乾燥血液スポット - 準備とイムノアッセイや分子技術の使用のための処理

この手順の全体的な目標は、その後のイムノアッセイや分子技術で使用される乾燥血液スポットを調製および処理するための標準化されたプロトコルを提供することです。これは、最初に毛細血管血液を採取し、それをフィルターカードに移すことによって達成されます。2番目のステップは、血液スポットを一晩乾燥させ、フィルターカードの円から6ミリメートルのパンチを得ることです。

次に、パンチからの乾燥血液のイアンは、シェーカーのバッファーに最低4時間浸すことによって達成されます。その後、溶血性EITは遠心分離によって破片から解放されます。最後のステップは、市販のイムノアッセイおよび分子技術により、B型肝炎、C型肝炎、およびヒト免疫不全ウイルスの感染の血清学的および分子マーカーについて、クリアされたEITを分析することです。

セルラー製のフィルターカードに収集されたプロットを使用するというアイデアは、100年前に始まりました。それにもかかわらず、この方法を初めて使用する人々は、最終分析のための乾燥血液スポットの準備と処理を含む分析前段階全体が、乾燥血液スポット検査のほとんどすべてのアプリケーションで標準化されていないため、今日でも苦労することがよくあります。このような背景を踏まえて、乾燥血液スポットの調製と処理のための包括的で標準化されたステップバイステップのプロトコルを提案し、その後、免疫アッセイや分子技術に利用することを提案します。

この方法論の視覚的なデモンストレーションは、毛細血管血を採取するなどのいくつかのステップとして重要であるようです。その通りです。フィルターカードへの転送や群衆からの適切なパンチの準備を学ぶのは簡単ではなく、その結果、初めてテクニックを使用している個人は間違いなく視覚的な表現の恩恵を受けるでしょう。

ニコの指から毛細血管血を採取し、当研究室の技術者が処理手順を実演します。得られた血液スポットは、皮膚穿刺のための分子生物学的診断のために私たちの研究室ですでに長年働いている技術者koによって行われます。まず、使い捨てのラテックスゴム手袋を着用します。

皮膚の穿刺の前に、患者は手を温める必要があります。指を大きくマッサージして、上部穿刺部位への血流を豊かにします。次に、非書き込み手の3本目または4本目の指の先端遠位指骨のパーマー側の皮膚を適切な消毒剤で洗浄し、使い捨ての安全ランセットで皮膚を穿刺します。

指は、重力が指先に血液が集まりやすくなるような位置に保持する必要があります。血液の最初の一滴は、余分な組織液が含まれている可能性があるため、ガーゼパッドで拭き取ります。穿刺部位の血流を増やすために再度指をマッサージした後、指先で直接表面に触れずに、次の滴をフィルターカードの円の1つに移します。

次の大きな毛細血管の一滴を指先に形成させ、次の円に集めます。必要なすべての円が埋められるか、収集中に血流が止まるまで、この手順を続けます。毛細管現象のみによって血液がフィルターのテクスチャーに染み込むようにします。

血流がフィルターカードの必要なすべての円を埋めるのに十分でない場合は、指を過度に絞ったり搾ったりしないでください。血流が止まった場合は、指先に包帯を貼り、血液スポットを乾燥させるために検査にさらに血液が必要な場合は、別の指に2回目の皮膚穿刺を行い、フィルターカードをバイオハザード安全キャビネットの清潔なペーパータオルに置き、できれば室温で一晩乾かします。外部からの熱源がない場合、乾燥プロセスが完了すると、血液スポットは均一に濃い茶色がかった色になり、保存用の赤い領域は見えなくなります。

濾紙カードを1〜2個の乾燥剤小袋が入った1つのガス不透過性ジッパーバッグに入れて、試料を湿気から保護します。このバッグは、できるだけ早くマイナス20°C以下の温度の冷凍庫に移してください。現場条件下で冷凍庫が利用できない場合は、摂氏マイナス4度または周囲温度で最大14日間保存することができます。

グレード9 0 3フィルターカード転送の各血液浸漬円から、1回の使用6ミリメートルのデバイスで1つのスポットを打ち抜き、すべてのパンチ乾燥血液スポットは、1人の患者から12の1つの井戸にパンチアウトします。ウェルプレートは、0.05%tween 20および0.08%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水でウェルを満たします。これらの手順を繰り返して、分子分析を行うために、2 回目の一連の乾燥血液スポット EIT を取得します。

次に、細胞培養プレートを実験用シェーカーに置き、パンチ乾燥血液スポットを最低4時間、できれば一晩穏やかに溶出させます。翌日、斑点にはほとんど血液がなく、溶血性の上清が形成されています。これらのEITをマイクロ遠心分離チューブに移し、次にそれらを10、500倍Gで2分間遠心分離します。

Ellucian遠心分離EIT中に形成された破片の上清は、意図した分析に使用する準備が整いました。最初の一連のEITは、血清学的検査のためにカップに移されます。2番目のシリーズは、PCR分析のためにマイクロチューブに移されます。

市販のアッセイを使用して、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、およびHIV感染のマーカーについてEITを調査し、それぞれの製造元の指示に注意深く従ってください。最後に、全自動分析装置での血清学的検査の結果がシステムの画面に表示されます。乾燥血液スポットの調製および処理のために提案されたプロトコルの有効性は、最初にB型肝炎ウイルス表面抗原測定に関して1,762結合血清乾燥血液スポットペアを分析することによって評価されました。

アッセイプロトコルは、カットオフ値が0.05国際単位/ミリリットルで、EITの56.2%がSarahから得られた結果と比較して反応性であったため、変更されました。これは、B型肝炎ウイルス表面抗原検査の偽陽性率が14.7%であることに相当します。データの受信者動作特性分析は、閾値をミリリットルあたり0.15国際単位に増やすと、B型肝炎ウイルス表面抗原の存在について血清乾燥血液スポットペアを調査するときに、B型肝炎ウイルス表面抗原陽性とB型肝炎ウイルス表面抗原陰性の理想的な分離につながることを示しました。 不一致は 2 つだけ得られました。

2人の偽陰性のサラは、抗ウイルス治療を受けている患者に由来していました。全血EITからのリアルタイムPCRによるH-B-V-D-N-Aの定性的測定により、93%の感度が得られましたしたがって、血清H-B-V-D-N-A濃度が低い7つのサンプルは検出されませんでした。乾燥血液スポットEITから判定された抗HCV結果は、4つだけの偽陰性でした。

それぞれのCは、感染がかなり前に解決した患者から採取された可能性が非常に高いです。乾燥血液スポットEITからのH-C-V-R-N-A測定の分析感度が100%であることは、H-C-V-R-N-A増幅に使用された等温転写媒介増幅アプローチの優れた感度を示しました。全自動システムによる乾燥血液スポットEITs中の抗HIV抗体の検出も100%の分析感度をもたらしましたこのビデオは、比較的高い溶出量が使用され、血清または血漿研究のために確立されたエッセイプロトコルの変更であっても、タイトな血液スポットのすべてでB型肝炎、C型肝炎、およびHIV感染の血清学的および分子マーカーを確実に検出することが今日可能であることを示しています大きくは変わっていません。

しかし、伝えられた結果は、乾燥血液スポット技術の固有の限界も確認しました。場合によっては。概説されたプロトコルは、治験薬と慢性感染症のパイロット段階で、ドイツのベルリン市とエッセン市の534人のアクティブな薬物使用者に対してもフィールド条件下でテストされました。

得られた結果は、さらにドイツの6つの大都市での薬物研究の主要フェーズのテストアルゴリズムのマイナーな変更につながりました。