地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

私たちは、ニューロンのCA1-CA3配列を保持するインビトロ折り畳まれていない海馬を開発した。貫​​通微小電極アレイと組み合わせて、神経活動は、長手方向および横方向の向きでモニターすることができる。全体の海馬での伝搬を同時に記録することができますように、この方法は、海馬スライス標本上の利点を提供する。

この手順の全体的な目標は、げっ歯類の海馬を広げ、平坦組織調製物を浸透性微小電極アレイに配置するプロセスを導入することです。録音用。これは、最初にマウスの海馬を脳の半分から分離することによって達成されます。

2番目のステップは、カスタムメイドのツールで海馬の湾曲した構造を展開することです。次に、展開した海馬を記録室に移し、記録アレイ上に置きます。最後のステップは、実験後に展開された海馬をアレイから取り除くことです。

最終的には、個々の正規化マッピング法をデータ解析に使用して、貫通する微小電極アレイによって記録された神経活動の伝播を示します。さて、この手法の主な利点は、横方向と縦方向の2方向の神経活動を記録できることです。神経活動の実際の伝播を見るためには、無傷の海馬が必要であり、へこんだ瓶を広げて記録室に平らに横たわると、伝播は横方向と縦方向の両方で行われます。

そして、組織の伝播速度を把握することができました。私たちは2つの方向の活動を行っており、伝播メカニズム、特に非シナプスメカニズムを研究することができました。私たちは、そのギャップ結合を持つシナプス伝達とともに活動が伝播するのを見ることができましたが、その速度から、それが拡散ではないことがわかっています。

そこで、私たちは今、この伝播の実際のメカニズムを解明しようとしています。一般に、この技術に不慣れな個人は、海馬を広げ、組織またはアレイを損傷することなく、この貫通性マイクロ電極アレイに平らな組織調製物を配置するという困難な手順のために苦労するでしょう。この手順を開始するには、マウスの頭を氷冷酸素化スクロースに入れます。

CSFは、頭蓋骨の皮膚を取り除くために細いハサミを使用します。次に、頭蓋骨を正中線に沿って切り取り、側頭葉の近くの両端を切り取ります。次に、カットした頭蓋骨を頭の側面に向かって剥がします。

脳を露出させるためには、へらで頭蓋骨から脳を慎重に取り出します。その後、濡れた濾紙で覆われた氷のように冷たい手術段階に脳を置きます。氷冷したブレードで小脳を取り除きます。

その後、脳の正中線を切断することにより、2つの半球を分離します。次に、分離した2つの半球を氷のように冷たいスクロースで満たされたビーカーに入れます。CSFは95%の酸素、5%の二酸化炭素で泡立ちました。

片方の半球を濾紙で覆われた氷冷ステージに移します。通常のペーパータオルまたは濾紙を脳の周りに置き、余分な溶液を吸収します。その後、海馬を露出させるために、2つのファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して、脳の中央部分から皮質を分離します。

次に、組織に氷冷剤ASSFを2〜3滴塗布し、余分な溶液を取り除きます。海馬の両端にある皮質との接続を切断します。次に、火で磨かれたガラスの道具で脳から海馬を解剖します。

その後、海馬全体をその面を上に向け、海馬溝を下に向けて分離します 組織に再び氷冷サーゼCSFを2〜3滴すばやく塗布し、その周りの余分な溶液を取り除きます。次に、ファイヤーポリッシュガラスツールを使用して、海馬全体を裏返します。溝を露出させるには、氷のように冷たいブレードを使用して、海馬の中隔端と側頭端をトリミングします。

必要に応じて、カスタムメイドのガラス針を溝に挿入し、DGから約3までのファイバートラックを切断します。次に、金属線ループを使用してDGを引っ張り、海馬を広げます。手術の全プロセスは通常約2分間続きます。

さらに2〜3滴の氷冷スクロースA CSFを組織に塗布し、その周りの余分な溶液を取り除きます。次に、展開した海馬の端を氷のように冷たいブレードでトリミングします。調製物を正常なA CSFで満たされ、室温で95%の酸素、5%の二酸化炭素で1時間泡立てた回収チャンバーに移してから、記録チャンバーに移します。

この手順では、1 本のボトルに通常の A CSF を充填し、もう 1 本のボトルに 4 本の AP A CSF バブルを充填します。実験開始時から酸素95%、二酸化炭素5%の溶液。トライバルブコネクタを使用して、実験中に選択される溶液を制御します。

次に、チャンバーの出口に真空管を接続します。溶液をダストコンテナに取り込むには、パイプラインを加熱してから溶液を記録チャンバーに送り込み、摂氏35度に制御された温度に保ちます。記録チャンバーの入口と出口を閉じた後、カスタムメイドのガラスピペットスポイトを使用して、展開した海馬を記録チャンバーに移します。

顕微鏡の位置下で、広げられた海馬は、アルビア側が下を向いており、ca a 3つの領域が離れて、ca a 1つのフィールドが研究者を指しており、記録チャンバーの端から真空ピペットを使用してチャンバー内の溶液を慎重に吸引しますチャンバーが乾燥して組織がアレイ上に置かれるまで。次に、カスタムメイドのティッシュアンカーを組織の上に慎重に配置して、展開した海馬をアレイに保持します。記録チャンバーに数滴の溶液を補充します。

入口と出口を徐々に開いて、IVトリップチャンバー内の流量を毎秒約2滴に調整します。記録チャンバー内の組織を正常なA CSFと約1分間インキュベートします。次に、ソリューションを切り替えます。

溶解した4つのAPにASSFを適用し、流量を適切に調整します。組織を溶解した4つのAPで組織をインキュベートし、A CSFを約5〜10分間インキュベートしてから記録します。PMEAから組織を取り外すには、マイクロマニピュレータで組織アンカーを制御し、アンカーを記録チャンバーから徐々に持ち上げます。

流れを止めるために、入口と出口の両方をシャットダウンします。記録チャンバーで、小さな絵筆を使用して組織の角を持ち上げます。組織が溶液中に浮いていない場合は、真空管を使用して、組織をアレイに座らせたままチャンバーを慎重に乾燥させます。

次に、インレットを慎重に開いてチャンバーを徐々に補充し、インレットをシャットダウンして流れを停止します。記録チャンバーがいっぱいになったら、小さな絵筆を使用してティッシュの角を持ち上げます。又。組織が溶液中に浮いている場合は、真空管を使用して組織を吸い取ります。

入口で流れを開き、出口で真空を開きます。システムを蒸留水で洗い、乾かします。これは、基底樹状突起領域に位置する微小電極の1つから記録された100マイクロモルの4 AP A CSFによって誘発される自発的な活動の一例であり、信号対雑音比は34.9デシベルです。

そして、これが赤い長方形の拡大された活動です。これは、体細胞の近くに配置された別の微小電極からの生データであり、信号対雑音比は27.2デシベルを示しています。これは、体細胞層内に配置された電極から得られる記録の別の例です。

この例では、S/N比は18.53デシベルで、これがマイクロ電極から記録されたベースラインノイズです。ベースラインは通常、150〜200マイクロボルトのピークツーピーク値を持ち、単一の電極のインピーダンスは約1〜2メガオームです。このビデオは、配列で記録され、個々の正規化方法を使用して処理された神経伝播を示しています。

データ解析では、この手順に続いて、組織全体にわたる全伝播が約100ミリ秒続きます。展開された海馬の脳内神経イメージングのような他の方法も、神経病巣の動きのような追加の質問に答えるために実行することができます。このビデオを見た後、海馬を所定の位置に展開する方法、つまりマイクロレクチャーアレイに平らな組織の準備をする方法をよく理解しているはずです。