Name: のアップライトイメージングショウジョウバエエッグチェンバース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学ぶショウジョウバエ卵巣管の直立イメージング法。グリセリンゼリー包埋と共焦点顕微鏡で卵室極部の細胞構造を高解像度で可視化し、濾胞上皮の形態と配列を詳細に解析する革新的な手法です。

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私たちは、ハエコミュニティのメンバー、特にデニス・モンテル博士、リン・クーリー博士、ペルニル・ロース博士からの試薬に対する支援に感謝します。Flybase、Bloomington Drosophila Stock Center、Developmental Studies Hybridoma Bankにそれぞれ情報を提供し、フライストックと抗体を提供していただいたことに感謝します。 LMは、教育省の助成金、GAANN(Graduate Assistance in the Areas of National Need)トレーニングフェローシップ(P200A120017)、およびNIGMSの学生開発最大化イニシアチブ助成金(2 R25-GM55036)によってサポートされています。 顕微鏡研究の一部は、NSF MRI助成金DBI-0722569およびKeith R. Porter Core Imaging Facilityによって支援されました。 研究は、MSGに授与されたNSF CAREER Award(1054422)とMarch of DimesのBasil O'Connor Starter Scholar Awardによって部分的に支援されました。

Ovariolesの1。解剖<ol><li>追加された活性乾燥酵母を新鮮なフライ食品のバイアルに約15 2-4日齢の雌のハエや少数の男性を転送します。バイアル用のプラグとして綿を使用し、高湿度を保つために綿に水を数滴を追加します。 </li><li>段8-10卵室の数を最大にするために14〜16時間、25℃のインキュベーター内の場所バイアル。 注：インキュベーション時間は、温度および所望の段階に応じて変化する。 </li><li>次の日のために、必要に応じて解剖メディアを準備し、0.1M KPO 4とNP40ソリューションは、（材料を参照）。 </li><li> CO 2を使用してハエを麻酔し、解剖顕微鏡下に置く。ピペットガラスうつ病スライド内の各キャビティ内に解剖メディアの数滴。 </li><li>一人の女性フライダウン翼を持つテーブルトップと東洋へ約30度の角度でそれぞれの手で鉗子を持ちます。あなたの非利き手では、Aで彼女を把握し、ピンセットを用いて、女性を拾う胸部の近くに腹部のnterior、およびうつ病のスライド（ 図1Aの挿入図）で解剖メディアに彼女を沈める。 </li><li>鉗子の他のペアで、腹部の腹側後部に外骨格を把握し、を貫通。後部端の卵巣をつかみ、その後腹部からそれらを引き出し、うつ病のスライドの反対側に新鮮な培地に入れる。 （ 図1Aの挿入図）。腸を引き離すことは避けてください。死体を捨てる。 </li><li>すべての卵巣を解剖されるまで、他の女性のハエで繰り返します。男性を捨てる。 </li><li>鉗子の1対の、（最大の卵室の近く）の後方端で卵巣を保持し、もう一方の手で最も前方の卵室（germarium）の1を挟ま鉗子のペアを使用。 （ 図1A）。 </li><li>ゆっくりと着実に、卵巣シースの外に卵巣小管チェーンを引っ張る。すべての目的の卵室がRになるまで個別にovariolesを解剖していきemoved。 </li><li>繰り返しますが、すべての解剖卵巣のための1.7から1.8を繰り返します。 </li><li>完了したら、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、0.6ミリリットルチューブにovariolesを移す。 </li><li> ovariolesは、チューブの底に沈殿、定着し、染色のステップに進みましょう。 </li></ol> 2.免疫蛍光（IF）Ovariolesの染色<ol><li>ピペットで注意深くovariolesから解剖メディアを削除する。すべてのovariolesまたは卵室を削除しないように注意してください。 ovariolesと解剖メディアの約50μlのままにしておきます。 </li><li>チューブ中の0.1M KPO 4緩衝液150μlの16％パラホルムアルデヒドの50μlのを追加し、それらを修正するために卵室にソリューションを追加します。 10分間ロッキングしながらインキュベートする。注意：ホルムアルデヒドは有毒である。 </li><li>固定液を除去し、0.5ミリリットルNP40の洗浄緩衝液で2回すすぐ。 </li><li> RTで15分間ずつ2回洗浄する。 </li><li>その後の工程のために、標準的なIFプロトコル15を参照してください。 <ol><li>簡単に言えば、固定後に、追加適切な希釈で一次抗体と4℃でO / Nインキュベートする。 （：200希釈液1）二次抗体を追加し、NP40で数回洗浄する。 </li><li> NP40中で数回洗浄し、その後DAPI（1：1,000）を追加し、10分間、その後の洗浄を繰り返します。プロトコルが完了したIF回、卵室にPBS中50％グリセロールの200μlを添加し、室温で2時間放置。 </li><li> 、溶液を除去し、PBS中70％のグリセロールと交換し、そしてホイルでカバーしています。取り付けの準備が整うまで4ᵒCでサンプルを置きます。一方、ステップ3に進みます。 </li></ol></li></ol>グリセリンゼリースライド3.事前準備<ol><li>スパチュラを使用してゼリーグリセリンの少なくとも4 mlで測定し、ハーフウェイマークにガラス細胞培養管を埋める。 30分間55℃の水浴中でグリセリンゼリーを溶かす。 </li><li> 2顕微鏡スライド上に原液からのグリセロールの小滴、約300μLを、注ぐ。組織を使用して、薄い1aにグリセロールを広めるスライドの各々にわたるヤー。これは、ベースを提供し、ステップ5.6で、グリセリンゼリーを容易に除去することができます。 </li><li>フィルタリング千μlのピペットチップのオフ先端をカット。各顕微鏡スライドにゼリーゆっくり暖かいグリセリンの1,000〜1,500μLを転送するために使用するカットピペットチップ。バブルを防ぐために注意してください。 </li><li>グリセリンゼリースライドを設定するために、室温で5分間座ってみましょう。 </li><li> 60ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿内の各グリセリンゼリースライドを配置し、ラップでカバーしています。 4℃CO / Nにおける場所。必要に応じて、ストアは4℃で最長5日間ゼリースライドグリセリン。 </li></ol> 4.取付エッグチェンバース<ol><li>ステップ2.5、1グリセリンゼリースライド全体で70％のグリセロールで卵室のピペットいくつかの3μlの滴からのサンプルを使用して。すべての卵室は、このスライド上になるまでピペッティング3μlの滴を続行。各ドロップは、少なくとも10卵室が含まれていることを確認してください。一方、55℃の水浴中でグリセリンゼリーの培養管を加熱する。 </li><li>解剖顕微鏡下で卵室とグリセリンゼリースライドを置きます。卵室のみ一滴の視野（ 図1B）になるように倍率を調整する。 </li><li>スプーンのように30ゲージの針を用いて、所望の段階の卵室を拾う。必要な場合には、ナイフなどの針を用いて卵巣小管チェーンから目的の卵室を分離する。 </li><li>イメージングに干渉する可能性デブリを回避するために、前方（ 図1E -1）左に向けて、第グリセリンゼリースライドに卵室を転送する。少なくとも7つの卵室があるまで繰り返し列（ 図1C）に並んだ。 </li><li>すべての目的の卵室は第二グリセリンゼリースライドに転送されるまで、7の新しい列を形成する。 </li><li>組織とねじれの小片を切り取り。軽くそれぞれ1に触れて、卵室から過剰のPBS-グリセロールを吸収するために使用します。卵室を削除しないように注意してください。 </li><li>断つフィルタリング200μlのピペットチップの先端。卵室のすべての列をカバーするために、グリセリンゼリー150μlのを転送するために使用します。 注：列をカバーするのに必要なグリセリンゼリーの量は卵室段と列の数に基づいている。量を調整することができる。 </li><li>グリセリンゼリーのトップ層が完全に（ 図1D）固化するまで取り付けられた卵室は室温で5分間座ってみましょう。 </li><li>置き60ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿に搭載された卵室のスライドとは、ラップでカバーしています。 4℃CO / Nでストア（光退色が懸念される場合には、暗所で行わ）グリセリンゼリー層が一緒に固化することを可能にする。 </li></ol>イメージング用エッグチェンバースの5準備<ol><li>解剖顕微鏡下に取り付けられた卵室のスライドを置きます。卵室の1列のみが視野に入るように倍率を調整する。 </li><li> 45°の角度ミニチュアメスを用いて、straigをカット（卵室の後側に近い）卵室の最初の列の右側に沿ってhtのライン。 （ 図1D-E） </li><li>次に、列の最後の卵室上部の最初の卵室の上下にカット。この時点で、卵室の列には、三方をカットする必要があります。 </li><li>卵室（ 図1E -3）の前方側にできる限り近いマイクロナイフ、列の左側に沿ってスライスし、使用。 </li><li>カットカラムに冷たい1X PBT100μlのピペット。 </li><li>スライド上の残りの部分を残して、卵室のカット列の三辺の周りに余分なグリセリンゼリーを削除し、破棄するように丸い刃へらを使用してください。 </li><li>卵室の前方側で行われたカットでへらを挿入し、主要グリセリンゼリーブロックから列を分離する。 </li><li>反転した（5.8.1）または直立のどちらかのためのサンプル（5.8.2）顕微鏡を準備します。 <ol><li>倒立顕微鏡用：転送トン卵室の前方側を下に向けてカバースリップに卵室の彼が列。グリセリンゼリーのすべての列を削除し、マウントされるまで繰り返します5.2から5.8を繰り返します。乾燥からそれらを防ぐために卵室の各ブロックの上に50％のPBS-グリセロールの滴のカップルを追加します。直接カバースリップ上の画像卵室。 </li><li>正立顕微鏡の場合：前方側を上にして顕微鏡スライドに卵室の列を転送します。グリセリンゼリーのすべての列が削除され、顕微鏡スライドにマウントされるまで繰り返します5.2から5.9を繰り返します。 ＃1 1/2カバーガラスで卵室とカバーブロックの各ブロックの上に50％のPBS-グリセロールの滴のカップルを追加します。 </li></ol></li></ol>

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著者には競合する金銭的利益はありません。

ここでは、エンド·オン視点から卵室を開発し、マウントする方法を説明し、画像小。イメージング卵室のための一般的な技術は、横方向の景色のために最適化し、蛍光抗体で染色したときに主に内外方向包細胞の正確な可視化を可能にしている。複数の焦点面を見るのZ-スタックまたは3次元再構成助剤の使用が、それでも楕円形の卵室（ 図2D）の極の細胞内解像度には不十分である。このような超解像として最新顕微鏡技術を部分的に克服することができるが、これらの方法は高価であり、常に利用可能ではない。我々は、はるかに小さい卵室に使用するショウジョウバエ胚24,25直立イメージングプロトコルを適応している。胚に比べて卵室のはるかに小さいサイズを考慮するための方法でいくつかの重要な変更があります。記載された技術の重要な要素は、物理的なSEPARです胚が要求されていない個々のチャンバ、のATION。もう1つの変更点は、（4.4）を搭載中に第2のグリセリンゼリースライドを使用することである。卵チャンバのサイズおよび他の卵室の茎細胞を介してそれらの結合は、針で操作を必要とし、グリセリンゼリーの破壊につながる。したがって、卵室...

キイロショウジョウバエの研究は、現象の広い範囲の遺伝的調節に大きな洞察を提供してきました。卵形成は、組織パターニング、細胞極性の変化、細胞周期の切り替え、および翻訳調節1,2,3,4を含む多くの異なる発生プロセスを調査する扱いやすい方法を提供するので、特に、卵の開発に関する広範な研究があった。卵形成時の重要な形態形成のイベントは（5で検討）ボーダー細胞と呼ばれる細胞のセットの仕様、運動性の獲得、および移行である。細胞移動するので、動物の形態形成の重要な特徴であり、このプロセスの遺伝的調節は、よく保存されているため、ハエで決定メカニズムは、他の文脈において重要である可能性が高い。従って、我々は国境細胞遊走の分子制御を研究している。私たちの研究のために、我々は、発展途上の卵の前極を観察する新しい方法を開発した、ここで、境界セルは、それらが詳細に開発かを検討するために、発生する。 卵巣内では、様々な発生段階の卵室が薄いシース（ 図1A）に収められていovariolesと呼ばれるチェーンに沿って存在する。各卵室は、1個の卵を形成するために移動します。卵形成の間に、いくつかの異なる細胞型が協調して開発しなければならない。 D.ショウジョウバエの卵室は、単層濾胞上皮6に囲まれた1卵母細胞を含む16生殖細胞から成る。特殊化した細胞の小さな数は、上皮の前部および後部の極で発生する、極性細胞と呼ばれる。 6-8ボーダー細胞は極性細胞5,7により誘導された卵室の前方上皮、に由来する。中期卵形成（ステージ9）では、ボーダー細胞は、その隣人から切り離し、卵室5,7の後部に卵母細胞に到達するために看護師セル間で移動する。この移動は、達成されなければならない境界セルは、この集団の細胞遊走の種類て、2つの非運動性極性細胞の周囲のクラスタに残っている。境界セルクラスタの移行を成功さは受精のために必要がある、卵の殻の卵門の適切な発展を保証します。 前極細胞は、シグナル伝達カスケードを活性化することにより、境界細胞の運命を指示する。ポーラー細胞は卵母細胞の発達8,9の段階8の間に包細胞を、隣接上、Domeless（DOME）、膜貫通受容体に結合するサイトカイン、不対（UPD）を、分泌する。 UPDの結合は、転写のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子（STAT）8,10,11をリン酸化するヤヌスチロシンキナーゼ（JAK）を引き起こす。 STATはその後転写を活性化するために、核に移動します。遅い境界細胞（SLBO）STATの直接的な転写ターゲットであり、また、境界細胞遊走12に必要とされる転写因子である。卵室の側面図は、Tを示している帽子STAT活性は、前方上皮8,11,13-全体の勾配で規制されている。極性細胞に最も近い包細胞は、このように、彼らは国境細胞になると、隣接する生殖系列の組織に侵入、活性化したSTATの最高レベルを持っている。 ボーダー細胞が内で指定されているかを理解し、上皮から切り離すために、我々は組織が編成されているかを観察する必要があります。我々は、前·オン視点から卵室を表示する場合は、極性細胞周囲の毛包細胞中のSTAT活動の放射状の対称性を期待する。エンド上のビューは、より正確に前と異なる焦点面で細胞を比較するより剥離時の膜タンパク質と細胞間のインタフェースの違いを示すであろう。卵室が楕円形と茎細胞によって互いに取り付けられているので、それらが困難前方アーキテクチャを観察すること、横方向にスライド上に沈降する。このように、卵室の極にある細胞に関する多くの情報があります側面図から推測されて。一部の情報は、光退色光セクション、光散乱、のアルゴリズムの3-D再構成、及びZ軸方向の分解能の悪い限界を介して取得することができるが、超解像顕微鏡14のような高価な技術が存在しない場合、この情報は、以下の詳細および信頼性を高める。セクションベースのイメージング（例えば、電子顕微鏡またはミクロトーム切片）他の種類のアーチファクトのために可能性を増加させる、脱水を含む組織の大規模な操作を必要とする。従って、我々は画像Dに新しい方法を開発キイロ卵室直立している。この方法は、すでに（ 審査中で、代表的な結果とマニングらを参照）運動性の細胞が運命づけられているかの解明に有用であることが証明され、卵形成の他の側面の研究でより広く貴重である可能性が高いしている。

<table><tbody><tr><td>0.1 M リン酸カリウム緩衝液 (KPO4 Buffer)</td><td></td><td></td><td>3.1 g の NaH2PO4&bull を加えます。H2Oと10.9gのNa2HPO4(無水)を蒸留したH2Oにすると、1Lの容量になります。最終溶液のpHは7.4になります。このバッファーは、4°Cで最大1ヶ月間保存できます。</td></tr><tr><td>16%パラホルムアルデヒド水溶液、EMグレードの</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>メタノールフリーでGFP蛍光</td></tr><tr><td>30G x 1/2インチの針&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>規則的な斜角</td></tr>の<tr><td>活動的な乾燥のイースト</td><td>ジェネシー科学</td><td>62-103</td><td>女性のハエを太らせるために</td></tr><tr><td>ウシの血清アルブミン</td><td>PAA細胞培養会社</td><td>A15-701</td><td>NP40で使用されなさい 洗浄緩衝液</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>の精密科学用具</td><td>11295-10</td><td>Dumostarの合金、biologieの先端; 鋭い先端は卵巣の解剖</td></tr><tr><td>のために必要であるDAPI(4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml 原液&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>サプリメント解剖培地(10%)に追加&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラス培養管</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>ガラス窪みスライド</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>厚さ 1.2 mm ダブルキャビティ</td></tr><tr><td>グリセリン ゼリー&nbsp;</td><td>Electron Microsocpy Sciences</td><td>17998-10</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>IBI Scientific</td><td></td><td>IB15760 70% in PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML(</td><td>Nonidet P-40と交換可能)&nbsp;NP40 Wash Bufferに使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ライカ蛍光ステレオスコープ&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカSP5共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td>40x/0.55NA ドライ対物レンズ&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td>ステンレス鋼</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 洗浄バッファー</td><td></td><td></td><td>50 mM TRIS-HCl、150 mM NaCl、0.5% Ipegal、1 mg/ml BSA、および 0.02% アジ化ナトリウム</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10378-016</td><td>解剖媒体 (0.6X)</td></tr> ペ<tr><td>トリディッシュ ポリステリン、滅菌済み</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 W x 15 H mm</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer 生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 パック</td></tr> 粉末<tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>0.1 M KPO4 Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>0.1 M KPO4バッファーに使用&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>シュナイダー's Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>L-グルタミンと重曹</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>蛍光抗体染色に使用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>NP40 洗浄バッファーに使用</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image解析ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>共焦点Zスタックの処理用</td></tr></tbody></table>

のアップライトイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;エッグチェンバース

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesisは、卵巣の構造が比較的単純で、特徴付けられており、遺伝子解析に適しているため、さまざまな発生過程を研究するための理想的な文脈を提供します。 各卵室は、体細胞卵胞細胞の単一の上皮層に囲まれた生殖細胞細胞で構成されています。 卵胞細胞のサブセットは、特定の段階で分化し、いくつかの異なる細胞タイプになります。 標準的な技術では、主に卵室の側面図が可能であるため、卵胞細胞の組織と同一性の限られた図が可能になります。 アップライトイメージングプロトコルは、標準的な共焦点顕微鏡で卵室を垂直に観察することを可能にするマウント技術を説明しています。 サンプルは、まず、ガラス顕微鏡スライド上の横方向(水平)位置のグリセリンゼリーの2つの層の間に取り付けられます。 次に、卵室が包まれたゼリーをブロックにカットし、カバーガラスに移し、裏返して卵室を直立させます。 取り付けられた卵室は、直立顕微鏡または倒立共焦点顕微鏡でイメージングできます。 この技術により、卵胞細胞の仕様、組織化、分子マーカー、および卵子の発生を新しい詳細で新しい視点から研究することができます。

直立イメージング法は、私たちはステージ8の前方濾胞上皮に直接卵胞細胞の運命のための一般的なマーカーを細胞の組織を見ることができ、目の不在（EYA）タンパク質だけでなく、核DNAマーカーDAPIは、さえ発現を示した細胞のこの分野全体で、すべてのセルが同様の染色強度（ 図2B」）で見ることができることを実証した。サイトカインUPDに応答して調節されるタンパク質は、しかし、可変パターンおよび発現レベルを示した。ポーラー細胞が卵の発達16,17のこの段階に頂端の前にUPDをリリースするので、STATが時々そうであった極性細胞、約放射状に活性化されることが予想される。しばしば、しかし、我々はSLBO含むSTATの下流の標的は、より複雑な発現パターンを有していたことを観察した。例えば、SLBO発現のためのGFPレポーターは、ほとんどに登場し、すべてではないが、極性細胞（ 図2Bを囲まれたセルを、そしてマンを参照してください） 当期らる。我々は、接着性の変化を反映している可能性がある、E-カドヘリン発現/局在化（ 図2B &#3...

このプロトコルで説明されている直立イメージング法は、発育中のDrosophila melanogasterの卵の極の詳細な視覚化を可能にします。 この最終的な視点は、卵胞上皮内の複数の細胞タイプの配置と形態に新たな視点を提供します。

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

この手順の全体的な目的は、ショウジョウバエの卵室の極を高解像度でイメージングすることを可能にすることです。まず、卵巣を解剖し、蛍光抗体で染色します。次のステップとして、目的の卵室を特定し、分離します。次に、選択したサンプルを配向および整列させ、グリセリンゼリーブロックに包埋します。最終ステップとして、卵室の長軸が垂直になるようにブロックを切り出し、回転させてマウントします。最終的に、共焦点顕微鏡を用いて、卵室の両極における細胞および細胞内構造を明らかにします。境界細胞の配列のような上皮組織において、光学切片法やアルゴリズムによる3D再構成を用いて撮像面に対して垂直に試料を観察する既存の手法は、光退色や光散乱を引き起こし、解像度が低下するため、精度の低い画像となる可能性があります。本手法の主な利点は、試料を新しい角度で固定し、直接観察できることです。我々はこの手法を用いて発達中の卵室の極を撮像し、濾胞細胞の組織化に関する知見を得ました。染色標本の微細操作や、従来の視点とは異なるサンプル方向への再調整が必要なため、調製および封入の手順を習得するのは困難であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。手順の実演は、私の研究室の大学院生であるLathea manningが行います。まず、凹面スライドグラスを用意し、各凹みに解剖用培液を数滴ピペットで滴下します。二酸化炭素でハエを麻酔し、解剖顕微鏡下に置きます。次に、メスのハエ1匹を、翅を下にし頭部を左に向けた状態で配置します。利き手ではない方の手で、ピンセットをテーブルトップに対して30度の角度で保持します。ピンセットでハエをつかみます。胸部の近くの腹部前方をつかみ、解剖用培地に浸します。もう一方のピンセットを用いて、凹みのあるスライドグラスの上に置きます。腹部の腹側後方で外骨格を掴み、貫通させます。後端にある卵巣を掴み、腹部から引き出して、ディプレッションスライドの反対側にある新鮮な培地の上に置きます。次に、最大卵室に近い後端で卵巣を保持し、もう一方の手で、最も前方の卵室またはジャマーをゆっくりと一定の力でつまみます。卵巣鞘から卵管鎖を引き出し、目的の卵室がすべて取り出されるまで、個別に卵管の解剖を続けます。解剖が完了したら、プラスチック製転送ピペットを使用して卵管を0.6 milliliterチューブに移し、卵管がチューブの底に沈殿するまで待ちます。ピペットを用いて、卵管から解剖培地を可能な限り慎重に除去します。新しいチューブに移す際、卵巣小管や卵室を取り除かないように注意してください。16%パラホルムアルデヒド 50 µLを0.1 Mリン酸カリウム緩衝液 150 µLに加え、これを卵室に加えます。ロッキングしながら10分間インキュベートします。インキュベーション後、固定液を除去します。NP 40バッファーで2回すすぎ、その後、室温で0.5 mLのNP 40バッファーを用いて、1回15分間、2回の洗浄を行う。固定および洗浄後、一次抗体を加え、4°Cで一晩、または室温で3時間インキュベートする。インキュベーション後、室温で0.5 mLのNP 40バッファーを用い、1回20分間、計4回の洗浄を行う。次に、二次抗体を1:200で希釈して加え、オビアルを4°Cで3時間または一晩インキュベートします。続いて、DPIを1:1000で希釈して加え、オビアルを10分間インキュベートします。その後、室温で1回あたり20分間、0.5 mLのNP 40洗浄バッファーを用いてサンプルを4回洗浄します。免疫蛍光法（IF）プロトコルの完了後、卵室に200 µLの50% glycerol in PBSを加え、遮光した状態で室温で2時間静置します。溶液を除去し、70% glycerol in PBSに置換して、チューブをアルミホイルで覆います。サンプルは、封入準備が整うまで4 °Cで保存してください。グリセリンゼリースライドを調製するには、スパチュラを用いて15 mLのPyrex製ガラス培養試験管の約半分までグリセリンゼリーを分注し、55 °Cの水槽で30分間加熱してグリセリンゼリーを融解させます。その間に、ストック溶液のグリセロールを300 µLずつ2枚の顕微鏡スライドガラスに滴下します。ティッシュを用いて、各スライド上のグリセロールを薄い層状に広げます。グリセリンゼリーを容易に除去できるように、ベースを作成します。グリセリンゼリーが完全に溶けていることを確認してください。次に、フィルター付き1000 µLピペットチップの先端を切り落とし、気泡が形成されないよう注意しながら、温めたグリセリンゼリーを1000〜1,500 µLずつ各顕微鏡スライドにゆっくりと移します。グリセリンゼリーのスライドを室温で5分間静置し、各グリセリンゼリーを凝固させます。スライドを60 mm × 15 mmのペトリ皿に入れます。皿をプラスチックラップで覆い、スライドを4 °Cで一晩保存します。あらかじめ調製した70%グリセロール試料から、卵室を3 µLずつ数滴、グリセリンゼリースライドの上に分注します。すべての卵室がスライド上に載るまで3 µLずつの分注を続け、各滴に少なくとも10個の卵室が含まれていることを確認してください。次に、グリセリンゼリーが入った培養チューブを55 °Cのウォーターバスで加熱し、卵室を載せたグリセリンゼリースライドを解剖顕微鏡の下に配置して、視野に卵室の滴が1つだけ収まるように倍率を調整します。30ゲージの針をスプーンのように使用し、必要に応じて目的の段階の卵室を拾い上げます。イメージングの妨げとなるデブリを避けるため、針をナイフとして使用し、卵室鎖から目的の卵室を切り離します。卵室を2枚目のグリセリンゼリースライドへ移します。前方側が左を向くように、少なくとも7つの卵室が1列に並ぶまでこの操作を繰り返します。針を用いてデブリや不要な卵室を掻き出し、目的の卵室がすべて2枚目のグリセリンゼリースライドに転写されるまで、7個ずつの列を新たに作成します。キムワイプを小さくひねり、それぞれの卵室に軽く触れるようにして、余分なPBSグリセロールを吸収させます。この際、卵室を取り除かないよう注意してください。200 µLのフィルター付きピペットチップの先端を切り取り、150 µLのグリセリンゼリーを転送して、卵室のすべてのカラムを覆います。顕微鏡下で、すべての卵室カラムが覆われていることを確認してください。マウントした卵室を室温で5分間静置し、グリセリンゼリーの最上層が完全に凝固するまで待ちます。次に、卵腔を封入したスライドガラスを60 mm × 15 mmのペトリ皿に入れ、プラスチックラップで覆います。グリセリンゼリー層を暗所で共に凝固させるため、この皿を4 °Cで一晩保存します。光退色が起こる可能性がある場合は、封入した卵腔のスライドガラスを解剖顕微鏡の下に配置してください。卵室の列が1列だけ視野に入るように倍率を調整します。45度角度の小型メスを使用し、卵室の後端に近い位置で、最初の卵室列の右側に沿って直線的に切断します。次に、最上部の最初の卵室の上側と、列の最後の卵室の下側を切断し、卵室の3辺が切断された状態にします。マイクロナイフを使用して、卵室の前側にできるだけ近い状態で、列の左側を沿って切り出します。その後、ピペットを用いて、冷やした1X PBT 100 µLを、ラウンドおよびスパチュラを用いて切断した列の上に滴下します。卵室の切断されたカラムの3辺周囲にある余分なグリセリンゼリーを取り除き、廃棄します。卵室の前方側に設けた切り込みにスパチュラを挿入し、カラムを一次グリセリンゼリーブロックから切り離してスライドに封入し、イメージングに進みます。この正立イメージング法により、ステージ8における前方濾胞上皮の細胞組織を直接的に可視化することが可能です。卵胞硫酸塩の一般的マーカーであるeyes absentまたはIAタンパク質、および核DNAマーカーのDPIは、この細胞視野全体で均一に発現しており、すべての細胞が同様の染色強度で観察できることを示しています。卵室の従来的な視点と、卵室の3次元再構成によって作成された視点との対比が示されています。挿入図は回転させた軸を示しています。x軸は下方向です。z軸は左方向を向き、y軸は観察者側に向いています。z軸の分解能が低いため、個々の細胞はぼやけて見えます。したがって、この新しいアプローチはイメージングの大幅な改善を意味します。正立イメージング法により、ステージ9の卵室における前方上皮を効果的に視覚化できます。この発生段階では、ボーダー細胞が極細胞の周囲に集結します。これらの凝集したクラスターは、endonイメージングによって観察されます。このビデオを視聴することで、新しい視点からの観察を可能にするサンプルのマウント方法について十分に理解できるはずです。私たちはこの手法を用いて、選択したステージにおける発達中の卵室の極をイメージングしました。この一般的な手法は、ショウジョウバエの他のステージ、卵形成、または他の種類の小さな組織にも適用可能です。

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

メゾスコピック蛍光トモグラフィは、組織切片の蛍光顕微鏡の浸透の制限を越えて動作します。技術は、マルチプロジェクション照明と光子輸送記述に基づいています。我々は、生体内でのGFP発現翼成虫ディスクの形態形成の全身3次元可視化を実証...

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ここでは、ステンドグラスの取り付けプロトコルを提示...

の直立イメージングショウジョウバエ胚

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

この記事では、 ショウジョウバエの卵活性化の間のCa 2+を可視化するための適応性のex vivoでのプロトコルについて説明します。...

内イメージングカルシウム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵活性化で

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。...

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

ここでは、ショウジョウバエの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞(GSC)の非対称分裂のライブイメージングを行うための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、スペクトロソームタンパク質Par-1の緑色蛍光タンパク質(GFP)融合を遍在的に発現するトランスジェニックラインを使用しています。...

雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

学ぶショウジョウバエ卵巣管の直立イメージング法。グリセリンゼリー包埋と共焦点顕微鏡で卵室極部の細胞構造を高解像度で可視化し、濾胞上皮の形態と配列を詳細に解析する革新的な手法です。

のアップライトイメージング

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