の同期カウロバクターCrescentus細菌細胞周期の調査のため

この手順の全体的な目標は、同期した細胞培養を確立するために、Coobバッカースウォーマー細胞を単離することです。これは、最初にCoobバッカー細胞の混合培養を増殖させ、次にResusが細胞を冷培地に懸濁させることによって増殖を短時間停止することによって達成されます。2番目のステップは、示差密度遠心分離によって群れ細胞を分離することです。

次のステップは、群細胞を温かい培地に再懸濁して、細胞が細胞周期に入ることを可能にすることです。最後に、単離された群細胞は、生化学的アッセイまたは顕微鏡法を使用して、細胞サイクル全体にわたって追跡できます。この手法がベビーセルマシンなどの他の方法よりも優れている主な点は、細胞を迅速に単離し、生化学的研究に十分な量を拡大できることです。

この方法は、染色体分配や非対称細胞分裂サイクルを制御するものなど、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。PYE培地の5ミリリットルに、コロバッカーCSIS株NA 1000のプレートから細菌を接種し始める。翌日振とうしながら摂氏28度で一晩培養し、0.5ミリリットルの一晩培養物を25ミリリットルのM2G培地を含むフラスコに移し、培養物が0.5〜0.6の光学密度に達するまでフラスコを摂氏28度で振とうします。

次に、培養物を1リットルのM 2 G培地に希釈して所望の開始光学密度を取得し、培養物の光学密度が0.5ピップの培養物1マイクロリットルに達したときにフラスコを摂氏28度で振とうし、次いで液体をカバースリップで覆う。位相顕微鏡で細胞を画像化し、急速に泳ぐ群細胞の存在を確認します。培養物を滅菌遠心分離管に移し、次いで細胞を7, 000倍Gで摂氏4度で15分間回転させる。

次に、上清を注ぐときにゆるくペレット化された細胞を捨て、180ミリリットルの冷たいM two培地を加えます。血清学的ピペットを使用して、細胞を穏やかに再懸濁します。次に、60ミリリットルの冷たいコロイダルシリカ溶液を細胞懸濁液に加え、よく混ぜます。

細胞懸濁液を8本の30ミリリットルチューブに注ぎ、それらをGの6,400倍で30分間遠心分離します。摂氏4度に設定します。遠心分離機からチューブを静かに取り外し、チューブに2つの異なるバンドがないか確認します。

下のバンドには群れ細胞が含まれ、分裂前の細胞は上部のバンドにあります。次に、上部のバンドと液体を下のバンドの約1cm上まで慎重に吸引します。パスターピペットを使用してスウォームバンドを取り外し、きれいなチューブに移します。

チューブに冷たいM 2培地を充填し、チューブを遠心分離してコロイダルシリカを洗い流します。次に、上清を慎重に廃棄し、細胞を20ミリリットルの冷たいM two中型遠心分離機に再懸濁します。再び細胞をペレット化するために、ペレットを30ミリリットルの冷たいM 2培地に再懸濁し、次いで懸濁液の光学密度を測定する。

1マイクロリットルの細胞懸濁液を顕微鏡スライドに置き、位相イメージングを使用して群細胞を確認します。次に、細胞を遠心分離し、M two G培地で0.3〜0.4の光学密度に再懸濁します。28°Cで振とうして培養物をインキュベートし、ウェスタンプロットまたは遺伝子発現アッセイを行います。

10〜30分ごとに1ミリリットルのアリコートを約140分間、培養物の光学密度が2倍になるまで取り出します。卓上遠心分離機を使用して細胞を30秒間スピンダウンし、その後、培地フラッシュを急速に吸引します。細胞ペレットを液体窒素で凍結し、マイナス80°Cで保存して小規模同期し、NA1000細胞に5ミリリットルのM2G培地を接種し、翌日28°Cで振とうしながら細胞を一晩成長させます。

培養物を15ミリリットルのM two G培地で希釈し、光学密度が0.5〜0.6になるまで細胞を増殖させます。細胞を遠心分離し、1ミリリットルの冷たいM two培地に再懸濁します。細胞を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により細胞をペレット化し、supnatantを吸引します。

次に、チューブを氷の上に置き、細胞ペレットを900マイクロリットルの冷たいM two培地に再懸濁します。次に、900マイクロリットルの冷たいPVPコーティングされたコロイダルシリカを加え、チューブを20分間遠心分離します。上部の分裂前細胞バンドを慎重に吸引し、下部のスウォーマーバンドを新しいマイクロ遠心チューブに集めます。

スウォーマー細胞を1ミリリットルの冷たいM 2培地で2回洗浄し、最終スピンの直前に各洗浄の間に3分間遠心分離します。細胞懸濁液を予冷した1ミリリットルのガラス試験管に入れ、細胞の光学密度を測定します。次に、細胞をマイクロフュージチューブに移し、遠心分離後に遠心分離します。

リース、最終細胞ペレットをプレウォームM two G培地に0.3〜0.4の光学密度で懸濁し、細胞を摂氏28度で振とうします。顕微鏡観察が必要な場合は、1マイクロリットルの培養物を適切な時点でM two Gエアロスパッドに置きます。非同期培養の示差密度遠心分離では、2つのバンドの細胞が得られます。

下部のバンドには密度の高い群れ細胞が含まれ、上部のバンドには密度の低いストック細胞と分裂前細胞が含まれています。培養物の光学密度は、細胞周期の過程で約2倍に増加します。この間、群れ細胞はストック細胞に分化し、ストック細胞はその後複製して非対称細胞分裂を起こします。

各分裂により新しいスウォーマー細胞と親ストック細胞が生成されるため、細胞周期マスターレギュレーターCTRAのウェスタンブロットは、同期を確認するための有用なコントロールであり、CTRAはスウォーマー細胞のDNA複製をブロックし、DNA複製時に分解されます。その後、CTRAは細胞周期の後半で合成され、DNA複製の再開を防ぎ、多くの発生遺伝子の転写を活性化します。このCTRAタンパク質レベルの振動パターンは、同期が成功したことを示しています。

このビデオを見れば、コールバックまたはNA 1000細胞を同期して細菌の細胞周期を調査する方法についてよく理解できるはずです。このセル同期手順は、正しく実行すれば 1 時間から 2 時間で完了します。この手順を実行するときは、迅速に作業することを忘れないでください。