Name: 法医学インチタッチDNA」の証拠から簡体マイクロマニピュレーションにより回収する単一のヒト生体粒子の強化された遺伝解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶ法医学タッチDNAからの単一生体粒子の回収と遺伝解析。低接着性ゲルフィルムとマイクロマニピュレーションを用いて微量証拠から高品質なDNAプロファイルを取得する効率的な手法です。

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著者は、この作業のためにサンプルを寄付してくださったすべての参加者にも感謝したいと思います。この研究は、司法省国立司法研究所の司法プログラム局によって、賞番号2010-DN-BX-K139の下で資金提供されました。資金提供機関は、研究デザイン、データの収集、分析、解釈、または報告書の執筆に関与していませんでした。本文書の見解は著者のものであり、必ずしも米国司法省の公式見解を表すものではありません。

注：体液は、セントラルフロリダの施設内倫理委員会の大学によって承認された手順を使用して、ボランティアから採取した。インフォ書面による同意は各ドナーから得た。 触れオブジェクトと表面からの生体粒子の1コレクション<ol><li>所望の大きさに、ゲルフィルムをカットします。それが固体支持体として使用されているガラス顕微鏡スライドに適したサイズであることを確認してください。例えば、3 &quot;×1&quot;スライドガラスのため、2 &quot;×0.75&quot;のゲルフィルムのサイズを使用する。 注：材料の長さと幅は、必要に応じて、減少させることができるが、この大きさを超えるべきではない。 </li><li>ゲル状フィルムから白い裏紙を外し、顕微鏡スライド（ 図1A）に、ゲルフィルムを添付します。完全な添付ファイルを確実にするために、しっかりと下に押します。 注：圧力がゲル-FILの部分に沿って適用されるように除去されるべきではないクリアトップ保護層がありますゲルフィルムの表面を汚染することなくメートル。必要になるまで（添付保護層）準備ゲルフィルムスライドは、室温で保存することができる。 </li><li>ゲル状フィルムサンプル使用する準備ができて、滅菌ピンセットを用いてゲルフィルムから明らかな上部保護フィルム（ 図1B）を取り外します。希望触れた物体または表面（ 図2）に直接接触したゲル膜表面に配置します。ゲルフィルムへの生体粒子の効率的な転送を確保するために少量の圧力を適用する。 注：過剰な圧力が印加されると、スライドガラスが破損する可能性がある。 注：同じ物体または表面からの複数のサンプリングは、ゲルフィルムの同じ部分に集めることができる。 </li><li>実体顕微鏡スライドを配置することにより（ 図3）、ゲルフィルム上にバイオ粒子の移動を確認する（トランス-または落射照明を使用することができる）。ゲル·フィルム、および最高のviのための〜200Xの倍率の大きな領域を表示する最善のために〜20Xの倍率を使用してくださいユーイング個々のバイオ粒子。 </li><li>カバーされたスライドボックス内の室温でのゲルフィルム試料スライドを保存したり、染色および/またはバイオ粒子捕集のためにすぐに使用しています。 </li></ol>可視化を支援するために生体粒子の2.オプション染色<ol><li>シンクオーバースライド染色ラックにステップ1で調製したゲルフィルム試料スライドを置きます。 </li><li>使い捨てトランスファーピペットを用いて、トリパンブルー染色（ 図4A）全体ゲルフィルム表面を覆う。 1~2分間室温でインキュベート。 </li><li>汚れがシンク（ 図4B）に切ることができるようにスライドを傾けて余分な汚れを除去します。 注：（ 図4C）必要に応じてスライドは使い捨て転送ピペットを用いて滅菌水で穏やかな洪水によって洗い流すことができる。 </li><li>バイオ粒子の分離に進む前に、空気乾燥にスライドを許可します。 Vへの全体的な表示や〜200-300X用実体顕微鏡（〜20Xを使用してスライドを表示IEW個々の生体粒子）が適切な染色（ 図4D-E）を確保する。 注：スライドは、カバーされたスライドボックス中、室温で保存することができる。 </li></ol>分析の対象となる生体粒子の3.絶縁<ol><li>ラック内の0.2ミリリットルのPCRチューブの適切な数を配置し、適切にチューブにラベルを付ける。 </li><li>指定されたPCR増幅フードや安全キャビネット内（ 材料リストを参照）STR増幅ミックスを調製する。ウェルと簡単にミニ遠心機で遠心渦マスターミックス。 <ol><li>サンプルごとに必要な増幅混合物の量は3.5μLです。サンプルの所望の数のためのマスターミックスの適切なボリュームを準備。 </li></ol></li><li>ピペットで各0.2ミリリットルチューブに増幅混合物の3.5μL。ゆるく各チューブにキャップ。 </li><li>きれいなガラス顕微鏡スライド上に直接ガラスブロックの上に二重スティックテープ片を置きます。 注：これは、保持するために使用されるサンプル収集中に所定の位置に0.2ミリリットルチューブ。 </li><li>きれいなガラス顕微鏡スライド上に二重スティックテープ片を置きます。ダブルスティックテープの上に水溶性の波のはんだテープ片を置きます。 注：このスライドは、将来の使用のためにデシケーター内に保存することができる。 </li><li>ステップ3.4で作成ダブルスティックテープスライドまたはブロックの上に最初の0.2ミリリットルチューブを置きます。サンプルが収集されるまではさておき、このチューブを設定します。 </li><li>顕微鏡（低倍率）の下で水溶性の波のはんだテープスライドを置きます。タングステン針の先端を用いて、穏やかに針（ 図5A）の最後に少量の接着剤（または「ボール」）を収集するために、テープの表面をこすり。 注：ボールのサイズが収集される生体粒子の数に応じて小さくまたは大きくすることができる。 </li><li>慎重に針の先端を乱すことなく、顕微鏡の下から接着剤を用いてタングステン針を取り除く。針缶サンプル配置中に必要に応じて、ラック内の場所である。 </li><li>顕微鏡ステージ上（ステップ1と2）から調製したゲルフィルムのサンプルを置きます。生体粒子を簡単に見ることができるようになるまでフォーカスと倍率を調整します。収集することができるバイオ粒子を識別します。 注：ガラスブロックは、必要に応じてスライドをサポートするために使用することができる。 </li><li>接着剤ボールとタングステン針を取得し、関心のバイオ粒子が配置されているゲル状フィルム表面に針を置く。それは、バイオ粒子（ 図5B）と接触するように下方に（接着剤を用いて）、針の先端を押してください。バイオ粒子が収集されたことを確認するために針を持ち上げます。バイオ粒子の所望の数が収集されるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li>顕微鏡ステージ上の準備0.2ミリリットルのPCRチューブを置きます。増幅混合物を含むチューブの底部が焦点になるように倍率を調整する。 </li><li>慎重にタングステンneedlを挿入針の先端まで、0.2ミリリットルのPCRチューブにeは増幅混合物である。 注：顕微鏡を通して見ながらこれが最高の行われている。 </li><li>接着剤が溶解し、生体粒子を溶液（ 図5C）中に放出されるまで、増幅混合物中に針を保持する。 、針を外し直立0.2ミリリットルを配置し、緩くチューブにキャップ。 </li><li>追加のサンプルの収集手順を繰り返します。サンプル間でワイプウェットタイプのアルコール（イソプロパノール）とタングステン針を清掃してください。 </li></ol> 4.複合バナリスト核酸単離（直接溶解）と常染色体ショートタンデムリピート（STR）プロファイリング<ol><li>指定されたPCR増幅フードや安全キャビネット内（ 材料を参照） を溶解バッファーを準備します。 5μlの全反応容量のために各チューブに溶解緩衝液1.5μLを加える。しっかりと閉じるチューブの蓋。 注：0.2 mlチューブは、すでにの3.5μLが含まれているステップ3からの増幅ミックスと回収バイオ粒子。 </li><li>場所サンプルをサーマルサイクラー中で、以下のサイクリング条件を用いて、試料の増幅：15分間75℃。 11分間95℃; 3分間20秒、59℃94℃の34サイクル; 10分間60℃; 4℃保持。 <ol><li>短期保存のために4℃で保存した増幅産物。 </li></ol></li></ol> 5.製品の検出 - キャピラリー電気泳動（CE） <ol><li> （9.7μlの脱イオン化ホルムアミドと0.3μlのサイズ標準、 マテリアルを参照）を96ウェルプレートに、CE実行しているミックスの10μlを添加する。各ウェルに増幅産物または対立遺伝子ラダーの1を添加する。 注意：ホルムアミドは、潜在的な変異原で、適切な個人用保護具を装着したまま化学​​フード内で処理する必要があります。 </li><li>増幅キットのマニュアルまたはinternallに製造業者によって指定された電気泳動条件を使用してくださいyが条件を検証しました。 </li><li> STR解析ソフトウェアとの生データを分析します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、コレクションとタッチのDNA証拠から回収された生体粒子の強化された遺伝子分析のための方法を記載している。開発されたアプローチは、以下を含む：触れたオブジェクトおよび表面、着用衣料品または直接、ヒトの皮膚、回収された生物学的材料の2）顕微鏡検査から、ゲル膜を介して生物学的物質（ すなわち、生体粒子）の1）コレクションの可能性のコレクションを確保する人間の生体物質、及び水溶性接着剤を使用して、単一または少数の生体粒子の3）マイクロマニピュレーション、および微量（5μl）をワンステップ溶解/増幅反応を使用して収集生体粒子の4）常染色体DNA-STRプロファイリング。ワンステップ閉管反応の使用は、追加のサンプル操作または他の反応管への転送による汚染及びサンプルの損失の可能性を低減する。強化されたワンステップ微量（5μl）を溶解/ STR増幅反応は、完全またはprobativの回復を可能にするE STR単一または少数の生体粒子のドナーのプロファイル。このアプローチは、シングルおよびマルチソースタッチのDNAの証拠（ 例えば、着用衣料品やその他の家庭用品、触れる/取り扱うオブジェクトおよび表面、皮膚/皮膚の混合物）から単一のソースSTRプロファイルを得るために開発されました。これは、正常にシミュレートされた身体的暴行の混合試料中の男性のドナーの検出のために使用されている。 このアプローチは、さらに、加害者からわずか数生体粒子が被害者からの生物学的材料の圧倒的な量の中で存在するであろうに、彼/彼女の加害者を悩ま犠牲者、のような追加の体液/組織混合シナリオで評価することができる。現在の研究で開発されたこのアプローチは、単一の生体粒子レベルでの分析を可能にするので、さらに、それが仲介surfa上のDNAプロファイルを転送する二次転写14-19の性質および程度のより良い理解を得るために使用することができる別の表面オブジェクトまたは人から20 CE、オブジェクトまたは人。二次転写の分析ブラインドスワブのアプローチは、二ドナーから物質の微量を識別するために失敗することがある。ここで開発されたアプローチは、単一または少数の生体粒子の分析を可能にし、従って、結果は主要ドナーからの生物学的材料の圧倒的な量の存在により混乱されない。本研究で開発した方法論はまた、加害者から皮膚細胞の微量陽性同定は、その性的接触を確立することが重要である可能性が膣のデジタル浸透を伴うものとして性的暴行事件の痕跡生物学的物質の分析に影響を与える可能性があり発生しました。 ゲル状フィルム試料から生体粒子の収集が困難で複雑な操作を必要としない一方で、SUを確保するために細心の注意を払って実行する必要がこの手順の重要なステップがあります下流の反応容器への生体粒子のccessful移転。水溶性の接着剤を用いて生体粒子の集まりがあり、使用される接着剤「ボール」のサイズに応じて。 すなわち、高倍率（〜200-300X）での実体顕微鏡は、関心のある唯一の生体粒子が収集されることを保証するために（顕微鏡的に表示する必要があります両方の生物学的および非生物学的材料（ 例えば、繊維、その他の破片）を含むことができる付加的な周囲の材料を収集する可能性がある。意図しない追加の生体粒子の集合体は、混合DNAプロファイルの回復をもたらし得る。非生物学的物質の収集を複数の生体粒子は、同じ接着剤「ボール」で収集している場合は、接着剤の付着していないになる以前に収集された生体粒子の可能性がある。マイクロボリューム溶解/ STR反応に阻害剤を導入することができる。これは、頻繁に観察されないが、発生することができbioparticl数が多いときES収集されます（ 例えば、50以上）は、単一の接着剤「ボール」と。生体粒子の多数の標的とされる場合は、より少ない生体粒子の複数のコレクションが行われていることをお勧めしますが、すべて同じ0.2ミリリットルチューブに移す。生体粒子が収集されたら、針の先端が乱されないように、注意が顕微鏡ステージからゲルフィルムスライドを除去し、0.2 mlのチューブの配置中に注意しなければならない。 0.2ミリリットルチューブの底の増幅混合物への針先端の配置中に、針の先端は、チューブの両側の材料の損失を回避するために、チューブの側面に接触してはならない。接着剤の可溶化は、典型的には、急速な（〜30秒以下である接着剤の大きさに応じて、「ボール」）で、顕微鏡検査中に監視することができ、針の先端をゆっくりとその完了を確実にするために増幅混合物から除去されるべきであるが可溶化接着剤の達成された。接着剤が完全に溶解していない場合、針が完全に溶解を可能にするために液体に戻すことができる。 ここで説明するプロトコルは、法医学、生物学的証拠から生体粒子およびヒト細胞での使用に最適化されてきた。選択した溶解バッファーは、選択されたDNA-STR増幅キットと互換性があります。適切な代替溶解緩衝液が存在し得るが、下流の分析と細胞溶解との相溶性の観点から、その効率は、ユーザによって確認されなければならない。さらに、このプロトコルに記載STR増幅キットと増幅サイクル数は、単一または少数の生体粒子の使用に最適化されている。報告された増加したロバスト性及び感度の次世代STR増幅キットは、選択された単一または少数の生体粒子から高品質のSTRプロファイルの回復をもたらすことが実証されている。一方、様々な推奨されるamplifiと、他の多くのSTRキット、カチオンサイクル数は、それらが適切な感度を有していてもよく、従って、適切にこれらのプロトコルで使用する前に評価される必要がある、利用可能である。 単一または少数の生体粒子から回収STRプロファイルのために記載された方法の使用の成功にもかかわらず、プロファイルの回復の成功率は100％ではないであろう。したがって、いくつかのサンプルについて制限された部分的なDNAプロファイルまたはプロファイルなしに観察することができる。これは決定的に視覚的に細胞物質を回収生体粒子又は反応容器に移す前に、接着剤からの試料材料の喪失、核物質の潜在的な劣化状態のように、ほとんどの生体粒子を識別することができないことを回避することはできない。そのため、各タッチのDNA項目のための単一の生体粒子の試料の分析が推奨されていません。我々は、しばしば、個々のゲルフィルムサンプルから20サンプルセットを収集し、適切なSTRプロファイルが得られない場合は、必要に応じて追加のサンプルセットを収集する。 T微量反応は、単一の標準的な反応容積と同様またはより低いコストのために追加のサンプルを収集する機会を提供するが、彼のコレクションのための唯一の制限は、（ゲルフィルム試料（および可能性分析のコストに生物学的物質の存在量である例えば、25μL）。 プロファイリング方法がここに記述し開発したDNAは、タッチDNAサンプルから回収された微量の生物学的材料の特性評価、分析と解釈に、分子ベースのアプローチを提供する。しかし、生物学的物質のドナーのドナー（ すなわち、STRプロファイル）の決定に加えて、回収された生体粒子から得ることができ、追加の遺伝情報があります。起源の組織または体液源（ 例えば、唾液に対する皮膚）は、犯罪捜査に重要なコンテキスト情報を提供してもよい。このような決定がなければ、起源の組織源の曖昧さをexploすることができます（体液が付着されていてもよい方法、例えば、）犯罪の別の状況が示唆することができるようにited。マイクロボリュームの逆転写（RT）を含む組織源識別（mRNAのプロファイリング21-30）戦略で使用するためのここに記載の収集および分離プロトコルは生体粒子または他の細胞を収集するために使用することができる生体粒子（ 例えば、口腔、膣）、および増幅反応。さらなる最適化では、タッチDNA証拠から生体粒子を含む同じ試料からの細胞タイプの識別（RNA）およびSTRプロファイリングを可能にするDNA / RNA共分離戦略を開発することが可能である。

タッチDNAは細胞材料の直接転送であるトレースの生物学的証拠の一形態である物理的な接触1中にオブジェクトまたは別の個体間で（ 例えば、皮膚細胞を流す）。触れたオブジェクト（文書、寝具、靴、銃器、飲料容器、ペン、ブリーフケースハンドル）種々のDNAプロファイルを得る能力は、文献2-9に報告されている。 タッチのDNA証拠の分析における重要な要素は、トレース生物学的物質の存在成功した回復である。 DNAの証拠は、典型的には、無菌の綿棒で疑われる領域をスワブにより収集されるタッチし（「ブラインド拭き取り」と呼ぶ）。このアプローチを用いて、採取した生体材料の性質は知られておらず、一般的なエリアのサンプリングが行われる。表面溝や隙間の存在は、双方向の、多くの場合、すでに少量の正常な回復を妨げる可能性学的材料が存在。さらに、「ブラインド拭き取り」アプローチ意志細胞アイテム上に存在する、個人の細胞はアイテム上の空間的に異なる位置に配置されている場合でも、異なる個体から必ずしも共同サンプル細胞物質。しばしば低い鋳型DNA試料で特に解決するために挑戦している混合DNAプロファイルの回復は、しばしば8,10,11に観察され、多くの場合に拭き取りプロセス自体の結果的なアーティファクトになる。素材のわずかな量はドナーの1から存在していた場合は、標準的な抽出および分析技術はマイナー貢献者からプロファイルを回復するために失敗することがあります。また、綿棒のか、乾式または湿式使用されたかどうかのタイプは、（滅菌水で予め湿らせた）により、吸収性および吸着性及び生物学的物質12の放出の効率の違いに収集される生物学的材料の量に影響を与え得る。 Standard抽出方法は、サンプルまたはサンプル移送工程の必要な物理的な操作に起因する追加のサンプル損失を生じ得る。 上述したように、生物学的物質の回収のための簡単​​な拭き取り技術は、生物学的サンプルの微量の損失ならびに個々の生物学的成分を分離するための失敗による混合プロファイルの増加が発生する可能性があります。したがって、我々は触れオブジェクト上に存在する細胞の微粒子の集合体に対してより選択的かつ効率的な回収戦略を開発しようとした。タッチのDNAの証拠から生物学的物質の分析のために開発された戦略は、（これは皮膚の外側の表皮層で見つかった細胞の大部分は死んでいるか死んでいるので、核は常に表示されていないという事実に「生体粒子」とここでいう13をケラチノサイト）以下を含む：ゲルフィルムFR経由生物学的物質（ すなわち、生体粒子）の1）コレクションOM水溶性の接着剤を使用してオブジェクトおよび表面、着用衣料品や直接人間の皮膚、潜在的なヒトの生物学的材料の収集を確保するために回収された生物学的材料の2）顕微鏡検査、および単一または少数のバイオ粒子の3）マイクロマニピュレーションに触れて、微量（5μl）を一段階溶解/増幅反応を使用して収集されたバイオ粒子の4）常染色体DNA-STRプロファイリング。 この手順では、伝統的に使用される分析方法を上回る多くの利点を提供しています。ゲルフィルムを用いた生体粒子の回収は、分析前に、サンプル中の生物学的物質の存在の顕微鏡検査を可能にする。タッチDNA証拠から回収生体粒子の大部分は、それがより困難に分析前に、これらのサンプルの顕微鏡検査は、有核細胞を検索する機会を提供するか、どのように多くの生体粒子を選択すべきかを決定することの有核細胞ではないかもしれないがこうしてmaximizDNAプロファイルの回復の確率る。水溶性の接着剤アシストマイクロマニピュレーションを使用した生体粒子の集合体は、反応管にターゲット生体粒子の直接転送を可能にします。この手順は、生体物質の正常な移動を確保するために顕微鏡下で可視化される。サンプルあたりの分析のコストを削減しつつ、減少または微量反応は感度を高める。これは、証拠の個体からのサンプルの数の増加の分析を可能にする。起因するタッチのDNAの証拠でバイオ粒子の遺伝的状態の範囲に、個々の項目から複数のサンプリングを推奨します。 ここでは、開発されたプロトコルの使用の成功は、タッチDNA証拠に生物学的物質のドナーの高度に立証遺伝子プロファイルを得ることを実証する。プロファイリング法開発生体粒子の収集及びDNA（ すなわち、特定の、測定可能アッタ包括的な「スマート」を提供トレース生物学的材料の特性評価、分析と解釈に）、inable現実的かつタイムリーな分子ベースのアプローチ。もともとタッチDNA証拠の法医学的分析への応用のために開発されているが、ここで開発された戦略は、生物学的材料の他のソースに適用し、単一細胞レベルでの個別の識別情報を取得する機会を提供することができる。

<table><tbody><tr><td>SealRite 1.5 ml天然微量遠心チューブ、滅菌済み</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>多数の代替サプライヤーが利用可能ですが、チューブは無菌</td></tr><tr><td>0.2 ml PCRチューブ、フラットキャップ付き、天然</td><td>フェニックスリサーチ</td><td>MPX-200F</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-666および/または06-666-11C</td><td></td></tr><tr><td>アルコール調製パッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-669-62</td><td>代替は 06-665-24 (Fisher Sci); 個々のパッドではなく、より大きなアルコールワイプのキャニスター</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td>18.2 M&Omega;、オートクレーブ</td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド、つや消し、3インチ x 1インチ: 1 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-544-3</td><td>代替ブランドまたはサイズは許容されます</td></tr><tr><td>使い捨てトランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>13-711-9D</td><td>代替品は許容されます</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>シグマ</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>ピペット:0.2-2、2-20、10-100、100-1,000 &mu;l</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌、エアロゾル耐性ピペットチップ</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M205C</td><td>その他が適していますが、最大350倍の拡大が可能でなければなりません</td></tr><tr><td>GeneAmp PCRシステム9700 サーマルサイクル(銀または金ブロック)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>N8050200または4314878</td><td>他のモデルやメーカーを使用することができますが、STR増幅キットの性能は検証する必要があります</td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer</td><td>Life Technologies</td><td>3130-01</td><td>代替品:310または3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies)</td></tr><tr><td>GeneMapperソフトウェア</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>の様々なバージョンのソフトウェアが利用可能で</td></tr>、<tr><td>WFゲルフィルム、x8保持レベル</td><td>ゲルパック</td><td>を使用することができますWF-40-x8-A</td><td>4 "×4"ウェーハフィルム;他のサイズの仕様で注文することができます</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>さまざまな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスブロック、3 "×1.5"×3/8 "</td><td>McCrone顕微鏡とアクセサリー370-2</td><td></td><td>または同等の</td></tr><tr><td colspan="4"> [ヘッダー]</td></tr><tr><td>ホルダー付きタングステン針</td><td>McCrone顕微鏡と</td><td>アクセサリー106</td><td></td></tr><tr><td>3M水溶性波はんだテープ、5414透明な</td><td>Allied Electronics</td><td>70113977</td><td></td></tr><tr><td>溶解バッファー(法医学GEM唾液、Zygem)</td><td>VWR</td><td>95043-992</td><td>溶解バッファーは10&muで調製されます。Lポーション(必要なサンプル数に対応するために、必要に応じて追加のマスターミックスポーションを準備します)。1.5 &MU;l は各サンプルに使用されます。10 &mu;溶解バッファーの L (~6 サンプルに十分): 6.9 &mu;l 滅菌水、2.1 &mu;l 10xバッファー - 青、1 &mu;l フォレンジックGEM。</td></tr><tr><td>STR増幅キット、AmpFlSTR Identifiler Plus PCR増幅キット</td><td>Life Technologies</td><td>4427368</td><td>他のSTR増幅キットも使用できますが、性能はユーザーによって検証されていただく必要があります。増幅混合物は次のように調製されます(サンプルあたりの容量):2.2 &mu;l PCR反応ミックス、1.1 &mu;l プライマーセット、0.2 &mu;l (1U) AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ。必要なサンプル数に十分なマスターミックスを調製する必要があります。3.5 &mu;調製した混合物のLを0.2 mLチューブに添加してバイオパーティクルを採取します。</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ N808-0245</td><td></td></tr><tr><td>HiDiホルムアミド</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZサイズ標準</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4322682</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル光学反応プレート</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ N8010560</td><td></td></tr><tr><td>プレートセプタム、96ウェル</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4315933</td><td></td></tr><tr><td>性能最適化ポリマー、POP-7</td><td>Life Technologies</td><td>4363785</td><td>POP-4などの代替品は許容されます</td></tr></tbody></table>

法医学インチタッチdna」の証拠から簡体マイクロマニピュレーションにより回収する単一のヒト生体粒子の強化された遺伝解析

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

DNAプロファイルは、人間の生物学的材料の微視的な痕跡を含み、「タッチDNA」証拠から得ることができる。微量DNAの回収のための現在の方法は、関心領域をサンプリングするために綿棒または粘着テープを使用する。しかし、このような「ブラインド拭き取り」アプローチは共同サンプルます細胞物質を別の個体から、個人の細胞はアイテム上の地理的に異なる位置に配置されていたとしても。したがって、タッチDNA試料で遭遇DNA混合物の一部は、人工的にスワブ自体によって作成される。いくつかの例では、被害者のDNAは、このように潜在的な加害者のDNAをマスキングする有意な過剰に見ることができる。 標準の回収および分析の方法で課題を回避するために、我々は、タッチDNA証拠の増強遺伝子解析をもたらす低コスト、「スマート分析」方法を開発した。私たちは、最適化されたANを記述するタッチDNA試料中に存在するバイオ粒子の収集、ならびにバイオ粒子ドナーからのSTRプロファイルの回復を可能にするために、ワンステップ5μlの微量溶解/ STRの増幅を伴う強化増幅戦略のdの効率的な顕微回復戦略（複数可）。個人または少数（ すなわち、「塊」）の使用単一のソース·プロファイルを得る能力で生体粒子をもたらす。これらの手順は、法医学タッチのDNAの証拠から、単一の生体粒子の単離と解析のための代替強化技術を表し。すべての法医学調査において必要ではないが、この方法は、標準的な分析技術を用いて可能でないかもしれない物理的な攻撃（ 例えば、絞扼）を含む場合には、単一のソース·加害者のDNAプロフィールの回復のために非常に有益であり得る。また、ここで開発戦略がoの様々な単一細胞レベルでの遺伝情報を入手する機会を提供するTHER非法医学トレース生物学的材料。

男性のドナーが着用シャツの襟（ポリエステル100％）から回収された個人や凝集生体粒子の代表的な画像を図6（個々の生体粒子）および図7（凝集生体粒子）に示されている。生体粒子は、ここに記載したプロトコルを使用して、シャツの襟から回収した：トリパンブルー、タングステン針と水溶性接着剤を用いて生体粒子試料の採取と回収生体粒子の直接接触、染色を介してゲルフィルムのシャツの襟から生体粒子の移動5μlのマイクロボリューム溶解/ STR増幅を使用し、STR分析6及び図7は、個々のタッチDNA項目（20単一/個々の生体粒子20凝集した生体粒子）から分析される生体粒子の典型的なサンプリングを表す図 。各画像収集生体粒子（複数可）（ミクロン）の長さおよび幅の測定値で標識される。 PERC集めた生体粒子（群）の各々から回収STR対立遺伝子のentage証拠このタイプの生体粒子から得られることが期待される成功の様々な程度を示すために、各個々の画像上に設けられている。タッチDNAサンプルから回収された生体粒子は、主に死亡または瀕死のケラチノサイトであり、 図6および図7に見られるように、したがって立証STRプロファイルは、収集された各生体粒子から得られない。このシャツの襟のサンプルについて、STRプロファイルは、個々の生体粒子の14/20（70％）から入手し、15/20（75％）が生体粒子を凝集させた。しかし、回収された各プロファイルは、証明力の範囲である：個々の生体粒子プロファイルの百分の3から97までの対立遺伝子の回収と塊状生体粒子プロファイルの三から百パーセントの対立遺伝子の回復を。起因する成功率の変動に、各タッチのDNA項目から多数の生体粒子の収集が推奨されます。これは非常にprobatiを取得する良いチャンスを確実にSTRプロファイルをVEの。 シャツの襟から個々の生体粒子の試料の一つから得られたSTRプロファイルが図8に示されている（プロファイルが発信された生体粒子は、左側に示されている）。ほぼ完全なSTRプロファイル（30対立遺伝子のうち28、1つの遺伝子座が脱落し、基準プロファイルと比較することによって確認得られたプロファイルの精度）は、この個々の生体粒子を得た。得られたプロファイルは、合理的にバランスのとれた間座ピーク高さと高品質のものであり、全くの対立遺伝子が脱落しません。対立遺伝子が脱落すると、不平衡ピーク高アーチファクトが両方頻繁に低い鋳型DNA試料で観察される。シャツの襟から塊状生体粒子サンプルの一つから得られたSTRプロファイルが図9に示されている。完全なSTRプロファイル（30/30対立遺伝子、基準プロファイルと比較することによって確認得られたプロファイルの精度）を得た。前述のように、STRプロファイルがこれまでから回収されていないY生体粒子を収集。単一の生体粒子（3％の対立遺伝子の回復、1/30対立遺伝子）の不成功DNAプロファイリングの例を図10（個々の生体粒子）に示されている。この個々の生体粒子が成功しなかったが、このサンプル中の生体粒子のドナー性の高い証明力STRプロファイルは、同じサンプルから回収された他の生体粒子から得られた。これは、同じオブジェクトから複数の単セル/クランプサンプリングを実行する必要性を示している。 タッチのDNAの証拠のためにここで説明し開発された「スマート」の分析方法は、単一の証明力単一のソース·プロファイルを回復するために成功裏に使用されており、さまざまなからの「凝集」生体粒子は、オブジェクトや衣料品に触れた（ 例えば、椅子のアームレスト、車のステアリングホイール、携帯電話、コー​​ヒーカップ、タバコ、ペン、シャツ、ショートパンツ、そしてセーター）。しかし、重要なことに、このアプローチはまた、雄dは検出およびプロファイリングのために使用されているonorシミュレートされた物理的な接触/暴行混合試料中のDNA（シングルソース）（ 例えば、加害者、被害者の手首をつかんで、首や衣服、または性的暴行のように、被害者の寝具でお問い合わせください）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig1.jpg" /> 図1：生体粒子収集のためのゲルフィルムスライドの準備。 （A）白色裏面保護カバーは、接着裏当てを露出させるために、ゲルフィルムの一片から、滅菌ピンセットを用いて除去される。ゲルフィルムはその後しっかり圧力でガラス顕微鏡スライドに接着されている。（B）ゲルフィルム試料は、生体粒子の収集に使用する準備ができたら、上部透明な保護膜は、滅菌ピンセットを用いて除去される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig2.jpg" /> 図2：ゲルを用いた生体粒子コレクション種々の基材から-film。ゲルフィルムスライドは、種々の表面から生体粒子を収集するために使用することができる。ゲルフィルムを対象または対象の表面と直接接触して配置される。穏やかな圧力はゲルフィルムの表面に生体粒子を転送するために適用される。 （A）着用衣料品（コートカラー）からの生体粒子の集合体、（B）はオブジェクト（走行コーヒーカップ）、及び（C）直接人間の皮膚（男性の手首）に触れたが示されている。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig3.jpg" /> 図3：生体粒子（ズボンの脚の内側）着用衣類項目の生体粒子は、物体表面との直接接触を介してゲルフィルムに転写される。生体粒子は「塊」または（赤の矢印で示される）個人/シングル生体粒子として求めることができる。 <img<html> ALT =「図4「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg&quot; /&gt; 図4：ゲルフィルムスライド上の生体粒子の任意染色生体粒子のより良い視覚化のために、ゲルフィルム試料をトリパンブルー染色で染色することができる。ゲルフィルムの全面を、トリパンブルー（A）で覆われている。染色の1~2分後、スライドを静かに過剰染色スライド（B）に逃げることができるように傾斜している。滅菌水（C）で穏やかにフラッディングが過剰染色を除去するために使用することができる。スライドを空気乾燥させた後、スライドは、適切な染色（D、E）を確保するために顕微鏡下で観察することができる。すべてではない生体粒子が染色された（色はすなわち、青）が表示されます：注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> OAD / 52612 / 52612fig5.jpg &quot;/&gt; 図5：生体粒子の収集と分析。 （A）（「接着剤」）は、水溶性ウェーブはんだテープの少量（または「ボール」）は、穏やかな掻爬によりタングステン針の先端に収集される。（B）の接着剤は、その後ゲル状に接触さ関心の生体粒子を収集するためにフィルム表面。個々のまたは複数の生体粒子は、単一の接着剤ボールを回収することができる。（C）は 、所望の生体粒子が収集されたら、針の先端0.2mlのPCRチューブ中で増幅混合物内に配置される。それが溶解するまでニードルを液体に保持され、溶液中への生体粒子の放出が観察される。収集プロセスのすべてのステップが成功した生体粒子の収集と伝達を確実にするために実施し、顕微鏡下で観察されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig5large.jpg" target="_blank">LARを見るにはこちらをクリックしてください</a>この図のGER版。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig6.jpg" /> 図6：。シャツの襟試料中の個々の生体粒子生体粒子が男性ドナーが着用シャツの襟の内側から、ゲルフィルムを使用して回収した。生体粒子を、トリパンブルーを用いて染色した試料において同定さ20の異なる個々の生体粒子の画像が示されている。各画像において、収集された生体粒子を（;プロファイルは回収しなかった生体粒子を示す黒丸プロファイルが回収された生体粒子を示す赤い丸）丸で囲まれている。パーセント対立回復（可能な30のうち、観測された対立遺伝子の数）は、プロファイルが回収された元の生体粒子の画像の上に示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a><img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig7.jpg" /> 図7：シャツの襟試料中の凝集生体粒子生体粒子が男性ドナーが着用シャツの襟の内側から、ゲルフィルムを使用して回収した。。生体粒子を、トリパンブルーを用いて染色した試料において同定さ20の異なる塊状の生体粒子の画像が示されている。 。プロファイルが可能30のうち％の対立遺伝子の回復（観察された対立遺伝子の数）を回収しなかった生体粒子を示す黒丸;各画像において、収集された生体粒子は、プロファイルが回収された生体粒子を示す（赤い丸丸れるプロフィールを回収し、そこから各生体粒子のために示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図8：男性のシャツの襟からの単一の生体粒子から得常染色体STRプロファイル常染色体STRプロファイルは5μlの直接溶解/増幅反応を使用して（左に示す）は、単一の生体粒子から得られた。。このプロファイルの精度は、ドナー基準サンプルとの比較によって決定した。五常染色体STR遺伝子座およびアメロゲニン（性決定）は、単一の反応で共増幅およびキャピラリー電気泳動によって分離される。結果は、電気泳動図のようにここに表示されます。アレル数字は、各遺伝子座における各ピーク下の指定です。 x軸が表すフラグメントサイズ（塩基対、bp）を、y軸は信号強度を表す。（RFU相対蛍光単位;それぞれ対応する対立遺伝子の数の下で提供）を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig8highres.jpg" target="_blank">の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a><html>この図。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig9.jpg" /> 図9：男性のシャツの襟から塊状生体粒子から得られた常染色体STRプロファイル常染色体STRプロファイルは5μlの直接溶解/増幅反応を使用して（左に示す）凝集した生体粒子から得られた。。このプロファイルの精度は、ドナー基準サンプルとの比較によって決定した。五常染色体STR遺伝子座およびアメロゲニン（性決定）は、単一の反応で共増幅およびキャピラリー電気泳動によって分離される。結果は、電気泳動図のようにここに表示されます。アレル数字は、各遺伝子座における各ピーク下の指定です。 x軸が表すフラグメントサイズ（塩基対、bp）を、y軸は信号強度（;各対応する対立遺伝子の数に基づいて提供RFU相対蛍光単位）を表す。PG &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig10.jpg" /> 図10：収集された生体粒子から得られる常染色体STRプロファイルを得るための障害の例は、左側に示され、個々の生体粒子は、シャツの襟ゲルフィルム試料を採取した。 （右側に示す）を得られたSTRプロファイルから分かるように、（可能な30のうち）1つの対立遺伝子のみが得られた。アレル数字は、各遺伝子座における各ピーク下の指定です。 x軸は信号強度を表すフラグメントサイズ（塩基対、bp）を、y軸を表している。（RFU相対蛍光単位;それぞれ対応する対立遺伝子の数の下で提供）を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig10highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、の回復を可能にするために、一緒にワンステップ5μlのマイクロボリューム溶解/ STR増幅を含む強化された増幅プロトコルで、サンプル「DNA触れる」を中に存在するバイオ粒子の収集のために最適化され、効率的な除去戦略を説明短いタンデムリピート（STR）バイオ粒子ドナー（単数または複数）のプロファイル。

法医学インチタッチDNA」の証拠から簡体マイクロマニピュレーションにより回収する単一のヒト生体粒子の強化された遺伝解析

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

この手順の全体的な目的は、法医学的なタッチDNA証拠から、推定バイオパーティクルと呼ばれる個々の細胞または凝集した細胞を回収し、供与者のDNAプロファイルを得ることです。暴力犯罪の発生時、例えば加害者が被害者の手首を掴んだ際などに、少数の細胞が個人から別の個人へと転移します。まず、この少数の細胞を回収するために、顕微鏡スライドに貼付された低吸着ゲルフィルムを使用して接触領域をサンプリングします。第2ステップは、顕微鏡下での観察を容易にするために、転写した生物粒子を染色することです。次に、マイクロマニピュレーションを用いて、ゲルフィルムから生物粒子を分離します。タングステン針の先端に水溶性接着剤を採取し、それを用いてゲルフィルム表面から目的の生物粒子を取り除きます。最終ステップでは、個別に回収したバイオパーティクルをPCR回収容器の底にあるPCR増幅ミックスへと慎重に移します。最終的に、微量DNA証拠の供与者のDNAプロファイルを取得するために、強化されたDNAタイピング法が用いられます。私の研究室では、対人暴力犯罪の犯行時に、個人間、あるいは個人と物体の間で転移した少数の細胞の遺伝子解析に焦点を当てています。従来の法では、このような少数の細胞からDNAプロファイルを回収することができない場合が多くあります。ここでは、個々の細胞または細胞凝集体といったごく少数の細胞を物理的に回収し、遺伝子解析を行うための簡便な方法を開発しました。この方法は、あらゆる法医学研究所に導入することが可能です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるKatie Fairishが行います。まず、生体粒子を回収するために使用するゲルフィルムを準備します。固体支持体として使用するガラス製顕微鏡スライドガラスに適したサイズにゲルフィルムをカットします。例えば、3インチ×1インチのガラススライドを使用する場合は、2インチ×0.75インチのサイズのゲルフィルムを使用します。ゲルフィルムから白いバッキングシートを取り除き、完全に密着するようにしっかりと押し付けて、顕微鏡スライドにゲルフィルムを貼り付けます。透明な上部保護層があり、これを剥がさないことで、ゲルフィルム表面を汚染させることなくフィルムに沿って圧力をかけることができる点に注意してください。保護層が付いた状態で準備したゲルフィルムスライドは、使用時まで室温で保存可能です。ゲルフィルムを使用する際は、滅菌ピンセットを用いて透明な上部保護層を取り除いてください。その後、ゲルフィルム表面を目的の接触物体または表面に直接接触させます。例えば、手首の人間の皮膚などが挙げられます。バイオ粒子をゲルフィルムに効率的に転写させるため、軽く圧力をかけます。ガラススライドが破損する恐れがあるため、強く押し付けないでください。同一の対象物または表面から複数回のサンプリングを行い、同一のゲルフィルムに回収することが可能です。同様の手順で、シャツの襟などの物品や衣類からバイオ粒子を回収することもできます。バイオ粒子がゲルフィルム上に転送されたことを確認するため、透過照明または落射照明を用いて、実体顕微鏡でスライドを観察します。ゲルフィルムの広範囲を観察するには約20倍の倍率が適しており、個々のバイオ粒子を観察するには約200倍の倍率が適しています。ゲルフィルムのサンプルスライドは、蓋付きのスライドボックスに入れ、室温で保存してください。染色またはバイオパーティクルの回収を行うまで、可視化を容易にするためにバイオパーティクルを染色することができます。そのためには、まず前述の手順で準備したゲルフィルムサンプルスライドを、シンク上のスライド染色ラックに設置します。使い捨ての転送ピペットを使用して、ゲルフィルムの表面全体をトリパンブルー染色液で覆い、室温で1〜2分間インキュベートします。必要に応じて、スライドを傾けて余分な染色液をシンクに流し、除去します。使い捨て転送ピペットを用いて、滅菌水を緩やかに注ぐことでスライドを洗浄できます。スライドを自然乾燥させた後、実体顕微鏡で観察し、適切に染色されているかを確認します。染色済みのスライドは、蓋付きのスライドボックスに入れ、室温で保存できます。まず、適切な数の0.2 milliliter PCRチューブをラックに配置し、チューブに適切にラベルを貼ります。目的のサンプル数に合わせて、適切な量のSTR増幅ミックスを調製します。ボルテックスでマスターミックスを十分に混合し、ミニ遠心機で短時間遠心して液をまとめる。増幅用溶液3.5 µLを各0.2 mLチューブに分注し、各チューブのキャップを緩く閉める。ガラスブロックに両面テープを直接貼ります。これは、サンプル回収中に0.2 milliliterチューブを固定するために使用します。別の両面テープを、清潔なガラス製顕微鏡スライドガラスに貼ります。次に、水溶性のウェーブショルダーテープを両面粘着テープの上に貼り付けます。テープの長さに沿って圧力をかけ、テープを固定します。その後、上部の白い保護層を取り除きます。次に、ガラスブロック上の両面粘着テープの上に、最初の0.2 mLチューブを配置します。サンプルを回収するまで、このチューブはそのままにしておきます。水溶性ウェーブソルジャーテープスライドを顕微鏡の下に置き、低倍率で観察します。トングスタンドニードルの先端を使用して、テープの表面をそっと掻き取り、針の先に少量の粘着剤または粘着剤の塊を集めます。粘着剤の塊の大きさは、回収するバイオパーティクルの数によって異なります。注意深くトングを取り除きます。針の先端に触れないように注意しながら、粘着剤を付着させた針を顕微鏡下から取り出します。必要に応じて、針をラックに置きます。本手順において最も重要な点は、バイオ粒子の回収と転送です。確実に成功させるためには、分析者が習熟するまでこれらの技術を練習する必要があります。あらかじめ準備したゲルフィルムサンプルを、スライドを支持するためのガラスブロックを用いて顕微鏡ステージに設置します。バイオ粒子が容易に観察できるよう、焦点と倍率を調整してください。回収するバイオ粒子を特定します。接着剤ボールが付いたタングステン針を取り出し、目的のバイオ粒子が存在するゲルフィルム表面の上に針を配置します。針の先端を押し下げ、バイオ粒子に接触させます。バイオパーティクルが回収されたことを確認するため、ニードルを持ち上げます。目的の数のバイオパーティクルが回収されるまで、この操作を繰り返します。準備した0.2 milliliterのPCRチューブを顕微鏡ステージに設置します。増幅ミックスが入ったチューブの底部にピントが合うように倍率を調整します。顕微鏡で観察しながら、タングステン針の先端が増幅ミックスに届くまで、0.2 milliliter PCRチューブの中に慎重に挿入します。接着剤が溶解し、バイオ粒子が溶液中に放出されるのが観察されるまで、針を増幅ミックスの中に保持します。針を抜きます。0.2 milliliterチューブを直立させ、キャップを軽く締めます。タングステン針をアルコール綿で清拭し、追加のサンプルに対してこの採取手順を繰り返します。採取したバイオパーティクルの常染色体STRプロファイリングのための増幅強化プロトコルを開始するには、増幅ミックスとバイオパーティクルが入った各0.2 mLチューブに1.5 µLの溶解バッファーを加え、チューブの蓋をしっかりと閉めます。サンプルをサーマルサイクラーにセットし、プロトコル本文に記載されたサイクル条件を用いてサンプルを増幅させます。増幅が完了したら、キャピラリー電気泳動による検出を行うまで、増幅産物を4 °Cで保存してください。シャツの襟のサンプルにおける個々の生物粒子（bio particles）の代表画像は示されていません。回収された生物粒子を円で囲んでいます。赤色の円は、プロファイルが回収されたことを示しています。アレル回収率が記載されています。黒い円はプロファイルが回収されなかったことを示しています。同様に、これらの画像はシャツの襟のサンプルにおける凝集したバイオパーティクルのものであり、ここに示すのはシャツの襟から採取した個々のバイオパーティクルサンプルのうちの一つから得られたSTRプロファイルです。その精度は、リファレンスプロファイルとの比較によって決定されました。各遺伝子座の各ピークの下には、アレル番号が記載されています。x軸はフラグメントサイズを、Y軸は信号強度を表しています。このプロファイルは高品質であり、各ローカスのピーク高さが適切にバランスされており、アレル脱落も見られません。次のプロファイルは、シャツの襟から採取された凝集バイオパーティクル試料の一つから得られた完全なSTRプロファイルです。最後に、この図は、アレル回収率が3%であった単一バイオパーティクルのDNAプロファイリングに失敗した例を示しています。本手法は、身体的暴行事件における加害者の単一源DNAプロファイルの回収を促進すると考えられます。また、本手法は混合DNAプロファイルの解釈およびデコンボリューションに関連する問題の一部を解消することも、我々の注目するところとなっています。

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JoVE Journal

Biology

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学ぶ法医学タッチDNAからの単一生体粒子の回収と遺伝解析。低接着性ゲルフィルムとマイクロマニピュレーションを用いて微量証拠から高品質なDNAプロファイルを取得する効率的な手法です。

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