モデルマメに初期胚発生の調節を研究するための接合体と体細胞胚を得るためのプロトコルのMedicago truncatula

次の手順の全体的な目標は、植物の胚発生の遺伝的調節を調査するために、さまざまな発生段階でどれだけのカーゴトゥーラ胚を取得できるかを実証することです。これは、ポッドの形態をさまざまな接合子胚の発生段階にリンクし、葉のexplanを培養してさまざまな段階で体細胞胚を得ることによって達成できます。最終的には、定量的PCRとベータグルクロニダーゼを使用して、目的の特定の発生段階での胚形成中の遺伝子の発現を評価できます。これらの技術の利点は、個々の花のタグ付けがin vivo実験に必要とされず、in vitro手順が最適化され、補完的な実験アプローチを提供することです。

培養手順の視覚的なデモンストレーションは、操作の詳細をより厳密に追跡できるため、重要です。in vivo 手順のデモンストレーションは Wang 氏で、Kim Nolan 氏は in vitro 手順のデモンストレーションを行います。接合子胚の発生を促進するために、モンテカーゴ三眼植物からの種子の種皮の表面を貫通し、種子を水で完全に覆って一晩浸します。

翌日、直径15センチの鉢10個にそれぞれ3つの種を鉢植えに蒔き、鉢をガラスの家に移します。摂氏23〜19度の昼夜の気温で14時間の撮影時間で植物を育て、発芽後も最も健康な苗を保持して、鉢ごとに1つの植物があり、鞘が現れたときに植物の茎が登るためのトレリスで苗を囲みます。表1と図1に概説した適切な段階で収集して、目的の早期胚発生段階を取得します。

次に、鉗子を使用して、鞘からlesを分離します。あるいは、ホイヤー溶液中で完全に透明な、より洗練された顕微鏡法では、標準的な化合物顕微鏡下で胚をイメージングすることにより、胚の病期を確認することができます。次に、ポッドの中央領域から実験に必要な数のULを収集し、体細胞胚発生の下流分析のために適切な温度で保存します。

培養で容易に胚を形成することができるtran atula品種の細長い茎の最新の、ほぼ完全に拡大したテート葉からのin vitro収穫リーフレット。テイトの葉を湿らせたペーパータオルの上に置き、脱水症状を防ぐために培養ポットに入れます。次に、UV滅菌されたバイオセーフティキャビネットで作業し、オートクレーブスプリングティーインフューザーのメッシュボールに葉を入れました。

オートクレーブの250ミリリットルスクリューキャップに70%エタノールに浸漬した注入器。ポリカーボネート培養ポット30秒後、葉の組織を排出し、注入器を1〜8希釈した漂白剤溶液に10分間浸します。時折穏やかに渦を巻いて、鍋をそっと撫で、余分な水を排出します。

次に、注入器をすすぎます。新しいポットで新鮮な脱イオン水にもう一度入れます。次に、滅菌鉗子を使用して、茶注入器から葉を新鮮な培養物に移し、滅菌キャップに滅菌脱イオン蒸留水スクリューのポットを取り付けます。

次に、反転して渦巻き状にすることで葉を洗い流します。次に、リーフレットを滅菌水に浮かせてインプラントをプレートします。滅菌された個々のリーフレットの端を滅菌技術を使用してトリミングします。

次に、残りの長方形を2つまたは3つ、8〜10×3〜5ミリメートルの長方形のexplanに切り取り、各Xエクスプランプレートの中央に中静脈を置きます。寒天1個につき6個の外植片を直径9cmの固化培地に入れます。通常の葉の向きを維持するために、ABAシール側を下にしてシャーレ。

次に、ペトリ皿をパーフィルで密封し、温度制御された部屋で摂氏28度の暗闇でプレートをインキュベートします。3週間後、滅菌ステンレス鋼のヘラと鉗子を使用して、分化穴の外植片を新鮮な培地に継代培養します。最初の胚は、たこが起こると約4週間で観察され、たこはここに示されている最大の説明のサイズを超えます。

継代培養時に個々のカルスの50%のみを新鮮な培地に移します。最後に、実体顕微鏡を使用して、実験目的に従って外植片を処理する4〜8週間のインキュベーション期間にわたってさまざまな胚の段階を収集します。Cで下流で示したように接合子胚を収穫した後、これらの画像で示されているように、2つのハイブリダイゼーションまたは他の適切な戦略を特に興味深いものとして採用することができ、SSISおよびSpencerの特異性は、メッキされたXプランに従うことによって観察することができる。

数週間を通じて、目立たない段階の体細胞胚を特定し、選択してすぐに分析することができます。例えば、これらのデータは、初期のオレイン段階の胚が、あるタイプのメディカゴTula eoin遺伝子の発現を示し、別のタイプの発現は示していないことを示しています。体細胞胚系の特別な利点は、カルスの形質転換を植物全体を再生することなく実行できることです。

確かに、ここで示されているように。ベータグルクロニダーゼは、胚形成のさまざまな段階での遺伝子発現を視覚化するために使用できます。ビデオを見た後、Andresを取得するためにポッドを選択して分離する方法をよく理解しているはずです。

また、体細胞胚形成のための無菌のexplanを準備し、プレートする方法をよく理解している必要があります それらの開発後。これらの技術により、胚発生の初期段階における転写制御が、胚の成長発生と栄養貯蔵に関連して解明されることが可能となりました。