われます。そして、組織の伝播速度を把握することができました。私たちは2つの方向の活動を行っており、伝播メカニズム、特に非シナプスメカニズムを研究することができました。私たちは、そのギャップ結合を持つシナプス伝達とともに活動が伝播するのを見ることができましたが、その速度から、それが拡散ではないことがわかっています。そこで、私たちは今、この伝播の実際のメカニズムを解明しようとしています。一般に、この技術に不慣れな個人は、海馬を広げ、組織またはアレイを損傷することなく、この貫通性マイクロ電極アレイに平らな組織調製物を配置するという困難な手順のために苦労するでしょう。この手順を開始するには、マウスの頭を氷冷酸素化スクロースに入れます。CSFは、頭蓋骨の皮膚を取り除くために細いハサミを使用します。次に、頭蓋骨を正中線に沿って切り取り、側頭葉の近くの両端を切り取ります。次に、カットした頭蓋骨を頭の側面に向かって剥がします。脳を露出させるためには、へらで頭蓋骨から脳を慎重に取り出します。その後、濡れた濾紙で覆われた氷のように冷たい手術段階に脳を置きます。氷冷したブレードで小脳を取り除きます。その後、脳の正中線を切断することにより、2つの半球を分離します。次に、分離した2つの半球を氷のように冷たいスクロースで満たされたビーカーに入れます。CSFは95%の酸素、5%の二酸化炭素で泡立ちました。片方の半球を濾紙で覆われた氷冷ステージに移します。通常のペーパータオルまたは濾紙を脳の周りに置き、余分な溶液を吸収します。その後、海馬を露出させるために、2つのファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して、脳の中央部分から皮質を分離します。次に、組織に氷冷剤ASSFを2〜3滴塗布し、余分な溶液を取り除きます。海馬の両端にある皮質との接続を切断します。次に、火で磨かれたガラスの道具で脳から海馬を解剖します。その後、海馬全体をその面を上に向け、海馬溝を下に向けて分離します 組織に再び氷冷サーゼCSFを2〜3滴すばやく塗布し、その周りの余分な溶液を取り除きます。次に、ファイヤーポリッシュガラスツールを使用して、海馬全体を裏返します。溝を露出させるには、氷のように冷たいブレードを使用して、海馬の中隔端と側頭端をトリミングします。必要に応じて、カスタムメイドのガラス針を溝に挿入し、DGから約3までのファイバートラックを切断します。次に、金属線ループを使用してDGを引っ張り、海馬を広げます。手術の全プロセスは通常約2分間続きます。さらに2〜3滴の氷冷スクロースA CSFを組織に塗布し、その周りの余分な溶液を取り除きます。次に、展開した海馬の端を氷のように冷たいブレードでトリミングします。調製物を正常なA CSFで満たされ、室温で95%の酸素、5%の二酸化炭素で1時間泡立てた回収チャンバーに移してから、記録チャンバーに移します。この手順では、1 本のボトルに通常の A CSF を充填し、もう 1 本のボトルに 4 本の AP A CSF バブルを充填します。実験開始時から酸素95%、二酸化炭素5%の溶液。トライバルブコネクタを使用して、実験中に選択される溶液を制御します。次に、チャンバーの出口に真空管を接続します。溶液をダストコンテナに取り込むには、パイプラインを加熱してから溶液を記録チャンバーに送り込み、摂氏35度に制御された温度に保ちます。記録チャンバーの入口と出口を閉じた後、カスタムメイドのガラスピペットスポイトを使用して、展開した海馬を記録チャンバーに移します。顕微鏡の位置下で、広げられた海馬は、アルビア側が下を向いており、ca a 3つの領域が離れて、ca a 1つのフィールドが研究者を指しており、記録チャンバーの端から真空ピペットを使用してチャンバー内の溶液を慎重に吸引しますチャンバーが乾燥して組織がアレイ上に置かれるまで。次に、カスタムメイドのティッシュアンカーを組織の上に慎重に配置して、展開した海馬をアレイに保持します。記録チャンバーに数滴の溶液を補充します。入口と出口を徐々に開いて、IVトリップチャンバー内の流量を毎秒約2滴に調整します。記録チャンバー内の組織を正常なA CSFと約1分間インキュベートします。次に、ソリューションを切り替えます。溶解した4つのAPにASSFを適用し、流量を適切に調整します。組織を溶解した4つのAPで組織をインキュベートし、A CSFを約5〜10分間インキュベートしてから記録します。PMEAから組織を取り外すには、マイクロマニピュレータで組織アンカーを制御し、アンカーを記録チャンバーから徐々に持ち上げます。流れを止めるために、入口と出口の両方をシャットダウンします。記録チャンバーで、小さな絵筆を使用して組織の角を持ち上げます。組織が溶液中に浮いていない場合は、真空管を使用して、組織をアレイに座らせたままチャンバーを慎重に乾燥させます。次に、インレットを慎重に開いてチャンバーを徐々に補充し、インレットをシャットダウンして流れを停止します。記録チャンバーがいっぱいになったら、小さな絵筆を使用してティッシュの角を持ち上げます。又。組織が溶液中に浮いている場合は、真空管を使用して組織を吸い取ります。入口で流れを開き、出口で真空を開きます。システムを蒸留水で洗い、乾かします。これは、基底樹状突起領域に位置する微小電極の1つから記録された100マイクロモルの4 AP A CSFによって誘発される自発的な活動の一例であり、信号対雑音比は34.9デシベルです。そして、これが赤い長方形の拡大された活動です。これは、体細胞の近くに配置された別の微小電極からの生データであり、信号対雑音比は27.2デシベルを示しています。これは、体細胞層内に配置された電極から得られる記録の別の例です。この例では、S/N比は18.53デシベルで、これがマイクロ電極から記録されたベースラインノイズです。ベースラインは通常、150〜200マイクロボルトのピークツーピーク値を持ち、単一の電極のインピーダンスは約1〜2メガオームです。このビデオは、配列で記録され、個々の正規化方法を使用して処理された神経伝播を示しています。データ解析では、この手順に続いて、組織全体にわたる全伝播が約100ミリ秒続きます。展開された海馬の脳内神経イメージングのような他の方法も、神経病巣の動きのような追加の質問に答えるために実行することができます。このビデオを見た後、海馬を所定の位置に展開する方法、つまりマイクロレクチャーアレイに平らな組織の準備をする方法をよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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貫通微小電極アレイを用いた展開した海馬組織の神経活動の記録

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急性海馬切片における神経野興奮性シナプス後電位の記録

このビデオは、マウスモデルの海馬にワイヤー電極アレイと光ファイバーを定位的に移植する様子を示しています。...

電極アレイと光ファイバーのマウス海馬への埋め込み

シングルユニット電気生理学的記録で使用するためにマイクロワイヤの組織化された配列を移植することは技術的な課題の数を示します。必要に応じてこの技術及び設備を実施するための方法が記載されている。また、高い空間選択性の異なる神経サブリージョンから録音するために組織さMICROWIREアレイの有益な使用が議論されている。...

動物を振る舞う、覚醒中のシングルユニット記録のためにマイクロワイヤの組織化された配列を移植するための手順

このビデオ記事は、げっ歯類の急性海馬切片を使用したCA1錐体ニューロンのシナプスタグ付け、捕捉、交差タグ付けなど、長期的な可塑性とそれに関連するプロセスを研究するための実験的手順について説明しています。...

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微小電極アレイを用いたげっ歯類脳スライス 4 アミノピリジン誘発てんかん活動の記録と電気変調を実行する方法を示します。カスタム記録室は、長期の実験的セッションを通して組織実行可能性を維持します。電極マッピングをライブ、刺激的なペアの選択は、カスタム グラフィカル ユーザー...

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

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行動中マウスの海馬における振動を制限空間録音

このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。...

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このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。...

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

学ぶ マウス海馬を展開しマイクロ電極アレイで神経活動を記録する手法。カスタムツールで組織を平らにし、貫通型電極で縦横両方向の活動伝播を同時に観測できます。

地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

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