Name: モデルマメに初期胚発生の調節を研究するための接合体と体細胞胚を得るためのプロトコルのMedicago truncatula (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶ Medicago truncatulaを用いた初期胚発生の遺伝的調節研究法。莢の形態と接合体胚発生段階を関連付け、葉片培養で体細胞胚を取得するプロトコルを解説します。

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この研究は、オーストラリア研究評議会の助成金CEO348212とニューカッスル大学の支援を受けました。Sam Zhang博士の支援に感謝します。

1.接合胚の開発<ol><li>植物素材<ol><li>成長のMedicagoは、14時間の光周期と23℃/ 19℃の昼/夜の温度と温室で野生型Jemalongまたはその付近の同質遺伝子（2HAとして知られている）、非常に再生成可能な遺伝子型Jemalong 2HA 13 truncatula。 <ol><li>ピアース水がシードを入力して、一晩水に浸漬させられるように種子を播種する前に（23 G針で）種皮の表面。完全種子をカバーするために十分な水を追加します。 </li><li>ポッティング混合物中の各直径15cmのポットに3種をまく（10ポットの合計）（粗砂、パーライト、コイア-泥炭（1：1：1）を加えたOsmocote正確な標準の5グラム：徐放性肥料）へと転送温室。植物が登る茎のためにポットとサラウンド当たり1植物はトレリスによってそこにあるように、発芽後の健康な苗を保持します。 </li></ol></li></ol></li><li>収穫ポッド<ol><li> Wからポッドを収集第9に記載されているように、適切な初期胚の段階を取得するためにILDタイプJemalongまたは2HA。 注：異なるポッド段は、図1に示され、対応する胚の段階は、図2に示されています。 </li><li> 表1のとおり基準を使用して、収穫時に異なるポッドステージを確認してください。別々の段階6および7（ 表2）を助けるためにステージ6からの経過時間を測定します。 </li></ol></li><li>ポッドから胚珠を解剖し、胚の段階を確認します<ol><li>必要に応じて単独で微細な鉗子を使用してポッドまたはステレオ解剖顕微鏡とピンセットから胚珠を分離します。必要に応じて胚段階を迅速に標準複合顕微鏡（ 図3B）を用いて確認することができます。 </li><li> 7.5グラムのアラビアゴム、100gの抱水クロラール、5ミリリットルグリセロール、60ミリリットルの脱イオン蒸留水を含む改変ホイヤーの溶液を調製します。 3-5時間または一晩攪拌して溶解します。 </li><li>よりリファインのためD顕微鏡は、修正ホイヤーのソリューション15,16における解剖胚珠をオフにします。慎重に透明になるまで室温で（胚珠をカバーするのに十分）ホイヤーの少量の溶液中で無傷の胚珠と場所を拾います。 </li><li>微分干渉コントラスト（DIC）光学系を有するサンプルを表示します。デジタルカメラ9（ 図2）iwth画像をキャプチャします。 </li><li>ポッドの中央領域から最も均一な胚珠を入手して、必要な数を蓄積します。例えば、 図3Aに示されています。さらに分析するために必要な温度で氷とストアの胚珠（-80°Cのための核酸）を収集します。 注：組織切片の分析の詳細については、透過型電子顕微鏡の場合、およびin situハイブリダイゼーションの論文8,9を参照してください。 </li></ol></li></ol> インビトロでの 2体細胞胚発生<ol><li> Mを使用しますtruncatula品種 T帽子は容易に培養中の胚を形成することができます。葉移植片は、このプロトコルでは2-4ヶ月の古い2HA所13,17を使用しています。 </li><li>延伸ステムの最新ほぼ完全に膨張した三つ葉の葉からチラシを取ります。 </li><li>脱水を避けるために、培養ポットに湿ったペーパータオルで三つ葉の葉をしてください。 注：三つ葉の葉が収穫されると、彼らは最小の遅延で利用する必要があります。 </li><li>培地の調製<ol><li> 9センチメートルペトリ皿で​​4：1：寒天で5培地（V 0.8％W）P4 10を使用してください。 注：P4 10：4：1：5の媒体は、P4の基礎培地18 + 10μM1-ナフタレン酢酸（NAA）、4μM6-ベンジルアミノプリン（BAP）、1μMのアブシジン酸（ABA）および5μMジベレリンで構成されてい酸（GA）。 GA + ABAの使用は、胚形成を促進し、胚の数14での実質的な増加を引き起こします。 </li><li> 1 LのP4基礎媒体を構成します。主要な塩からなる（calciuを作ります、）別途アップメートルマイナー塩およびビタミン（ 表3）、キレート鉄（別途構成する）、カザミノ酸（カゼイン加水分解物）、30gのスクロース、8グラム寒天。 </li><li>適切な分注して-20℃での主要な塩、カルシウム、カザミノ酸、マイナー塩およびビタミンの店舗在庫ソリューションを提供しています。 4℃でキレート鉄を保管してください。 </li><li> •7HのFeSO 4の1.853グラムを添加しながら攪拌しながら、脱イオン蒸留水約900ミリリットル中のNa 2 EDTA•の7.44グラム2H 2 Oを溶解させることによりキレート鉄（200X）を構成する場合、98〜99°Cの解決策をもたらします2 O.成分が溶解されたときに最後に1リットルに構成しています。 4℃で琥珀色の瓶に保管してください。 </li><li> 表4のように原液とP4の基礎媒体を構成する。培地中のホルモンは、10μMNAA、4μMBAP、1μMABA、5μMGA（ 表4および特定の材料表を参照してください）です。 NAAを追加とBAPオートクレーブ処理の前に、オートクレーブし、約55℃に冷却し、注射器に取り付けた0.22μmのフィルターで濾過滅菌を使用した後にABAとGAを追加します。穏やかな旋回によりよく混ぜます。 </li><li>オートクレーブの前に1 M KOHでpHを5.8にメディアを調整します。 20分間121℃でオートクレーブ。 </li><li>濾過滅菌ABAとGAを追加し、層流フードやバイオハザードキャビネットに無菌9センチメートルペトリ皿に約25ミリリットルのメディアを注ぐオートクレーブ後。クールで寒天は蓋をオフにして設定してみましょう。そして、蓋の上に置き、蓋には凝縮水がないことを確認してください。 （蓋コンデンセートを防ぐためにダンボール箱に）4℃で必要とストアとしてラベル。 </li></ol></li><li>葉組織の滅菌<ol><li>紫外線滅菌層流フードやバイオハザードキャビネットに働きます。 </li><li>場所は、以前にオートクレーブし、バネ茶注入器のメッシュボールに残します。 </li><li> CULエタノール：70％（V V）で葉を含む茶注入器を浸し30秒間トゥーレポット。 注：この手順のすべてのステップが使用するために250ミリリットルのオートクレーブ処理されたキャップポリカーボネート培養ポットをねじ込みます。 </li><li>ドレインその後1葉組織を転送し、浸漬：10分間希釈漂白剤（0.5％塩素）：8（V V）。随時穏やかに渦巻きます。 </li><li>漂白剤を排出し、滅菌脱イオン蒸留水を含む培養ポットに茶の注入器を転送します。優しくスワールや余分な水分を排出します。滅菌脱イオン蒸留水の新鮮な培養ポットに1より多くの時間を繰り返します。 </li><li>滅菌脱イオン蒸留水の新鮮な培養ポットに滅菌ピンセットで茶注入器から葉を削除します。無菌キャップをして反転し、旋回によってすすいでください。外植片を調製する準備ができるまで、滅菌水に浮かぶ葉のままにしておきます。 </li></ol></li><li>外植片を準備し、メッキ<ol><li>無菌技術を使用して、メスでエッジから個々の滅菌リーフレットをトリミングし、2つまたはTHRに残りの長方形をカット各外植片（ 図5A）の中心部にあるミッド静脈とEE長方形の外植片（8-10 X 3〜5ミリメートル）。 注：外植片の大きさは最初のカルスを開始で非常に重要です。持ち帰り食品容器から滅菌蓋の切削を行います。 </li><li>直径9cmのペトリ皿（ 図5B）で寒天固化培地上でプレート6の外植片。通常の葉の向きを維持するために、下に植片の背軸側にプレート。 </li><li>皿の周りに延伸パラフィルム（ 図5C）でペトリ皿を密封します。組織は現在、インキュベーションのために準備ができています。 </li></ol></li><li>組織インキュベーション<ol><li>培養期間を通して温度制御室または成長キャビネットに28℃の暗所でプレートをインキュベートします。 注：外植片は、脱分化を開始する細胞分裂、増殖（カルス形成）と胚（分化）を受けることになります。 </li><li>差別explaのサブカルチャー新鮮な培地への3週間後にNTS。この継代培養では、層流フードやバイオハザードキャビネットに、無菌のステンレス鋼製のへらと鉗子を用いて全植片を移します。カルスが発生し、カルスは、 図5Cの最大のもののサイズを超えるように新鮮な培地に継代培養したときに、個々のカルスの50％を転送します。 </li><li>約4週間の最初の胚を観察します。同期の程度はありますが、4-8週間の潜伏期間（ 図6A、B）の上に別の胚の段階を収集します。実験の目的に応じて解剖顕微鏡およびプロセスの下で収集します。 </li><li>外植片を3ヶ月間の胚を生産し続けるように、3週間ごとに継代培養し、定期的に胚を削除します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する利益はないと宣言する。

記載されているプロトコルは比較的単純であり、すべての現代的な細胞および分子技術とマメ科植物の胚発生の調査を可能にします。我々は両方の利点と欠点は、インビボおよびインビトロの方法であることを認識しています。両方とも、未熟種子19の培養に比べて初期胚発生に関する詳細フォーカスを可能にします。 in vivo試験の場合にはどのような説明されていることは主に、多くの胚の研究に適しているポッドから胚珠の単離であります。さらに、「フック」の領域（ 図3B）をオフにスライスして、胚組織のために豊かにすることはもちろん可能です。これは、それが十分に有利胚珠を利用して、隣接する組織に接続されていないようdisection中の胚はしばしば失われているように胚発生のごく初期の段階を分離することは困難です。ポッドの形態を使用すると、花のタグ付けを排除し、時間cを有します各花のためのラース政権。環境は非常に厳密に制御されていない限り、また、発生のタイミング方法の潜在的な変動性があ...

収穫面積と総生産1で穀物に2つ目の豆類は、約20,000種およびマメ科（またはマメ科）家族と高等植物の第三位のファミリーです。大豆は第三位の栽培作物です。穀物豆類は、人間の消費の2のための食事性タンパク質と植物油の三分の一の約3分の1を提供します。それらのN 2の固定容量のマメ科植物はまた、持続可能な農業システムに貢献しています。 のMedicago truncatula、大豆のように、その種子の子葉にタンパク質と油を格納し、かなりの遺伝的およびゲノム資源3,4との遺伝的およびゲノムマメ科モデルです。 M.一方、 truncatulaは ​​、それがますますマメ科植物の種子生物学5-7と胚8,9を研究するために採用されているマメ科植物根粒共生4の理解の進歩を可能にしました。シロイヌナズナの胚発生は広範囲に私は10,11を研究し、それされていますSA非マメ及び胚発生の詳細はMedicagoに8,10と同じではありません。 Mの接合体胚発生truncatulaは ​​独特の多下垂、endoployploid懸垂帯および基底転送セル8と、興味深い機能を備えています。 体細胞胚形成（SE）は、一般的に、植物12を再生するために使用されます。マメ科モデルMのtruncatulaは ​​、シードラインJemalong 2HA（2HA）は体細胞胚形成13率の高さを持っている親Jemalongから開発されてきました。生産胚の数は、最近確立された実質的に長い媒体14にジベレリン酸（GA）およびアブシジン酸（ABA）の両方を添加することによって増加しています。 GAとABAは通常拮抗14を作用することが与えられた珍しい相乗的にこの場合はGAとABAの作用します。カルスから生産胚は、胚発生の段階が容易にvisuallを決定することができる表面上で開発しますY、容易に回収しました。胚形成（2HA）と非胚形成されている同質遺伝子系統（Jemalong）の近くに持つことは、体細胞胚形成の調査を容易にし、 インビボおよびインビトロ系の両方持つことは、種々の実験の可能性を提供します。 胚発生の細胞および分子メカニズムを理解することは、種子及び植物の開発を理解するために不可欠です。マメ科植物では、他の双子葉植物のように、それは、ヒトの栄養のために使用される製品を保存胚の子葉です。初期胚は、急速な細胞分裂、正しい胚のパターン形成を伴います。受精後約8日、Mのtruncatula胚は、初期の子葉段階に達します。形態学的特徴を正確に温室条件下で受精後日数で示されていません。このように、発生中の胚の段階を示すために、効率的な標準化されたアプローチは、遺伝的regulの研究に貴重なものです初期の接合体胚のエーション。 本稿では、マメ科植物のモデルMに胚発生の生物学的研究のために開発した胚を収集するために、2つの標準化されたプロトコルを提供しますtruncatula。第1は、第二は、簡単にアクセス大きな胚番号を提供するために、培養葉移植片を介して、体細胞胚形成の間、胚発生およびポッド形態を関連付けることにより、接合胚を収集することです。

<table><tbody><tr><td>P4媒体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>使用 Sigma-Aldrich 化学薬品またはその他の分析グレードのサプライヤー</td></tr><tr><td>主要な塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイナーな塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビタミン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>バクト 寒天</td></tr><tr><td>植物ホルモン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-ナフタレン酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>少量の1 M NaOHに溶解</td></tr><tr><td>アブシジン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>少量の1 M NaOH</td></tr><tr><td>に溶解 6-ベンジルアミノプリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>加熱と数滴でMQ水に溶解 1N HCl</td></tr><tr><td>ジベレリック酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>少量のエタノール</td></tr><tr>に溶解<td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZFLIII</td><td>または類似の</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>Axiophot</td><td>または同様の、適切な光学系付き</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ツァイス</td><td>AxioCam HRc</td><td>または同様の</td></tr><tr><td>滅菌葉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL スクリューキャップ ポリプロピレン製の蓋付きポリカーボネート容器</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>オートクレーブ可能</td></tr></tbody></table>

モデルマメに初期胚発生の調節を研究するための接合体と体細胞胚を得るためのプロトコル<em&gt;のmedicago truncatula</em

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

単一細胞受精卵から始まる初期胚は、急速な細胞分裂や形態形成を通過し、形態学的に前球状、球状、心臓、魚雷と子葉の段階によって特徴づけられます。この進歩的な開発は複雑な分子ネットワークの厳しい規制下にあります。開発の同様の段階で十分な初期胚を収穫することは初期胚の細胞および分子の規制を調査するために不可欠です。 Medicagoにするための、例えば 8日早い子葉段階に到達するためにtruncatulaながら初期胚発生が短い急速な形態形成を受けるので、これは簡単ではありません。ここでは、二つのアプローチによって問題を解決します。最初のものは、接合胚の段階を示すうえで胚発生とポッドの形態との間の結合を確立します。これは、特にポッドスパイラルと棘の開発の数に基づいています。 in vivoでのを補完する別の方法tudiesは体細胞胚を生産するために培養葉の外植片を介してです。オーキシン（1-ナフタレン酢酸）、サイトカイニン（6-ベンジルアミノプリン）、アブシジン酸およびジベレリン酸 - 媒体は珍しいホルモンの組み合わせを含みます。異なる段階は、解剖せずに、カルスから成長している識別することができます。

F -異なる胚の段階は、 図2Aに示されているがF -接合体胚形成のために異なる胚段階に対応する異なるポッド構造が図1Aに示されています。同じ段階でポッドを選択することにより、非常に均一である胚珠のサンプルは、（ 図3A）を得ることができます。 RT-qPCRの胚を使用して、特定の遺伝子が容易に検出され、経時的研究は、9を評価することができます。いくつかの追加の解剖は、胚（ 図3B）の更なる濃縮のためにできるようになります。処理in situハイブリダイゼーション戦略を容易に任意の相補的な光を含む研究（ 図4A、B）および電子顕微鏡8と同様に行うことができるために。このシステムでは特に価値が下垂体や懸垂帯（ 図4A、B）の独自性です。 <p class="jove_content"...

目標は、モデルマメ科植物Medicago truncatulaが、非マメ科植物のシロイヌナズナモデルを補完する初期植物胚形成の調節を調査するために容易に利用できることを示すことです。ポッドの形態は接合子の胚形成段階にリンクされており、組織培養を使用して胚を収集するためのプロトコルも提供されています。

モデルマメに初期胚発生の調節を研究するための接合体と体細胞胚を得るためのプロトコル<em&gt;のMedicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

以下の手順の全体的な目的は、植物の胚発生における遺伝的制御を調査するために、異なる発達段階でどれだけの接ぎ木胚が得られるかを示すことです。これは、莢の形態と異なる接合子胚の発達段階を関連付けること、および葉の説明片を培養して異なる段階の体細胞胚を得ることで達成できます。最終的に、定量PCRおよびβ-グルクロニダーゼを用いて、関心のある特定の発達段階における胚発生中の遺伝子発現を評価することが可能です。これらの手法の利点は、in vivo実験において個々の花にタグ付けを行う必要がないこと、および最適化されたin vitroの手順が相補的な実験的アプローチを提供することにあります。操作の詳細をより正確に追跡できるため、培養手順を視覚的に実演することが重要です。in vivoの手順はWangが、in vitroの手順はKim Nolanが実演します。接合子胚の発育を促進するため、Monte cargo trinocular植物の種子の種皮表面に穴を開け、種子が完全に浸かるようにして一晩水に浸してください。翌日、直径15 centimeterのポット10個に培養土を入れ、それぞれに種子を3粒ずつ播種し、温室に移動させます。14時間の光周期、および日温23°C・夜温19°Cの条件下で植物を育成し、発芽後は最も健全な苗を1ポットあたり1株選別して残します。また、莢が現れた際に茎が登れるよう、苗の周囲にトレリスを設置します。目的とする初期胚発生段階を得るため、表1および図1に記載された適切な段階で採取してください。次に、ピンセットを用いて莢から種子を分離します。あるいは、より精細な顕微鏡観察を行う場合は、ホーイヤー液で完全に透明化させ、標準的な光学顕微鏡で胚を観察することで、胚の段階を確認できます。その後、実験に必要な数のULを莢の中央領域から採取し、体細胞胚発生のダウンストリーム解析に向けて適切な温度で保存します。培養において容易に胚を形成できるtran atula品種の、伸長中の茎にある最新のほぼ完全に展開したtate葉から、in vitroで葉片を採取します。脱水を避けるため、tate葉を培養ポット内の湿ったペーパータオルの上に保持します。次に、UV滅菌したバイオセーフティキャビネット内で、葉をオートクレーブ可能なスプリングティーインフューザーのメッシュボールに入れます。オートクレーブ済みの250 milliliterスクリューキャップ付きポリカーボネート製培養ポットに入れた70% Ethanolにインフューザーを浸します。30秒後、葉組織の水気を切り、次に1/8に希釈した漂白剤溶液にインフューザーを10分間浸します。時々穏やかに回転させながらポットを軽く振り、余剰な液体を捨てます。次に、インフューザーをすすぎます。新しいポットに入れた新鮮な脱イオン水で、もう一度すすいでください。その後、滅菌済みのピンセットを使用して、茶葉をインフューザーから新鮮な培養液（滅菌済みの脱イオン蒸留水を入れたポット）に移し、滅菌キャップを締めて密封します。次に、葉を逆さまにして揺らしながらすすぎます。その後、滅菌水に小葉を浮かべて、インプラントのプレート作成に備えます。無菌操作を用いて、滅菌済みの個々の小葉の縁を切り揃えます。次に、残りの長方形を、中脈が各外植体プレートの中央に来るように、8～10 mm × 3～5 mmの長方形の外植体に2～3個切り出します。直径9 cmのABA封印済みの寒天固化培地入りペトリ皿に、通常の葉の向きを維持するため、外植体を裏向きに6個ずつ配置します。次に、ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、温度管理された室内にて28 °Cの暗所でインキュベートします。3週間後、滅菌済みのステンレス製スパチュラとピンセットを用いて、分化している孔状外植片を新鮮な培地へ継代します。カルス形成が進み、カルスの大きさがここに示した最大の外植片のサイズを超えると、約4週間で最初の胚が観察されるはずです。新鮮な培地へ継代する際は、個々のカルスの50%のみを移してください。最終的に実体顕微鏡を使用し、4〜8週間の培養期間にわたって異なる胚の段階を回収し、実験目的に応じて外植体を処理します。示した通りに接合子胚を採取した後、後続の手順としてC2ハイブリダイゼーションやその他の適切な戦略を用いることができます。これらの画像で示されているように、プレート上の外植体を追跡することで、SSISとSpencerの明確な差異を観察することができ、これが特に重要となります。4週目から8週目にかけて、異なる段階にある体細胞胚を特定し、即座に分析するために採取することができます。例えば、これらのデータは、初期のOlein段階にある胚が、ある種類のmedicago Tula eoin遺伝子の発現を示し、別の種類では示さないことを説明しています。体細胞胚システムの特筆すべき利点は、植物体全体を再生させることなく、カルスの形質転換を実施できることです。実際に、本手法で示されたように、β-グルクロン酸由来酵素を用いることで、胚発生の異なる段階における遺伝子発現を可視化することが可能です。ビデオを視聴したことで、アンドレスを取得するためのポッドの選択および解剖方法について十分に理解できたはずです。また、体細胞胚発生後の無菌的に調製された外植体をプレートに播種する方法についても、十分に理解しておく必要があります。これらの技術により、胚の成長、発達、および栄養貯蔵に関連した胚発生初期段階の転写調節の研究が可能となりました。

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Research

JoVE Journal

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学ぶ Medicago truncatulaを用いた初期胚発生の遺伝的調節研究法。莢の形態と接合体胚発生段階を関連付け、葉片培養で体細胞胚を取得するプロトコルを解説します。

モデルマメに初期胚発生の調節を研究するための接合体と体細胞胚を得るためのプロトコル

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