全身細菌感染や免疫防御表現型

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエ、メラノガスターに堅牢で再現性のある細菌感染を送達し、その後、感染の重症度を測定し、宿主の免疫応答を定量化することです。これは、まずナノインジェクターを使用して細菌感染をハエに送達することによって達成されます。感染後の死亡率は、感染後の経時的な追跡が可能で、感染したハエを均質化し、存在する細菌の数を測定することで、任意の時点で全身の細菌量を測定できます。

宿主の免疫防御は、抗菌ペプチド遺伝子の発現レベルを測定することによっても定量化でき、最終的には細菌感染の定量化と特性評価が可能になります。ショウジョウバエでは、メラノガスターを使用して、遺伝的および環境的要因がハエの免疫能力をどのように変化させるかを試験することができます。この方法は、宿主の遺伝的および環境的要因が免疫能力にどのように影響するか、またはそれらの感染において異なる細菌がどのように変化するかなど、昆虫免疫の分野で重要な問題に対処するために使用できます キネティクス、私たちはこの方法を使用して、細菌感染に対するショウジョウバエメラノガスターの免疫防御を測定していますが、他の昆虫にも適用でき、ウイルスや真菌などの他の種類の病原体を利用することができます。

この方法を初めて学んだときに人々が経験する一般的な問題は、ハエに過度の怪我を負わせる可能性があり、その結果、コントロールでも死亡率が過度に高くなる可能性があることです。この方法を視覚的に示すことは、ハエへのダメージを最小限に抑えて感染を行う方法を学ぶために重要です。私たちの宿主種であるoph melanogasterは非常に小さいため、感染は顕微鏡下で行わなければならず、技術の初期の複雑さが増します。

しかし、この技術を少しでも実演することで、ハエの経験が浅い科学者でも利用できるようになると考えています。実験を開始するには、事前に調製したマスタープレートから1つのコロニーを選択し、滅菌培地のフラスコに接種します。バクテリアを摂氏37度で一晩成長させて固定相にします。

培養物が固定相に達したら、600マイクロリットルの培養物から細胞を卓上遠心分離機で3分間、5, 000回穏やかにペレット化します。G、次にレナとレサスを捨てます。細菌を1000マイクロリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはPBSに懸濁します。

次に、再懸濁した細胞を滅菌PBSで希釈して目的の600ナノメートルの吸光度を達成し、この懸濁液を使用してハエに感染させます。借りたケイ酸塩ガラスキャピラリーを引っ張ってガラス針を準備し、鉗子を使用して針の先端を切断して直径50マイクロメートルの開口部を作ります。次に、天井のOリングと大きなディンプルが外側を向くように白いスペーサーをインジェクターの金属製プランジャーに配置します。

30ゲージの針が付いた注射器を使用して、ガラス針に鉱物油を入れます。次に、充填されたガラス針をコレットに通し、大きなOリングを針の鈍い端から1ミリメートルのベースの周りに配置します。針を金属製のプランジャーにスライドさせ、コレットが固定されるまでそっとねじ込みます。

インジェクターから鉱油を排出し、針に少量のオイルを残して、インジェクターと細菌懸濁液の間のバリアとして機能します。鉱油、細菌懸濁液、または2つの液体の間に気泡がないことを確認してください。次に、インジェクターを注入に必要な容量に設定します。

キャピラリーニードルの先端を滅菌PBSのチューブに慎重に挿入し、インジェクターの充填ボタンを押してインジェクター針を充填し、創傷コントロールを生成します。腹側側面の前方腹部に滅菌PBSを麻酔したハエを注射し、注入したハエを新しい培地の入った新鮮なバイアルに入れ、バイアルを横にしてハエが麻酔から回復する前に食べ物にくっつくのを防ぎます。次に、残りの滅菌培地をインジェクターから排出し、同じ針に細菌懸濁液を補充します。

手順を繰り返し、ハエに細菌懸濁液を注入します。あるいは、敗血症のピン刺しによって感染を進行させることもできます。感染ピンを準備するには、200マイクロリットルのマイクロピペットチップの端を溶かし、0.15ミリメートルの昆虫ムニューチンピンを溶融プラスチックに挿入します。

プラスチック麻酔薬から伸びる0.5センチメートルのピンでピンが所定の位置に保持されるようにプラスチックを固化させます二酸化炭素でハエを刺し、針で胸部の胸骨胸膜プレートにハエを刺し、翼と脚の取り付け部位を避けます。柔らかい鉗子を使用して、細部のピンからハエを取り除きます。各フライを刺す間にピンを細菌の懸濁液に浸してください。

刺したハエを新しいバイアルに入れ、新しいフライミウムをバイアルを横に置き、すべてのハエが麻酔から回復するまで待ちます。感染したハエの一部を氷上の個々のマイクロ遠心チューブに入れます。各チューブに250マイクロリットルのPBSを追加し、乳棒を使用してハエを均質化します。

次に、スパイラルプラターを使用してLBエアレーション上にホモジネートをプレート化します。あるいは、ホモジネートを段階希釈でプレートする方法もあります。各ハエの均質化を96の最初の行に移します。

ウェルプレートを作成し、残りの列の各ウェルにマルチチャンネルピペットを使用して90マイクロリットルのPBSを充填します。ハエのホモジネートを含む最初の行から10マイクロリットルを取り出し、ホモジネートを2番目の行に分注します。ホモジネートを完全に混合するために、少なくとも10回上下にパイプでつなぎます。

次に、10マイクロリットルのホモジネートを取り、それを次の列に移します。残りの行を一番下の行から開始して、この手順を繰り返します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから10マイクロリットルを取り出し、LBプレートに堆積します。

サンプルが互いに接触しない個別のスポットとして分注されていることを確認してください。各列からすべてのウェルがサンプリングされるまでこの手順を繰り返し、LBプレート上で希釈の降順で分注します。どちらのめっき方法を使用する場合でも、プレートが大きくなりすぎないように注意して、コロニーが小さく目立たないように注意してください。

インキュベーターからプレートを取り外します。実験細菌が目に見えるコロニーを成長させると、ショウジョウバエのコロニーの前に、腸内細菌叢は約24時間後にスパイラルプレートで見えるようになります。プレート上のコロニーの数と位置に基づいてホモジネートのミリリットルあたりの細菌量を推定できる自動コロニーカウンターを使用して、成長するコロニーをカウントします。

スポットプレートの場合、30〜300のコロニーを含む希釈から各フライのコロニーを手動でカウントし、元のホモジネートのミリリットルあたりの細菌の数を計算します。ハエには、さまざまな光学密度をカバーする50ナノリットルの細菌懸濁液を注入し、直ちに均質化してめっきした感染線量は、注射に使用した細菌懸濁液の光学濃度によって異なります。初期細菌負荷は、注入された初期ODと強く相関しています。

このプロトコルにより、さまざまな種類の感染症を観察することができます。ハエはプロビデンシア・レイに感染しており、これは20日以上持続する慢性的な亜致死性感染症を引き起こす可能性があります。大腸菌に感染したハエは、6時間以内に感染を解消します。感染後。

免疫系の誘導は、RNA単離とそれに続く抗菌ペプチド転写産物のQ rtpcr Rによって類似的に推定できますが、抗菌ペプチドの制御下でGFPを発現するハエの量的には少なくなります。遺伝子プロモーターは、習得すると免疫系の誘導を視覚化するために使用できます。この技術により、1時間あたり数百匹のハエを感染させることができます。

ハエが感染した後、ハエの表現型は、フィティの学習能力、代謝状態、または想像できるほぼすべての他の特性を含む、おそらくいくつでも測定できます。このビデオを見れば、ショウジョウバエやメラノガスターに堅牢で再現性のある細菌感染を送達する方法、そしてその後に感染の重症度を測定し、宿主の免疫応答を定量化する方法について、十分に理解できるはずです。特定の細菌が人間の健康リスクを引き起こす可能性があることを忘れないでください。

適切なバイオセーフティー手順が守られ、感染したハエが逃げないように適切な封じ込め措置が講じられていることを確認してください。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。