Name: の同期カウロバクターCrescentus細菌細胞周期の調査のため (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶ Caulobacter crescentus の細胞周期同期法。密度遠心分離でスワーマー細胞を単離し、生化学的アッセイや顕微鏡観察で細胞周期を追跡します。細菌発生生物学研究に有用です。

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著者は、原稿に対するコメントに対して、シャピロ研究室のメンバーとエリン・シュレイダーに感謝します。 著者らは、NIHポスドクフェローシップF32 GM100732 JMSおよびNIH助成金R01 GM51426およびR01 GM32506 LSからの財政的支援に感謝します。

1.大規模同期性 - ウエスタンブロット、マイクロアレイ/ RNA-SEQ、およびその他素材集中アッセイに最適<ol><li>冷凍庫ストック又はプレートから、PYE培地で28℃で振とうすることにより歪NA1000の5ミリリットルO / N培養を成長。 </li><li> M2Gの25ミリリットル（表1-2）に、ステップ1からの細胞の0.5ミリリットルを接種し、培養が0.5と0.6の間のOD 600に達するまで28℃で振る。 </li><li> M2Gの1リットル中に細胞を接種し、28℃で振る。 </li><li> OD 600が 0.5〜0.6に達すると、液体取り付けられた位相差顕微鏡を用いて細胞swarmerの存在を確認する。位相差顕微鏡によってスライドガラス上の細胞の1μlを、カバーガラスで覆い、スポット、および画像。人口が急速に泳いで細胞を視覚化することによってswarmer細胞の存在を確認してください。 </li><li> JA-10ローターで4℃で7 kxgで15分間細胞をスピン。 </li><li>上清を捨て、冷たいM2（表1-2）の180ミリリットルを加え、穏やかにresは血清学的ピペットを使用してすべてのセルをuspend。緩くペレット化した細胞を捨てる。彼らはpredivisionalとストーカー細胞である。 </li><li>冷たいコロイダルシリカ溶液の60ミリリットルを加え、よく細胞懸濁液を混ぜる（よく細胞に添加する前にコロイダルシリカ懸濁液を混在してください）​​。 </li><li> 8 30ミリリットルチューブに細胞懸濁液を注ぎ、JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで30分間スピン。 注：Oneは、2つの異なるバンドが表示されるはずです。ストーカー/ predivisional細胞は、トップバンド（ 図1B）にいる間swarmer帯は下のバンドである。 </li><li>慎重にトップバンドをオフに吸引し、swarmerバンド（下のバンド）上記〜1 cmの液体を除去する。 </li><li>パスツールピペットを用いて（クリティカル）、慎重にswarmerバンドを削除して、清潔なチューブに配置します。 JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで10分間コロイダルシリカ、トップ冷たいM2とチューブオフとスピンを洗い流す。 </li><li>注意深く上清を破棄し、再懸濁JA-20ローターで冷たいM2の20ミリリットルと、4℃で6.4 kxgで10分間スピンのセル。 </li><li>コールドM2 30mlの中に全てのペレットを再懸濁し、分光光度計を用いてOD 600を測定し、冷M2培地を用いてブランク。 swarmer細胞を確認するために位相イメージングのための1μLを保存します。細胞90〜95％がswarmersでなければなりません。 </li><li> JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで5分間、細胞をスピンダウン。 28℃M2G培地中の細胞を再懸濁A 600になるように、〜0.3〜0.4と28℃で振とうを開始。 注：典型的な収量は30と同期していない細胞の1Lからswarmer細胞培養の60mLの間にある。 </li><li> 8,9（野生型の文化が分裂するのに約135〜140分かかります）の時点を取って開始します。各時点で、OD 600を測定する。分割後のOD 600が約2倍初期OD 600であることを確認してください。 </li><li>ウェスタンブロットまたは遺伝子発現アッセイのために、立方1mLのアリコートを除去所望の時点でlture、30秒間、卓上遠心分離機において最大速度でスピンダウンし、急速に培地をデカントまたは吸引し、フラッシュは、液体窒素中で細胞ペレットを凍結する。下流の分析まで-80℃で細胞を保管してください。 </li></ol> 2.小​​規模同期性 - 顕微鏡用に最適<ol><li>冷凍庫ストック又はプレートから、M2Gに28℃で振とう5ミリリットルO / N培養を成長。 </li><li> M2G（表1-2）15mlに希釈し、中期対数（OD 600 = 0.5〜0.6）になるまで成長する。 </li><li> JA-20ローター中で4℃で10分間6.4 kxgでスピンし、1ミリリットル中に再懸濁冷たいM2（表1-2）と2 mlのマイクロ遠心チューブに移す。 </li><li>上清を吸引し、細胞をペレットにマイクロ遠心チューブ中で3分間15 kxgでのスピンは、冷たいM2の900μlの氷の上でペレット、再懸濁を置く。 </li><li>マイクで4℃で15 kxgで20分間、コロイダルシリカとスピンコーティングされた冷たいPVP900μlのを追加します。rocentrifugeチューブ。 </li><li> （クリティカル）を吸引したり、トップを切っピペット/ predivisional細胞バンドをストーカーして、新しいマイクロ遠心チューブにバンドswarmer底に集める。 </li><li> 3分間15 kxgで遠心分離しながら、冷たいM2の1ミリリットル中swarmer細胞を2回洗浄します。 </li><li>最後のスピンの前に、予備冷却した1mlのガラス試験管に細胞を移動し、M2のブランクと比較した細胞のOD 600を測定する。 </li><li> 0.4及び28℃/ロール細胞を振る - 0.3の間ODで28℃、M2Gに最終的な細胞ペレットを再懸濁。 注：典型的な収量はswarmer細胞培養の2および4 mlの間である。 </li><li>顕微鏡実験のために、所望の時間にポイントがイメージングのためM2Gアガロースパッド上に細胞を1μLを置く。 </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
<li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li>
<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

細菌の細胞周期は生命の基本的なプロセスであり、成長の研究や次世代抗生物質の標的として重要です。ここでは、細菌の細胞周期と非対称細胞分裂を研究するためのモデル生物である C. crescentus NA1000の迅速な同期手順について詳しく説明しました。 この方法は、細菌の細胞周期の時空間調節を調査するために、ウェスタンブロット、遺伝子発現プロファイリング、および蛍光顕微鏡アッセイに修正可能です。 
このプロトコルは迅速で、健康な同期細胞を生成します。 他の同期方法は、細胞の長い飢餓を必要とし、細胞周期を同じ状態で停止させるための厳密な応答に依存し、対数増殖 13の培養物とは異なる細胞をもたらします。 「ベビーマシン」 やその他の表面付着方法が成功裏に使用されていますが14,15、それらは通常、同期されたセルの収量が低くなります。 ここで紹介する密度遠心分離プロトコルは、同期したC .クレセント NA1000スウォーマー細胞のより高い純度と収量を可能にします。
<p class=...

細菌の細胞周期は、ゲノムの複製と娘細胞の分裂の両方を制御する。抗生物質耐性は、公衆の健康に成長している脅威であるとして重要なのは、細菌の細胞周期は、抗生物質開発のための未開発の目標を提示します。 細菌カウロバクターcrescentusでは、各細胞周期の異なる運命（ 図1A）1,2の2つの娘細胞を生じる、非対称分裂に導く。 One娘細胞は鞭毛を継承し、他の娘は茎を継承し、固着されている間運動性である。集積回路の遺伝子は、転写調節、リン酸化シグナル伝達、およびタンパク質分解規制3ことによって、細胞周期の進行および細胞の運命を制御する。また、染色体複製と同時分離は、第4染色体の正確に一つのコピーを含む娘細胞が得られる。重要なことに、これらの2つの細胞型は急速COLLOによって分離することができる高収率（ 図1B）を有する集団の残りからswarmer細胞の単離を可能にする同期可能NA1000株5-7 idalシリカ粒子の密度遠心分離。細胞s​​warmer分離された後、非対称細胞分裂を通じて同期的に進む。ここでは、詳細プロトコルは、 カウロバクター株 NA1000を同期させるために使用される。私たちは、プロトコルおよび大規模および小規模の両方の同期のための一般的なトラブルシューティングのヒントを提供する。この実験手順は、 カウロバクター細胞周期と細胞の運命の時空間制御を調べるための強力なツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>PVPコーティングコロイダルシリカ(パーコール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>コロイダルシリカ(Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>硫酸第一鉄キレート溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>30 mlの遠心分離機の管</td><td>のコーニング</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</sub</td><td>>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>アムレスコ</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

の同期<em&gt;カウロバクターcrescentus</em&gt;細菌細胞周期の調査のため

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

細胞周期は、すべての細胞の成長、ゲノム複製、および発生にとって重要です。 細菌では、細胞周期の研究は主に同期していない細胞に焦点を当てており、細胞周期の進行、ゲノム複製、分裂に必要な時間的イベントを順序付けることが困難になっています。 Caulobacter crescentusは、密度遠心分離によりG0状態で細胞を迅速に同期させることができる、細菌細胞周期の優れたモデルシステムを提供します。 細胞周期同期実験は、染色体の複製と分配を支配する分子イベントの確立、細胞周期の進行を制御する遺伝的調節ネットワークのマッピング、および非対称細胞分裂に必要な極性シグナル伝達複合体の確立を特定するために使用されてきました。 ここでは、Caulobacter NA1000細胞の迅速な同期のための詳細なプロトコールを提供します。 同期は、遺伝子発現プロファイリングやウェスタンブロットアッセイ用の大規模フォーマットだけでなく、顕微鏡検査やFACSアッセイ用の小規模フォーマットでも実行できます。 Caulobacterの迅速な同期性と高い細胞収量により、この生物は細菌の細胞周期の研究のための強力なモデルシステムとなっています。

より高い密度を有するswarmerバンド、およびより低い密度のストーカー/ predivisionalセル帯域：同期は、典型的には、セルの二つのバンド（ 図1B）が得られる。効率的な同期を確実にするために共通のコントロールがOD 600を監視し、異なる細胞周期の時点でウエスタンブロットによりCTRAタンパク質のレベルを測定することを含む。 OD 600は、細胞周期（ 図2）の過程で約2倍に増やす必要があります。細胞周期のマスターレギュレーターCTRAためのウェスタンブロットは、良好な同期（ 図2）を確認するための有用な制御である。 CTRAは、DNA複製をブロックするswarmerセルに利用され、DNA複製10の開始時に分解される。 CTRAは、その後、細胞周期における合成し、鞭毛11,12の多くの構成要素を含む発生遺伝子の宿主の転写を活性化する。成功した同期は、Tを持つことになりますCTRAタンパク質レベルの彼の振動パターン。 <p cla...

細菌細胞の同期は、細菌の細胞周期と発生の研究に不可欠です。 Caulobacter crescentusは、密度遠心分離によって同期可能であり、細菌細胞周期の研究に迅速かつ強力なツールを提供します。 ここでは、Caulobacter細胞の同期に関する詳細なプロトコールを提供します。

の同期<em&gt;カウロバクターCrescentus</em&gt;細菌細胞周期の調査のため

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

本手順の総合的な目的は、同期化した細胞培養を確立するために、Coob backerスウォーマー細胞を単離することです。これは、まずCoob backer細胞の混合培養物を増殖させ、次に細胞を冷媒に再懸濁することで増殖を短時間停止させることにより達成されます。第2のステップでは、密度勾配遠心分離法を用いてスウォーマー細胞を分離します。次のステップは、スウォーム細胞を温めた培地で再懸濁することであり、これにより細胞が細胞周期に入ります。最終的に、単離されたスウォーム細胞は、生化学的アッセイや顕微鏡観察を用いて細胞周期全体を通じて追跡することが可能です。ベビーセルマシンなどの他の手法と比較して、この技術の主な利点は、細胞を迅速に単離でき、生化学的研究に十分な量を確保できることです。この手法は、染色体分離の制御機構や非対称な細胞分裂サイクルなど、細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。まず、PYE培地 5 mL に、プレート上の *Caulobacter crescentus* CSIS株（NA 1000）の細菌を接種します。これを 28 °C で一晩振盪培養します。翌日、一晩培養した菌液 0.5 mL を M2G培地 25 mL Containing のフラスコに移し、吸光度（OD）が 0.5 から 0.6 に達するまで 28 °C で振盪培養します。次に、培養液を1リットルのM2G培地で希釈して目的の開始吸光度とし、フラスコを28°Cで振盪します。培養液の吸光度が0.5に達したら、培養液1µLをスライドガラスにピペットで滴下し、カバーガラスで液を覆います。位相差顕微鏡で細胞を観察し、急速に遊泳するスウォーム細胞が存在することを確認します。培養液を滅菌遠心チューブに移し、4°Cで7,000×gで15分間遠心分離します。次に、上清を捨てる際に緩くペレット化した細胞も除去し、180 millilitersの冷えたM two mediumを加えます。セロロジカルピペットを使用して、細胞を穏やかに再懸濁してください。その後、細胞懸濁液に60 millilitersの冷えたコロイダルシリカ溶液を加え、よく混合します。細胞懸濁液を8本の30 mLチューブに分注し、4°Cで6,400 ×gで30分間遠心分離します。遠心機からチューブを慎重に取り出し、2本の明確なバンドが形成されているかを確認します。下層のバンドにスウォーマー細胞が含まれ、上層のバンドに分裂前の細胞が存在します。次に、上層のバンドと、下層のバンドの約1 cm上までの液体を慎重に吸引します。パステールピペットを用いてスウォームバンドを除去し、清潔なチューブに移します。チューブに冷たいM two mediumを満たし、遠心分離してコロイダルシリカを洗浄します。次に、上清を注意深く除き、細胞を20 millilitersの冷たいM two mediumで再懸濁して遠心分離します。再び遠心して細胞をペレット化し、ペレットを30 millilitersの冷たいM two mediumで再懸濁した後、懸濁液の吸光度を測定します。細胞懸濁液を1 µL、顕微鏡スライドに滴下し、位相差像を用いてスウォーム細胞を確認します。次に、細胞を遠心分離し、光学密度が0.3から0.4の間になるようにM2G培地で再懸濁します。ウェスタンブロットまたは遺伝子発現解析を行う場合は、28 °Cで振盪培養します。培養液の光学密度が2倍になるまで、約140分間にわたって10〜30分ごとに1 mLずつ分注して回収します。卓上遠心機を用いて細胞を30秒間遠心分離し、その後、速やかに培地を吸引して除きます。細胞ペレットを液体窒素で凍結させ、-80 °Cで保存します。小規模な同期培養を行うには、5 mLのM2G培地にNA1000細胞を接種し、28 °Cで振盪しながら一晩培養します。翌日、培養液を15 millilitersのM two G mediumで希釈し、吸光度が0.5から0.6の間になるまで細胞を増殖させます。細胞を遠心分離し、1 milliliterの冷えたM two mediumで再懸濁します。細胞を2 milliliterのマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により細胞をペレット化し、上清を吸引します。次に、チューブを氷上に置き、細胞ペレットを900 µLの冷えたM2培地で再懸濁します。続いて、900 µLの冷えたPVPコーティングコロイダルシリカを加え、チューブを20分間遠心分離します。上層のプレディビジョナル細胞バンドを慎重に吸引し、下層のスウォーマー細胞バンドを新しいマイクロ遠心チューブに回収します。最終遠心直前に、冷やしたM2培地1 mLでスウォーマー細胞を2回洗浄し、各洗浄の間に3分間の遠心分離を行います。細胞懸濁液をあらかじめ冷却した1 mLガラス試験管に移し、細胞の光学密度を測定します。その後、細胞をマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離を行います。Reese、最終的な細胞ペレットを、光学密度 0.3 から 0.4 の間に調整した予熱済みの M two G 培地で懸濁し、28 °C で振盪してください。顕微鏡観察を行う場合は、適切なタイムポイントで、培養液 1 µL を M two G エアロスパッド上に滴下します。非同期培養液を密度勾配遠心分離にかけると、2本の細胞バンドが得られます。下層のバンドには密度の高いスウォーマー細胞が含まれ、上層のバンドには密度の低いストック細胞および分裂前細胞が含まれています。培養液の吸光度は、細胞周期の過程で約2倍に増加します。この期間に、スウォーマー細胞はストック細胞へと分化し、その後ストック細胞は複製を行い、非対称細胞分裂を起こします。各分裂によって新しいスウォーマー細胞と親のストック細胞が生成されるため、細胞周期のマスターレギュレーターであるCTRAのウェスタンブロットは、同期を確認するための有用なコントロールとなります。CTRAはスウォーマー細胞におけるDNA複製を阻害し、DNA複製が開始されると分解されます。その後、細胞周期の後期にCTRAが再び合成され、DNA複製の再開始を防ぐとともに、多くの発生遺伝子の転写を活性化します。このようにCTRAタンパク質レベルが振動するパターンは、同期が正常に行われたことを示しています。このビデオを視聴することで、細菌の細胞周期を調査するための callback または NA 1000 細胞の同期方法について十分に理解することができます。この細胞同期の手順は、正しく行えば1〜2時間で完了します。この手順を実施する際は、迅速に作業することが重要です。

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Research

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Biology

生物学

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

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出典: Murata, K. et al., Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography. J. Vis. 経験。...

シアノバクテリア培養同期と明暗サイクルによるDNA圧縮

細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。...

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細菌細胞は空間的非常に組織されます。遅い成長Myxococcus...

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。...

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

この研究は、合成遺伝子回路の確率的挙動の分析と定量化のために 、大腸菌 の単一細胞の生画像化を可能にする顕微鏡法を提示する。...

タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。...

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌...

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

同期時系列実験を分析する際の課題の1つは、実験によって同期からの回復の長さと細胞周期期間が異なることが多いことです。したがって、異なる実験からの測定値をまとめて分析したり、容易に比較したりすることはできません。ここでは、フェーズ固有の比較を可能にするために実験を調整する方法について説明します。...

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

学ぶ Caulobacter crescentus の細胞周期同期法。密度遠心分離でスワーマー細胞を単離し、生化学的アッセイや顕微鏡観察で細胞周期を追跡します。細菌発生生物学研究に有用です。

の同期

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