法医学インチタッチDNA」の証拠から簡体マイクロマニピュレーションにより回収する単一のヒト生体粒子の強化された遺伝解析

この手順の全体的な目標は、法医学的なタッチDNAの証拠から推定バイオ粒子と呼ばれる個々の細胞または凝集した細胞を回収し、ドナーのDNAプロファイルを取得することです。凶悪犯罪の遂行中に、加害者が被害者の手首をつかむときなど、少数の細胞が個人から別の個人に移されます。まず、少数の細胞を回収するために、顕微鏡スライドに付着した低接着ゲルフィルムを使用して接触領域をサンプリングします。

2番目のステップは、顕微鏡下で見やすくするために、転写された生体粒子を染色することです。次に、マイクロマニピュレーションを使用して、ゲルフィルムからバイオ粒子を分離します。タングステン針の先端に水溶性接着剤を採取し、それを使用してゲルフィルム表面から目的のバイオ粒子を除去します。

最後のステップは、個別に収集されたバイオ粒子を、PCRコレクションの下部にあるPCR増幅ミックスに慎重に移すことであり、最終的に強化されたDNAタイピング方法を使用して、微量DNA証拠のドナーのDNAプロファイルを取得するために使用されます。さて、私の研究室では、ある個人と別の個人の間、または個人と物体との間の、人に対する暴力犯罪の実行中に転送される少数の細胞の遺伝子分析に焦点を当てています。従来の方法では、このような少数の細胞からDNAプロファイルを回復できないことがよくあります。

ここでは、このような少数の細胞(個々の細胞または細胞の凝集体)の物理的回復と遺伝子解析のための簡略化された方法を開発しました。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるKatie Fairishです。この手順を開始するには、バイオ粒子の収集に使用するゲルフィルムを準備します。

ゲルフィルムを、固体支持体として使用するガラス顕微鏡スライドに適したサイズにカットします。たとえば、3 インチ x 1 インチのスライドガラスの場合は、2 インチ x 0.75 インチのゲル フィルム サイズを使用します。ゲルフィルムから白い裏地をはがし、ゲルフィルムを顕微鏡スライドにしっかりと押し下げて取り付け、完全に取り付けます。

ゲルフィルム表面を汚染することなくゲルフィルム片に沿って圧力を加えることができるように除去してはならない透明な上部保護層があることに注意されたい:保護層が取り付けられた調製されたゲルフィルムスライドは、必要になるまで室温で保存することができる。ゲルフィルムを使用する準備ができたら、滅菌ピンセットを使用して透明な上部保護層を取り除きます。ゲルフィルムの表面を、目的の接触物または表面に直接接触させて置きます。

たとえば、手首からの人間の皮膚。バイオ粒子をゲルフィルムに効率的に移動させるために、少量の圧力を加えます。スライドガラスが同じオブジェクトからの複数のサンプリングを壊す可能性があるため、圧力をかけすぎたり、表面を同じゲルフィルムに集めたりすることができます同様に、バイオ粒子は、シャツの襟などのオブジェクトや衣類から収集できます。

ゲルフィルムへの生体粒子の移動を確認するには、トランス照明またはエピ照明を使用して実体顕微鏡でスライドを調べます。ゲルフィルムのより広い領域を見るには約20倍、個々のバイオ粒子を見るには約200倍の倍率が最適です。ゲルフィルムサンプルスライドを室温で蓋付きのスライドボックスに保管します。

染色やバイオ粒子の回収の準備ができるまで、バイオ粒子を染色して視覚化に役立てることができます。これを達成するには、まず、前に示したように調製したゲルフィルムサンプルスライドを、シンクの上のスライド染色ラックに置きます。使い捨てのトランスファーピペットを使用して、ゲルフィルム表面全体をトライアンブルーステインで覆い、室温で1〜2分間インキュベートします。

スライドを傾けて余分な汚れを取り除き、必要に応じて汚れがシンクに排出されるようにします。スライドは、使い捨てのトランスファーピペットを使用して滅菌水で穏やかに水に浸すことですすぐことができます。スライドを乾燥させた後、実体顕微鏡を使用してスライドを観察し、適切な染色を確認します。

染色されたスライドは、蓋付きのスライドボックスに室温で保存できます。この手順を開始するには、適切な数の0.2 mL PCRチューブをラックにセットし、チューブに適切なラベルを貼ります。必要なサンプル数に対して、適切な量のSTR増幅ミックスを調製します。

ボルテックスとマスターはよく混合し、ミニ遠心分離機PIパスで短時間遠心分離します。3.5マイクロリットルの増幅。各0.2ミリリットルのチューブキャップに、各チューブをゆるく混ぜます。

両面粘着テープをガラスブロックに直接貼り付けます。これは、サンプル収集中に0.2ミリリットルのチューブを所定の位置に保持するために使用されます。別の両面粘着テープをきれいなガラスの顕微鏡スライドに置きます。

次に、両面粘着テープの上に水溶性のウェーブショルダーテープを置きます。テープの長さに沿って圧力をかけ、テープを所定の位置に固定します。その後、保護用の上部の白い層を取り外すことができます。

次に、最初の0.2ミリリットルのチューブをガラスブロックの両面粘着テープに置きます。サンプルが収集されるまで、このチューブを脇に置いておきます。水溶性ウェーブソルジャーテープスライドを顕微鏡下に置いて、低倍率で観察します。

舌立て針の先端を使用してテープの表面をそっとこすり、針の端にある少量または接着剤のボールを収集します。接着剤のボールのサイズは、慎重に収集するバイオ粒子の数によって異なります。舌を外す。

顕微鏡の下から接着剤で針を立て、針の先端を乱さないようにします。必要に応じて、針をラックに入れます。この手順の最も重要な側面は、バイオ粒子の収集と移送です。

成功を確実にするためには、アナリストがそれらに習熟するまでテクニックを実践する必要があります。スライドを支えるガラスブロックを使用して、事前に調製したゲルフィルムサンプルを顕微鏡ステージに置きます。バイオ粒子が見やすくなるまで、ピントと倍率を調整します。

収集されるバイオ粒子を特定します。粘着ボールでタングステン針を取り出し、目的のバイオ粒子が位置するゲルフィルム表面に針を置きます。針の先端を押し下げて、バイオ粒子に接触させます。

針を持ち上げて、バイオ粒子が収集されたことを確認します。必要な数のバイオ粒子が収集されるまで、このプロセスを繰り返します。準備した0.2ミリリットルのPCRチューブを顕微鏡ステージに置きます。

増幅ミックスが入ったチューブの底にピントが合うように倍率を調整します。顕微鏡で観察しながら、タングステン針を0.2ミリリットルのPCRチューブに慎重に挿入し、針の先端が増幅ミックスに入るまで待ちます。接着剤が溶解し、溶液中のバイオ粒子の放出が観察されるまで、増幅混合物に針を保持します。

針を外します。0.2ミリリットルのチューブを直立させ、ゆるくキャップします。事前に湿らせたアルコールワイプでタングステン針を洗浄し、追加のサンプルについてこの収集手順を繰り返します。

回収したバイオ粒子の常染色体STRプロファイリングのための強化増幅プロトコルを開始するには、増幅ミックスを含む各0.2ミリリットルのチューブに1.5マイクロリットルの溶解バッファーを追加し、バイオ粒子がチューブの蓋をしっかりと閉じます。サンプルをサーマルサイクラーに入れ、増幅が完了したら、プロトコルテキストで説明されているサイクリング条件を使用してサンプルを増幅します。キャピラリー電気泳動による検出の準備が整うまで、増幅生成物を摂氏4度で保管します。

シャツの襟サンプル中の個々のバイオ粒子の代表的な画像は示されていません。収集されたバイオ粒子は丸で囲まれています。赤い円は、プロファイルが回復されたことを示します。

対立遺伝子の回復率が含まれています。黒い円は、プロファイルが回復されなかったことを示します。同様に、これらの画像は、シャツの襟のサンプル中の凝集したバイオ粒子のものであり、ここに示されているのは、シャツの襟からの個々のバイオ粒子サンプルの1つから得られたSTRプロファイルです。

その精度は、参照プロファイルとの比較によって決定されました。対立遺伝子番号は、各遺伝子座の各ピークの下に指定されています。x 軸はフラグメントサイズを表し、Y 軸は信号強度を表します。

このプロファイルは高品質で、遺伝子座間のピーク高さが適度にバランスされており、対立遺伝子のドロップアウトはありません。この次のプロファイルは、シャツの襟から凝集したバイオ粒子サンプルの1つから得られた完全なSTRプロファイルです。最後に、この図は、対立遺伝子が3%回復した単一のバイオ粒子のDNAプロファイリングが失敗した例を示しています。

この方法は、身体的暴行事件の加害者からの単一ソースDNAプロファイルの回復を促進するはずです。この方法が、混合DNAプロファイルの解釈とデコンボリューションに関連する問題の一部も取り除くことは、私たちの注意を逃れません。