Name: 全身細菌感染や免疫防御表現型キイロショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ 細菌感染法と免疫応答測定法をDrosophila melanogasterで。ナノインジェクターや抗菌ペプチド遺伝子発現解析により、感染重症度と宿主防御を定量化し、昆虫免疫学の研究に応用できます。

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私たちは、これらのプロトコルのレビューとテストの両方において、彼らの助けに対して、ラザロラボ全体、特にスーザン・ロッツシェーファーに感謝したいと思います。これは、彼らの蓄積された専門知識の産物です。Lazaro 研究室での研究は、米国国立衛生研究所からの助成金 R01 AI083932 と R01 AI064950 によってサポートされています。

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どの著者も、競合する利益や相反する利益を持っていません。

ここで説明する手順は、 キイロショウジョウバエの厳格な、高品質の感染をもたらします。図示の例は、主にプロビデンシアrettgeriとEでの感染に焦点を当て大腸菌が、プロトコルは、高度に適応可能であり、ホストの飼育および維持条件の範囲に亘って多様な細菌の感染に適用することができます。 最適な実験的アプローチの詳細については、感染のために使用される細菌は、宿主の遺伝子型、および全体的な実験条件に依存するであろう。それは強く、新しい実験条件より野心的なプロジェクトを開始する前に、パイロットテストに推奨されます。出発点は、100倍の範囲にわたって3感染用量を試験することです。フライあたり100細菌細胞 - 高病原性の病原体は、多くの場合、最善の10程度で、非常に低い感染量で導入されます。より穏やかな病原体は、FLあたり約1,000の細菌の高用量で注入することができますyおよび非病原体フライ10,000細菌などの高用量で注射することができます。これは、縦方向の時系列の上に病原体負荷、ホストの死亡率、および免疫系の活動を追跡することによって、新たな感染症の動態を定義することがしばしば有益です。病原体負荷および宿主遺伝子発現の測定は、破壊的なアッセイであるので、測定されるすべての時点について、実験の開始時に異なるハエに感染することが必要です。 針を刺しまたはマイクロキャピラリーベースの注入を使用するかどうかを決定する際には、各アプローチには利点と制限があります注意することが重要です。キャピラリー注入は両方が適度膨圧を増加させ、担体中に懸濁または溶解された塩またはその他の分子を導入するハエへの液体の量を導入します。キャピラリー注射も注入設備や必要な機器の購入にアクセスする必要があります。浄化槽の針を刺しは、特別な機器や紹介を必要としません無視できる程度のフライにメディア、一般的にハエを​​大量に感染させるための、より効率的です。しかし、針で刺す感染症は、毛細管注入で達成することができる感染量を正確に制御することはできません。本プロトコルは、機械的に注入量を調節する噴射装置に焦点を当てたが、加圧された空気の離散パルスに基づいて噴射システムも存在する。20,21、これらは一般的に装置は、ここで紹介さよりも高価であり、それぞれの空気パルスのキャリブレーションを必要とします一貫性の注入量を確保するために、針。 ハエは、野生での細菌と全身感染する方法にかなりの議論が、非常に少ないデータがあります。一部の研究者は、 ショウジョウバエの病原性細菌を摂取するとき、自然感染の大部分が発生し、細菌が、その後全身感染を確立するために、腸を脱出することができることを断定します。しかし、非常にFEがありますD.の腸を横断できることが知られている細菌のw ショウジョウバエ 、およびこの能力を持っているものは、ハエ22,23に対して非常に致死的です。代替理論は、定期的に失敗した捕食試行または外部寄生虫ダニによる攻撃からの脱出を介してクチクラ負傷飛ぶことです。この仮説は、野生Dの頻繁なコレクションでサポートされていますメラノ治癒創傷（未発表の観察）の指標であるメラニンのスポットを有します。ダニは、 ショウジョウバエ 24で細菌感染を送信することが示されており、ダニが残した傷は二ミツバチ25中の細菌に感染することができます。しかし、Dのダニ·ドリブンまたはその他の日和見感染症の自然の中で、周波数キューティクルの侵害を介してメラノは知られていません。ここで説明するプロトコルは、直接、任意の上皮障壁または行動IMMUをバイパスし、定量注入による血リンパへの細菌の導入を可能にします無限大。 Dに病原性細菌を供給するための方法ショウジョウバエは Vodovar ら 22及びNehme ら 23に記載されています。 多くの昆虫病原性細菌は、研究者が快適に彼らと一緒に作業できるように、ほとんど、あるいは全く人間の健康上のリスクをもたらします。また、非常に少数の細菌が実験介入なしに接触したショウジョウバエに感染する能力、その汚染された表面を介して実験室を介して細菌感染の「流行」の広がりの危険性を持っているか、一般的に非常に低いハエを脱出しました。それにもかかわらず、適切な封じ込め対策が逃げるの感染ハエを防ぐために、所定の位置に、任意のハエを免れ奪還するためのものであることを保証することをお勧めします。研究室では、使用されている病原体のそれに見合った生物学的に安全なレベルで装備されるべきであり、微生物学における標準的なベストプラクティスを採用すべきです。 実験infectiここに記載の方法に任意の細菌のいずれかの用量でキイロショウジョウバエの感染を可能にします。感染が確立されると、それは、細菌の増殖またはクリアランスの速度を測定するために宿主の死亡率を追跡するため、および宿主免疫系の誘導をアッセイすることは簡単です。感染したハエは、容易に形作るか、または感染によって成形することが生理学的機能の試験を含む他の表現型アッセイにかけることができます。記載された手順は、安価で比較的少ない特殊な装置を必要とし、容易に研究と教育ラボの幅全体で多様なプロジェクトでの使用に適して作り、学習されます。

フルーツフライ、キイロショウジョウバエは、免疫防御の機能と進化を研究するための最高のモデル生物の一つである。 ショウジョウバエ 、安価で、背面に簡単で、実験操作に非常に適している、と幅広いを開発した大規模な科学コミュニティが付いています研究ツールの配列。 Toll様受容体によって媒介されるシグナル伝達およびNF-kBのファミリー転写因子、JAK / STATシグナル、およびJNK経路の応答を含む、昆虫、哺乳類間で保存されている自然免疫の多くの側面。1,2これらの遺伝子および経路の機能することができますDに照会しますショウジョウバエの変異を使用して、またはRNAiは、その増減経路活動をノックダウン3 - 。さらに6、 ショウジョウバエは、進化の生活史理論の文脈を含め、感染および疾患の生理学的結果を研究するために使用することができます7。- 9すべてのこのような研究は、しかし、確実に定義された処理条件の下で実験的なハエに感染する能力に依存します。ここで説明する手順は、 キイロショウジョウバエに堅牢かつ反復細菌感染を配信し、その後、感染の重症度を測定し、宿主免疫応答を定量化するための方法論的枠組みを提示します。 ショウジョウバエは、天然及び実験細菌、真菌、ウイルス、線虫および寄生蜂の寄生生物および病原体を含む多種多様なにより感染され得ます。現在のプロトコルは、全身細菌感染を提供することに焦点を当てています。多くの異なる細菌は、ハエに感染させるために使用することができ、実験者の選択が求められている正確な科学的質問に基づくべきです。例えば、ヒトの臨床分離株は、細菌の病原性機構10を研究するために使用され得る、または生態学的に関連する分離株はpreferreであってもよいです進化の研究のためのD。11一部の細菌は、Dの有能な病原体でありますショウジョウバエ、感染時に増殖し、ホスト病気や死を引き起こします。他の細菌は、効果的に宿主の免疫系によって管理され、数日以内にクリアされます。このデモでは、 プロビデンシアrettgeriは、ホストの死亡率の原因となり、ホストの存続に固執することができる増殖性病原体として使用されます。 大腸菌は、宿主免疫系によってクリアされた非病原体として使用されます。 感染は直接ハエの体腔内への細菌の導入によって確立されます。このアプローチは関係なく、変速機の固有モードの全身感染の調査を可能にする、上皮障壁や防御行動をバイパスします。実験的に全身感染を確立するための2つの主要な方法があります。最初にナノインジェクタと引っ張らガラスキャピラリ針の正確な数を注入するために使用されハエへの細菌。この方法は、感染用量の大きなダイナミックレンジを可能にし、定量的に高度に反復可能であるという利点を有します。第2のアプローチは、敗血症性針を刺したの感染を提供することです。この手法は、迅速であり、かつ特別な装置を必要としないという利点を有します。感染が確立されると、それは全身の病原体負荷、ホスト死亡率、および誘導性免疫系の活性を測定することが可能となります。もちろん、追加の表現型の任意の数の考えられる感染D.で測定することができ感染後の産卵数12、学習能力13、代謝状態14、または想像することができ、実質的に任意の他の形質を含むメラノ 。

<table><tbody><tr><td>インキュベーター</td><td>パワーズ サイエンティフィ</td>ック <td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 フライパッド</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエ飼育ミックス&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6オンスの正方形の底のボトル、ポリプロピレン</td>ジェ<td>ネシーサイエンティフィック</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>ノステリル特大コットンボール</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22-456-882</td><td></td></tr>顕微鏡オ<tr><td></td><td>リンパスコーポレーション</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアルポリスチレン</td><td>VWRインターナショナル</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>ノステリラージコットンボール</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>2 Lフラスコ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ、クリアリッド付き、隆起したリッジ; 100 x 15 mm;</td><td>VWRインターナショナル</td><td>25384-302LB</td><td></td></tr><tr><td>寒天、ミラー</td><td>ディフコ</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>イノキュリングループ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>80094-488さまざまな</td><td></td></tr><tr><td>サイズのレイニンクラシックピペット 0.1 &micro;lから2&マイクロ;L、 2 & マイクロ;lから20&micro;L, 20 & マイクロ;lから200&micro;L, 100 & マイクロ;lから1,000&micro;l</td><td>レイニン</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ(アソートサイズ)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbitalシェーカー</td><td>VWR インターナショナル</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>VWR インターナショナル</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 分光光度計</td><td>バイオ・ラッド</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>半微量キュベット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>垂直キャピラリープーラー</td><td>Kopf ニードルNanojet II用ピペットプーラー3.5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インチ交換用ガラスキャピラリー</td><td>ドラモンドSientific Company</td><td>3-000-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 mlシリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油、白、ライト</td><td>マクロンファインケミカル</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>ミニッツピン</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml&nbsp;マイクロ遠心チューブ;シールライトUSA</td><td>サイエンティフィック社</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>電動乳棒;Talboys実験室スター</td><td>ラーTroemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboysハイスループットホモジナイ</td><td>ザーOPS診断</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32 '' 研削ボール</td><td>OPS診断</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific industries株式会社</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペッター(10 &mu;l - 300 &mu;l)</td><td>ザルトリウス</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 ホイットリー自動スパイラルプラター</td><td>微生物学国際</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL自動コロニーカウンター/プレートカウンター/プレートリーダー&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>qPCRチューブ;ロープロファイル 0.2 ml 8 チューブストリップ</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>qPCR キャップ;オプティカルフラット 8 キャップストリップ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 逆転写酵素</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect リアルタイム PCR 検出システム</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

全身細菌感染や免疫防御表現型<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

果実はキイロショウジョウバエは、免疫防御の機能と進化を研究するための最高のモデル生物の一つで飛びます。自然免疫の多くの側面は、昆虫および哺乳動物の間で保存され、 ショウジョウバエを容易に遺伝的および実験的に操作することができるので、それらは免疫系の機能と疾患の生理学的影響を研究するための強力です。ここで実証された手順は、上皮障壁と防衛のより受動的な形態をバイパスし、全身感染にフォーカスを可能にする、直接体腔内に細菌を導入することによってハエの感染を可能にします。手順は、ホストの死亡率、全身病原体負荷、および宿主免疫系の誘導の程度の測定速度のためのプロトコルを含みます。この感染手順は、安価で堅牢で再現性がある定量的、および機能的遺伝学、進化の生活史、および生理学の研究に使用することができます。

このセクションでは、1感染用量を注入するために使用される細菌懸濁液の光学濃度に応じて変化することを示す図 。キイロショウジョウバエの細菌感染後に得られる結果を示しており、確実に均質化し、めっきすることによって推定することができる送達用量は、注射直後に飛ぶこと。 図2に示すように、異なる病原体は、宿主の死亡率（ 図2A）の異なるレベルを引き起こすことができ、宿主の死亡率は、用量依存的（ 図2B）とすることができます。重要なのは、このプロトコルは、達成すべき感染症の様々なタイプを可能にする： プロビデンシアrettgeriは 20日以上（ 図3A）持続する慢性、亜致死感染を引き起こす可能性があります。しかし、Escerichiaコリのような他の細菌は、ほとんどが6時間後に感染（ 図3B）内のホストフライによってクリアされます。免疫SYSの誘導TEMは、抗菌性ペプチド転写物（ 図4AおよびB）のRNAの単離およびその後の定量RT-PCRによって推定することができます。同様あまり定量的、免疫系（ 図4C）の誘導を可視化するために使用することができる抗菌ペプチド遺伝子プロモーターの制御下でGFPを発現するハエ。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> 。図1：感染量を決定するハエは、光学密度（0.0001から0.05）の範囲をカバーする細菌懸濁液の50 NLを注射しました。ハエは、すぐに注射によって導入細菌の数を決定するために、均質化し、プレーティングしました。初期の細菌負荷が強く、初期ODが注入さと相関した（r 2 = 0.96） <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt;図2：生存細菌性病原体の注射後には5〜7日齢の雄は、細菌懸濁液または滅菌媒体のいずれかの50 NLを注射し、生存をモニターしました。 （A）野生型のハエは、3つの異なる種のいずれかからの約5,000の細菌を注射しました。ホストの死亡率は、感染のために使用細菌種に大きく依存します。 50、500、およびフライ5,000細菌- （B）野生型のハエは、3つの異なるEnterococcousフェカリスの投与量を注射しました。免疫系の変異体およびその野生型同質遺伝子の制御線は約500 セパシア菌を注射した高い感染量（C）に感染したときにハエがより早く死にます。ペアごとのログランク比較は、野生型のハエは、変異体よりも有意に良好感染（χ2 = 59.02、DF = 1、P &lt;0.0001）が生き残っていることを示しています。 図3：注入後の細菌負荷ハエは約（A）5,000 P.注射しましたrettgeri（B）3,400 E.大腸菌 。細菌負荷は、注射直後及びその後の様々な時点で測定しました。各データ点は、単一のハエの細菌負荷を表す。E. P.ながらコリを速やかに挑戦ホストからクリアされますrettgeriは、ホストの人生の残りのために持続します、。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> 図4：注射後の免疫遺伝子発現の誘導 。 （A）ハエはP. 50 NLを注射しました腹部や胸部のいずれかでrettgeriまたは滅菌PBS、 またはCOは別に操作されていない残っていました<s&gt; 2麻酔UB。六時間の感染後、ハエ遺伝子は定量RT-PCRを用いて決定したDiptericinのRNAの単離および発現のために収集しました。 （A）の発現レベルは、Diptericinの比としてrp49転写物に転写物をグラフ化し、N（CO 2制御をバーは、各条件の比率の平均値と標準誤差を表す1の発現レベルを有するとして定義されるようにスケーリングされ= 4）。 （B）発現レベルは、標準的な非誘導条件としてCO 2 aesthesia制御ハエからの平均C T値との2ΔΔCTとしてグラフ化されています。バーは、各条件からΔΔCTの平均値と標準誤差を表す（N = 4）。による注射部位への転写誘導に差がないが、パネルAおよびBの比較は、ΔΔCT法は、潜在的に誘導レベルを過大評価する方法を示しています。 （Cは）Diptericin Aプロモーターの制御下でGFPを発現しているハエは、Pの50 NLを注射しましたその後rettgeri（OD = 0.1）および7日後に画像化しました。 GFPパネルはDiptericinの活性化細菌に感染したハエ中のプロモーターではなく、メディアを注射のコントロールを示し、感染したハエの腹部脂肪体におけるGFPの発現を示します。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 遺伝子 </td><td> フォワード </td><td> リバース </td></tr><tr><td> rp49（もrpL32呼ばれます） </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> デフェンシン </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> 表1：定量RT-PCRのためのプライマー。

Drosophila melanogasterは、自然免疫系と感染や病気の生理学的影響を研究するための優れたモデル生物です。このプロトコルでは、堅牢で定量的に再現性のある細菌感染をD. melanogasterに送達する方法、およびその後に感染の重症度を測定し、宿主の免疫応答を定量化する方法について説明します。

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエ、メラノガスターに堅牢で再現性のある細菌感染を送達し、その後、感染の重症度を測定し、宿主の免疫応答を定量化することです。これは、まずナノインジェクターを使用して細菌感染をハエに送達することによって達成されます。感染後の死亡率は、感染後の経時的な追跡が可能で、感染したハエを均質化し、存在する細菌の数を測定することで、任意の時点で全身の細菌量を測定できます。宿主の免疫防御は、抗菌ペプチド遺伝子の発現レベルを測定することによっても定量化でき、最終的には細菌感染の定量化と特性評価が可能になります。ショウジョウバエでは、メラノガスターを使用して、遺伝的および環境的要因がハエの免疫能力をどのように変化させるかを試験することができます。この方法は、宿主の遺伝的および環境的要因が免疫能力にどのように影響するか、またはそれらの感染において異なる細菌がどのように変化するかなど、昆虫免疫の分野で重要な問題に対処するために使用できます キネティクス、私たちはこの方法を使用して、細菌感染に対するショウジョウバエメラノガスターの免疫防御を測定していますが、他の昆虫にも適用でき、ウイルスや真菌などの他の種類の病原体を利用することができます。この方法を初めて学んだときに人々が経験する一般的な問題は、ハエに過度の怪我を負わせる可能性があり、その結果、コントロールでも死亡率が過度に高くなる可能性があることです。この方法を視覚的に示すことは、ハエへのダメージを最小限に抑えて感染を行う方法を学ぶために重要です。私たちの宿主種であるoph melanogasterは非常に小さいため、感染は顕微鏡下で行わなければならず、技術の初期の複雑さが増します。しかし、この技術を少しでも実演することで、ハエの経験が浅い科学者でも利用できるようになると考えています。実験を開始するには、事前に調製したマスタープレートから1つのコロニーを選択し、滅菌培地のフラスコに接種します。バクテリアを摂氏37度で一晩成長させて固定相にします。培養物が固定相に達したら、600マイクロリットルの培養物から細胞を卓上遠心分離機で3分間、5, 000回穏やかにペレット化します。G、次にレナとレサスを捨てます。細菌を1000マイクロリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはPBSに懸濁します。次に、再懸濁した細胞を滅菌PBSで希釈して目的の600ナノメートルの吸光度を達成し、この懸濁液を使用してハエに感染させます。借りたケイ酸塩ガラスキャピラリーを引っ張ってガラス針を準備し、鉗子を使用して針の先端を切断して直径50マイクロメートルの開口部を作ります。次に、天井のOリングと大きなディンプルが外側を向くように白いスペーサーをインジェクターの金属製プランジャーに配置します。30ゲージの針が付いた注射器を使用して、ガラス針に鉱物油を入れます。次に、充填されたガラス針をコレットに通し、大きなOリングを針の鈍い端から1ミリメートルのベースの周りに配置します。針を金属製のプランジャーにスライドさせ、コレットが固定されるまでそっとねじ込みます。インジェクターから鉱油を排出し、針に少量のオイルを残して、インジェクターと細菌懸濁液の間のバリアとして機能します。鉱油、細菌懸濁液、または2つの液体の間に気泡がないことを確認してください。次に、インジェクターを注入に必要な容量に設定します。キャピラリーニードルの先端を滅菌PBSのチューブに慎重に挿入し、インジェクターの充填ボタンを押してインジェクター針を充填し、創傷コントロールを生成します。腹側側面の前方腹部に滅菌PBSを麻酔したハエを注射し、注入したハエを新しい培地の入った新鮮なバイアルに入れ、バイアルを横にしてハエが麻酔から回復する前に食べ物にくっつくのを防ぎます。次に、残りの滅菌培地をインジェクターから排出し、同じ針に細菌懸濁液を補充します。手順を繰り返し、ハエに細菌懸濁液を注入します。あるいは、敗血症のピン刺しによって感染を進行させることもできます。感染ピンを準備するには、200マイクロリットルのマイクロピペットチップの端を溶かし、0.15ミリメートルの昆虫ムニューチンピンを溶融プラスチックに挿入します。プラスチック麻酔薬から伸びる0.5センチメートルのピンでピンが所定の位置に保持されるようにプラスチックを固化させます二酸化炭素でハエを刺し、針で胸部の胸骨胸膜プレートにハエを刺し、翼と脚の取り付け部位を避けます。柔らかい鉗子を使用して、細部のピンからハエを取り除きます。各フライを刺す間にピンを細菌の懸濁液に浸してください。刺したハエを新しいバイアルに入れ、新しいフライミウムをバイアルを横に置き、すべてのハエが麻酔から回復するまで待ちます。感染したハエの一部を氷上の個々のマイクロ遠心チューブに入れます。各チューブに250マイクロリットルのPBSを追加し、乳棒を使用してハエを均質化します。次に、スパイラルプラターを使用してLBエアレーション上にホモジネートをプレート化します。あるいは、ホモジネートを段階希釈でプレートする方法もあります。各ハエの均質化を96の最初の行に移します。ウェルプレートを作成し、残りの列の各ウェルにマルチチャンネルピペットを使用して90マイクロリットルのPBSを充填します。ハエのホモジネートを含む最初の行から10マイクロリットルを取り出し、ホモジネートを2番目の行に分注します。ホモジネートを完全に混合するために、少なくとも10回上下にパイプでつなぎます。次に、10マイクロリットルのホモジネートを取り、それを次の列に移します。残りの行を一番下の行から開始して、この手順を繰り返します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから10マイクロリットルを取り出し、LBプレートに堆積します。サンプルが互いに接触しない個別のスポットとして分注されていることを確認してください。各列からすべてのウェルがサンプリングされるまでこの手順を繰り返し、LBプレート上で希釈の降順で分注します。どちらのめっき方法を使用する場合でも、プレートが大きくなりすぎないように注意して、コロニーが小さく目立たないように注意してください。インキュベーターからプレートを取り外します。実験細菌が目に見えるコロニーを成長させると、ショウジョウバエのコロニーの前に、腸内細菌叢は約24時間後にスパイラルプレートで見えるようになります。プレート上のコロニーの数と位置に基づいてホモジネートのミリリットルあたりの細菌量を推定できる自動コロニーカウンターを使用して、成長するコロニーをカウントします。スポットプレートの場合、30〜300のコロニーを含む希釈から各フライのコロニーを手動でカウントし、元のホモジネートのミリリットルあたりの細菌の数を計算します。ハエには、さまざまな光学密度をカバーする50ナノリットルの細菌懸濁液を注入し、直ちに均質化してめっきした感染線量は、注射に使用した細菌懸濁液の光学濃度によって異なります。初期細菌負荷は、注入された初期ODと強く相関しています。このプロトコルにより、さまざまな種類の感染症を観察することができます。ハエはプロビデンシア・レイに感染しており、これは20日以上持続する慢性的な亜致死性感染症を引き起こす可能性があります。大腸菌に感染したハエは、6時間以内に感染を解消します。感染後。免疫系の誘導は、RNA単離とそれに続く抗菌ペプチド転写産物のQ rtpcr Rによって類似的に推定できますが、抗菌ペプチドの制御下でGFPを発現するハエの量的には少なくなります。遺伝子プロモーターは、習得すると免疫系の誘導を視覚化するために使用できます。この技術により、1時間あたり数百匹のハエを感染させることができます。ハエが感染した後、ハエの表現型は、フィティの学習能力、代謝状態、または想像できるほぼすべての他の特性を含む、おそらくいくつでも測定できます。このビデオを見れば、ショウジョウバエやメラノガスターに堅牢で再現性のある細菌感染を送達する方法、そしてその後に感染の重症度を測定し、宿主の免疫応答を定量化する方法について、十分に理解できるはずです。特定の細菌が人間の健康リスクを引き起こす可能性があることを忘れないでください。適切なバイオセーフティー手順が守られ、感染したハエが逃げないように適切な封じ込め措置が講じられていることを確認してください。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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