脳活動のメソスケール広視野光学イメージングのために大きな横開頭術手順

この広範囲側方開頭術の全体的な目的は、皮質半球の広範な領域においてリアルタイムイメージングを行うことです。この手法の主な利点は、観察のために皮質の広い領域を露出させることができ、光遺伝学などの技術と併用できる点にあります。本手法により、異なる時間的・空間的分解能において、細胞間の神経ダイナミクスおよび異なる脳回路間の神経ダイナミクスを特性評価するための知見を得ることが可能です。

硬膜はしばしば脳表面や血管に付着しているため、出血や皮質損傷のリスクが高まります。そのため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。この手法は、脳回路の発達の根底にある神経生物学的メカニズムや、新しい経験、あるいはアルツハイマー病や脳卒中などの病理に対する生涯を通じた変化を研究するために適用できます。本手順を開始する前に、すべての手術器具をオートクレーブで滅菌し、手術の間、無菌状態が維持されるようにしてください。

手術に十分な量の脳緩衝液が用意されていることを確認します。次に、麻酔をかけたマウスをヘッドホルダー装置に移し、37 °Cに設定した温度調節機能付き加熱パッドの上に置きます。マウスの上顎を歯ホルダーで固定します。

次に、頭部を左方向に約30度回転させ、頭部の右側面を露出させます。続いて、イヤーバーの鈍端でマウスの頭部を固定します。その後、角膜の乾燥を防ぐためにタリミクス軟膏を塗布します。

脳浮腫を軽減するため、デキサメタゾンを1 kgあたり4 mgの用量で筋肉内に注射します。手術部位の皮膚を、4%クロルヘキシジンに浸した綿棒で3回拭き、続いて70%アルコールで3回拭きます。開頭部位にリドカインを皮下注射します。

解剖顕微鏡下で、耳の直後の中線から左に1 mmの皮膚をピンセットで持ち上げ、外科用ハサミで小さな水平切開を行います。右耳に向かって5〜6 mmの側方切開を行い、次に頭部の吻側に向かって切開します。最初の切開点にハサミを挿入し、吻側へ10 mm切開します。

その後、右耳周辺と右目の近くの皮膚を切開し、頭蓋骨の右側と側頭筋を露出させます。露出した領域の最大幅が少なくとも7 mmになるようにしてください。さらに手術範囲を広げる必要がある場合は、皮膚をさらにトリミングします。

綿棒を用いて、頭蓋骨の表面を円を描くようにこすり、骨膜を除去します。ヘッドプレートを確実に固定するためには、骨膜が完全に除去され、頭蓋骨が十分に乾燥していることが極めて重要です。次に、スプリングシザーとピンセットを使用して、側頭筋を頭蓋骨から分離します。

筋肉を外側に切開し、鱗状骨に到達するまで牽引します。目の近くの鱗状骨の高さに沿って走る浅側頭静脈を損傷しないよう細心の注意を払ってください。損傷すると出血が起こる可能性があります。出血は、ブレインバッファーに浸したゲルフォームで制御します。

重度の出血がある場合は、電気焼灼器を使用します。出血部位にシアノアクリレート系接着剤（ブチルシアノアクリレート）を滴下してください。この処法を開始するには、まずブレグマを標識して下部の脳領域の方向を定め、ヘッドプレートの下端周囲にエチルシアノアクリレート系接着剤を塗布し、開頭部位の上にヘッドプレートを接着させます。

その後、頭蓋骨とヘッドプレートの間の隙間を歯科用セメントで埋め、開頭部位のみを露出させます。次に、歯科用セメントが乾燥して硬化するまで待ちます。続いて、歯科用ドリルで頭蓋骨の表面に軽く傷をつけることで、頭蓋窓の領域を概説します。

ドリルを元の切込線に沿って慎重に動かし、深めていきます。その際、ドリルが頭蓋骨を貫通して脳に達しないよう十分に注意してください。同時に、数分おきにドリリングと、湿らせた丸めたティッシュによる頭蓋骨表面の拭き取りを交互に繰り返します。この非常に困難な初期工程では、下層の皮質を損傷させることなく、除去できるように高齢者の頭蓋骨を穿孔する必要があります。

ゆっくりとした動作は緩みを生み、スムーズな動作は速さにつながります。穿孔中は、ピンセットまたは回転していないドリルビットで頭蓋骨を軽く押し、定期的にたわみがないか確認してください。骨にたわみが生じ始めたら、穿孔を停止し、ウィンドウ全体を脳緩衝液に浸してください。

骨を軟化させ、硬膜が骨に付着する可能性を減らして頭蓋骨の除去を容易にするため、除去前に少なくとも5分間待機します。次に、前方端から頭蓋骨の除去を開始します。鉗子を用いて、硬膜から緩んだ頭蓋骨を慎重に剥離します。

骨が緩んで硬膜の上に浮いた状態になったら、ピンセットでしっかりと掴み、硬膜から持ち上げます。この際、骨が脳に刺さらないように十分注意してください。ピンセットとスプリングシザーズを用いて、硬膜を慎重に剥離し、切り取ります。

脳実質や血管を損傷しないよう十分に注意してください。頭蓋窓部位からすべての硬膜が除去されるまで、この操作を続けます。正しく行われれば、脳表面は非常に清潔に見え、血管が明瞭で、欠損や汚れがない状態になります。

カバーガラスに70% ethanolをスプレーし、エアダスターを用いて静かに乾燥させます。ガラスに汚れやホコリがなく、完全に清潔であることを確認してください。次に、15 millilitersの脳緩衝液に200 milligramsのアガロースパウダーを溶解させ、加熱することで1.3% agaroseを調製します。

熱いアガロースに温度計を挿入し、凝固温度のわずか上の約40 °Cまで冷却します。チューブに冷水を流すことで冷却を早めることができますが、アガロースの中に水が入らないように注意してください。温度を確認しながら、温度計でゆっくりとかき混ぜます。

アガロースを塗布する直前に、頭蓋井戸から脳バッファーを除去します。気泡や粒子があるとイメージングに影響するため、それらが存在しないことを確認してください。次に、転送パイプヘッドでアガロースを吸い上げ、脳の上に直接滴下します。

その後、速やかにカバーガラスを表面に被せ、四隅にアガロースドロップを置いてカバーガラスを固定します。ここに、広範囲の片側開頭術の顕微鏡写真を示し、各画像中の白丸でブレグマを示しています。0.5% isofluraneで麻酔をかけたマウスにおいて、対側ウィスカーへの刺激、聴覚刺激、対側前肢刺激、対側後肢刺激、およびLEDによる対側眼への視覚刺激後の皮質活性化パターンを示しています。

一次感覚皮質の活性化から10〜25ミリ秒後に、あらゆる形態の感覚刺激による正中線の活性化が認められました。この手法に習熟すれば、3〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、失血を最小限に抑え、皮質を損傷させないようにすることが重要です。

本手順を用いれば、光学イメージングなどの他のイメージング技術を併用することで、正常な脳および疾患状態の脳において、自発的活動が神経ダイナミクスにどのような影響を与えるかという重要な疑問への回答に役立てることができます。本技術の開発により、システム神経科学分野の研究者が、マウスの広範囲に離れた皮質領域間の相互作用や神経ダイナミクスを探索するための道が開かれました。このビデオでは、出血と皮質損傷を最小限に抑えながら、マウスに大規模な側方開頭術を行う方法を解説します。これにより、最も差し迫った科学的な問いに答えるために必要なデータを収集することが可能になります。