Name: 脳活動のメソスケール広視野光学イメージングのために大きな横開頭術手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶ大きな横開頭術によるマウス脳皮質の広視野光学イメージング手法。神経動態や脳回路の相互作用をリアルタイムで観察し、Alzheimer病や脳卒中などの神経疾患研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、自然科学とカナダの工学研究会（NSERC）ディスカバリーグラント＃40352でサポートされていた、キャンパスMHMにイノベーションプログラム委員長、アルバータアルツハイマー研究プログラムのためのアルバータ州、およびNSERCはMKにBIFの博士フェローシップとAIHS大学院の交わりに、CREATE。私たちは、このプロトコルの開発のため、手術の訓練のためにプルトニウムミン・ワング感謝し、そしてベアルー・ミアッサアガーとディ少飼育のために。

<html>以下のプロトコルは、レスブリッジ大学の動物実験委員会（ACC）のガイドラインに従い、動物ケアのカナダ・カウンシル（CCAC）の基準に準拠して実施されます。 1.準備<ol><li>長期の研究期間については、開いているすべての手術用品をオートクレーブし、その無菌性が手術を通して維持されていることを確認。複数の手術が必要な場合は、手術の間にオートクレーブ。 </li><li>一方で脳バッファ（少なくとも50 mL）中の十分にあることを確認します。溶液は、134 mM塩化ナトリウム、5.4 mMのカリウム、1mMの塩化マグネシウム六水和物、1.8mMの塩化カルシウム二水和物、および5mM HEPESナトリウム、5Mの塩化水素で7.4に平衡pH値で構成されています。 </li><li>誘導チャンバ内にマウスを置き、3で麻酔 - 4％イソフルラン。手術中のメンテナンスのために2.0％イソフルラン - 1.0に従ってください。撮像中に0.8％ - さらにとして低い0.4に下げますSは= &quot;XREF&quot;&gt; 5、13、14、15、適切な麻酔を維持しました。麻酔のこれらの低いレベルは、それが痛みを伴う刺激に対するareflexicまま確実にするために、マウス（約5分毎）の警戒及び頻繁なモニタリングを必要とします。 注：脱水は、マウスの体積比に高い面に問題となるとイソフルランの長期間の使用によって悪化することができます。 <ol><li> 2時間 - 生理食塩水の皮下注射、体重10g当たり0.1mLの、すべて1を使用します。 2時間 - 十分に水和すると、マウスは、一度1に排尿します。 </li></ol></li><li>密接に手術や画像全体で一貫性のある麻酔を確保するために、マウスを監視します。無人のマウスを残し、それが意識を取り戻すことはありませんことを世話をしないでください。 </li><li> 37°Cに設定し、熱調節加熱パッド上のヘッドホルダーセットアップと場所に麻酔をかけたマウスを転送します。上位teetを確保hを歯のホルダーに入れます。 </li><li>マウスの頭を左に約30°回転させて、頭の右側面を露出させ、マウスの頭を耳の鈍い端で固定します（ 図1A ）。 </li><li>角膜乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布する。 </li><li>脳浮腫を軽減するために、デキサメタゾン（4mg / kg）を筋肉内に注射する。 </li><li> 4％クロルヘキシジン（3回）と70％エタノール（3回）に浸した綿棒で外科領域を覆って皮膚を拭きます。各綿棒は一度だけ使用してください。 </li><li>外科用手袋を着用し、粘着性プラスチックラップで動物を覆う。開頭手術部位の皮下にリドカイン（8-10mg / kg; 2％エピネフリン）を注射することにより、局所麻酔薬を投与する。薬物が組織に吸収されるまで3〜5分間待ちます。 </li></ol> 2.スキンの取り外しとスカルからのマッスルの引き込み<ol><li>頭蓋骨を下に見ながらこれらの手順のほとんどすべてを実行してください解剖顕微鏡（ 例えば、0.7 - 4.5倍のパワー、状況に応じて）。 </li><li>鉗子で（ちょうど耳の後ろ）正中線の左皮膚1ミリメートルを持ち上げ、手術ハサミで小さな水平方向の切開部を作ります。 </li><li>右耳に向かって6ミリメートル横カットし、次にヘッドの吻側端部に向かって切断 - 5を作ります。 </li><li>最初の切開の時点では、はさみを挿入し、吻側10ミリメートルを切りました。 </li><li>右耳の周りの皮膚をカットし、右目の近くに頭蓋骨と頭筋の右側を公開します。露出された領域の最も広い部分は、少なくとも7 mmであることを確認してください。手術領域を拡張する必要がある場合は、さらに皮膚をトリミング。 </li><li>頭蓋骨と皮膚との間ブチルシアノアクリレート接着剤を数滴入れて切開部の周りの皮膚を修正。組織が以前に接着剤の効力を増加させるために、綿アプリケータ先端又は圧延組織で乾燥されていることを確認。 </li><li>綿棒を使用して、表面をこすります頭蓋骨から骨膜を除去するために円運動で頭蓋骨を摘出する。頭蓋骨を完全に乾燥させることによって、何も残らないようにしてください。 </li><li>春のはさみと鉗子を使用して、頭蓋骨から側頭筋を分離します。頬骨骨に達するまで筋肉を横方向に切断し、収縮させる（ 図1C ）。目の近くの頬骨骨のレベルに沿って走る表面的な側頭静脈に損傷を与えないように注意してください。そうでなければ出血が起こる可能性があります。 </li><li>脳緩衝液中に予め浸したゲルフォームで出血をコントロールする。重度の出血の場合は、熱焼灼器を使用してください。熱焼灼剤で処理した後、ブチルシアノアクリレート接着剤を出血部位に滴下する。接着剤の有効性を高めるために、綿でチップを塗布したアプリケータまたはロール状のティッシュを使用して、あらかじめ乾燥させておいてください。 </li></ol> 3.頭蓋切開術注：外科医は頭蓋骨の除去中に勤勉にしなければならず、不要な合併症を回避するために硬膜。合併症が発生しなければならないトラブルシューティングのステップが含まれています。 <ol><li>根底にある脳領域を配向するマークブレグマの位置微細先端マーカーと、又は小三角片テープを切断し、ブレグマでコーナー点のいずれか（ 図2A）。 </li><li>ヘッドプレートを貼付する前に、頭蓋骨が完全に乾燥していることを確認してください。頭蓋骨は、より多くの乾燥が必要な場合、脳のバッファーに浸したゲルフォームの適用後に素早く空気乾燥し、綿棒綿棒を使用しています。このステップは、ヘッドプレート固定（ 図1B）のために重要です。 注：骨膜がある場合には頭蓋骨に残された、または頭蓋骨はヘッドプレートに接着する前に乾燥していない場合、それはおそらく切り離します。この問題が発生した場合は、そっとヘッドプレートを削除して最初からやり直します。出血は、このプロセスの間に発生する可能性があります。それが凝固するために数分を許可した後、そっと取り外します。このプロセスは、二回以上繰り返すことが推奨されていません。 </li> &lt;Liが&gt;ヘッドプレート16の底部エッジの周りエチルシアノアクリレート接着剤を適用し、そして開頭術領域（ 図1Dおよび図2A）を介してヘッドプレートを接着します。 </li><li>暴露のみ開頭エリアを離れる歯科用セメントで頭蓋骨とヘッドプレートとの間の開口スペースを埋めます。乾燥及び硬化する歯科用セメントを待ち、典型的には5から10分（ 図2B）。 <ol><li>セメントが設定されると、簡単に脳緩衝液で十分に記入し、3浸漬することができます - 5分。 （ 図2C）を掘削する前に脳のバッファを削除するには、圧延組織を使用してください。 </li></ol></li><li>軽く歯科用ドリルで頭蓋骨の表面を採点することによって手術領域の概要を説明します。 FG¼バリと、（20 PSIの最大値に設定される）空気圧ドリルを使用し、可変速度フットペダルを用いて制御されます。 </li><li>静かにそれを深めるために、元のスコアリングに沿ってドリルをトレースし、電子ドリルが頭蓋骨を貫通して脳内に侵入していないことを確認します（ 図2D ）。訓練と湿った圧延組織で頭蓋骨の表面をダビングする間に、数分ごとに交代してください。これは、機械的摩擦と長期間の暴露から頭蓋骨の加熱と乾燥を減少させる。 注：湿ったゲルフォームの適用後、頭蓋骨は急速に乾燥します。乾燥がさらに必要な場合は、綿棒を使用してください。 注意：頭蓋骨の厚さは不均一です。例えば、頭頂 - 側隆起は最も厚い領域であり、正中線付近の頭蓋領域および足蹠領域は比較的薄い。 </li><li>穿孔中に、鉗子または動かないドリルビットで静かに頭蓋骨を押すことによって頭蓋骨の座屈を定期的にチェックします。骨が座屈し始めると、穿孔をやめ、窓全体を脳の緩衝液に浸します。 注：血液がある領域から流出すると、硬膜が損傷している可能性があります。このような場合は、semI-濡れ面積でゲルフォーム、ゆっくり綿棒綿棒でゲルフォームに圧力をかけながら血液を吸収してみてください。 </li><li>骨を柔らかくすると簡単に頭蓋骨の除去プロセスを作り、骨に付着する硬膜の機会を減らすために頭蓋骨の除去の前に少なくとも5分間待ちます。 </li><li>頭蓋骨は脳のバッファに沈めている間に、頭蓋骨の除去プロセスを実行します。 注：頭蓋骨の一部が頑固に付着したままである場合、＃11手術用メスの刃を穏やかに頭蓋骨をスコアするために使用することができます。頭蓋骨を貫通して脳に刃に穴を開けないように細心の注意を払ってください。 </li><li>前縁から始まる、優しく鉗子を用いて硬膜から緩い頭蓋骨をてこ。 注：出血少量の頭蓋骨の除去プロセス中に発生した場合、転送ピペットまたは注射器でバッファを削除し、新しいバッファーと交換してください。 </li><li>骨が緩んでいるとしたらピンセットで骨、硬膜にしっかりとグリップを「フローティング」とから骨を持ち上げます硬膜。骨を確認し脳に浸透することはありません。 </li><li>出血を制御するには、ポイントへの組織のコーナーを展開し、頭蓋井戸からバッファの大部分を除去します。綿チップ綿棒で非常に軽い圧力を加えながら急速出血領域に、緩衝液に予め浸したゲルフォームを、適用します。 注：出血は通常、骨や硬膜の表面の端から来ています。どちらの場合は正常であり、重大な血管が損傷されていない場合、出血はすぐに停止します。出血が続く場合、血液は、撮像領域上血餅シートを形成し、ウィンドウ全体を埋めることができます。 <ol><li>破裂した血管の源の周りに完全な血餅を残して血餅シートを除去するために、慎重に撮像領域から凝固した血液の部分を拾います。これはさらに多くの血液の損失を引き起こす可能性がブリードソースから血塊を削除しないように注意してください。すべての血液を洗い流すために脳の緩衝液で脳の表面を灌漑。 </li><li>触れないように注意してください繊細な脳組織または脳に異物を追加します。 5分（ 図2E） -出血が約2ため、停止するまで繰り返します。 注：この時点では、開頭は（ステップ5を参照）頭蓋窓を製造するための準備ができています。必要な場合は、（ステップ4を参照）頭蓋窓を注入する前に硬膜を削除します。 </li></ol></li></ol> 4.デュラの取り外し注：デュラ除去は細心の注意を必要とし、15分かけてかかる場合があります。 <ol><li>開頭手術から余分なバッファを離れて描画します。湿った表面を維持しながら、鉗子で硬膜の小片を取得し、穏やかに硬膜を引き裂きます。 </li><li>そっと涙と硬膜を切り取るために鉗子や春のはさみを使用してください。 </li><li>硬膜を浮遊し、それが脳から分離を助けるために、脳の表面に多くの脳のバッファをドロップします。すべての硬膜は頭蓋窓サイトから削除されるまで続けます。正しく実行すると脳が明確なBLと非常にきれいなように見えますOOD容器とない傷（2Fと図2Eを比較）。 注意：硬膜の一部の地域では、（頭頂連合野に正中近位の近くで、 例えば ）は、脳の表面に小さな細動脈に添付されており、このようなの除去は、動脈を破裂することができます。このような場合には、動脈の上に無傷の硬膜の小部分を残すように、より良いかもしれません。 VSDは、その小領域に浸透しないことがあり、これは大出血を有することが好ましいです。 </li><li> （ステップ5を参照）とすぐに脈動からの移動を最小限に抑え、さらに膨潤を防止することができるようにアガロース中脳表面に固定します。 </li></ol>頭蓋窓の準備5. <ol><li> 70％エタノールを用いてカバーガラスをスプレーし、穏やかに乾燥するために空気ボンベを使用。ガラスは無スポットやほこりの存在と完全にクリーンであることを確認してください。 </li><li>脳バッファー15mLに溶解したアガロース粉末200mgのを加熱することにより、1.3％のアガロースを調製。マイクロWを設定します。全ての寒天が溶解するまで、穏やか間における攪拌、一度に15秒 - 10に対する高いと熱aveの。 注：これらの撮像を妨害するように、気泡または粒子が存在しないことを確認します。 </li><li>ホットアガロース中に温度計を置き、までアガロースを冷却するだけで温度を凝固させる上記（〜40°C）。 注：アガロース容器の外側の上に冷たい水を実行するには、冷却プロセスを加速します。穏やかに気泡または粒子が存在しないことを確認するために連続的に攪拌します。 </li><li>すぐに寒天を適用する前に、頭蓋井戸から脳のバッファを削除します。トランスファーピペットを用いてアガロースを策定し、脳に直接アガロースをドロップします。素早く表面にカバースリップを置き、四隅にアガロースドロップでカバースリップを固定します。 </li></ol> 6.安楽死注：私たちの経験では、この手順は経験のテイク外科医少なくとも3から4の練習手術は90％以上を達成するために、成功率。経験の少ない外科医はもっと練習が必要な場合があります。開頭術またはdurotomyの間に、脳は、脳内への骨ドリルスルーパンチかのようにダメージを、維持することがあります。開頭の端にいくつかのマイナーなダメージが許されることがあります。脳が真っ赤な損傷を受けていない血管や白皮質と「クリーン」を見ていない場合は、実験が終了する必要があるかもしれません。貧しい製剤の例としては、死んだ血管を有するものを含む、または皮質が破れたり損傷した血管でマークされたとき。これらの兆候のいずれかが存在する場合、実験はそう、高品質なデータが得られます。手術/実験が成功したかどうかは、人道的に、実験の終了時にマウスを安楽死させます。 <ol><li>深く少なくとも3.5％イソフルランで麻酔。次いで、300mgの/ kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射を与えます。針は、肝臓内に挿入された場合、理想的には、死は非常に迅速（&lt;1分）であろう。 </li><li>灌流が必要な場合は、動物が深く（ステップ1.3を参照）に進む前に麻酔をかけていることを確認します。 </li><li>灌流が必要とされない場合あるいは、最低5分間待ってから、マウスが死んでいることを確認してください。呼吸、心拍の欠如だけでなく、痛みの撤退と角膜反射の欠如を確認してください。また、皮質の上に血管の淡い青/白四肢の着色や暗さのために観察します。 </li></ol>

<ol><li>Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+rapid+redistribution+of+sensory-evoked+depolarization+through+existing+cortical+pathways+after+targeted+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+basis+for+the+robust+distribution+of+blood+to+rodent+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).</li>
<li>Mohajerani, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cortical+activity+alternates+between+motifs+defined+by+regional+axonal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections.</a> Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).</li>
<li>Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirrored+bilateral+slow-wave+cortical+activity+within+local+circuits+revealed+by+fast+bihemispheric+voltage-sensitive+dye+imaging+in+anesthetized+and+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice.</a> J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).</li>
<li>Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+voltage-sensitive+dye+imaging+of+rat+cortical+activity+with+high+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio.</a> J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nrn/journal/v9/n3/full/nrn2338.html">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li>
<li>McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging+reveals+dynamic+spatiotemporal+properties+of+cortical+activity+after+spontaneous+muscle+twitches+in+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat.</a> J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).</li>
<li>Sweetnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+impairs+cortical+plasticity+and+functional+recovery+following+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke.</a> J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).</li>
<li>Yin, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+field+recordings+effectively+monitor+the+mouse+cortex+and+hippocampus+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia.</a> Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).</li>
<li>Sharp, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stimulus-evoked+cerebral+hemodynamics+in+the+awake+mouse+and+under+a+novel+anesthetic+regime%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime.</a> Scientific Reports. 5, 12621(2015).</li>
<li>Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKyweriga%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrutzendler%2C+J+%22Imaging+in+neuroscience+and+development+%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
<li>Vanni, M. P., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscale+transcranial+spontaneous+activity+mapping+in+GCaMP3+transgenic+mice+reveals+extensive+reciprocal+connections+between+areas+of+somatomotor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex.</a> J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+High-Frequency+Mesoscale+Intracortical+Maps+Using+the+Genetically+Encoded+Glutamate+Sensor+iGluSnFR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR.</a> J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).</li>
<li>Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscale+infraslow+spontaneous+membrane+potential+fluctuations+recapitulate+high-frequency+activity+cortical+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs.</a> Nat Commun. 6, 7738(2015).</li>
<li>Lim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Large-Scale+Cortical+Mapping+Using+Channelrhodopsin-2+Stimulation+in+Transgenic+Mice+Reveals+Asymmetric+and+Reciprocal+Relationships+between+Cortical+Areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas.</a> Front Neural Circuits. 6, (2012).</li>
<li>Ferezou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+cortical+sensorimotor+integration+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice.</a> Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).</li>
<li>Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mini-strokes+produce+changes+in+interhemispheric+sensory+signal+processing+that+are+indicative+of+disinhibition+within+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
</ol>

著者は、開示することは何もありません。

大きな頭蓋窓のためのこの革新的なプロトコルは、大脳皮質の時間と頭頂領域の上に同時イメージングを可能にします。光学イメージングと組み合わせることで、それが自発的かつ刺激によって誘発される活動中の皮質領域内の神経ダイナミクスを明らかにすることができます。この膨張開頭術はまた、血流および虚血モデルの横方向の血管の直接操作のインビボイメージングに有効に、中大脳動脈（MCA）の近位端を含む皮質血管網の大きな拡張を公開します。この技術は、電圧とカルシウム指示薬タンパク質23を発現するマウスの最近開発されたラインに対して非常に有用であろう。これらのマウスは、皮質に電位感受性色素をインキュベートするための必要性をバイパスの実用的な利点を提供します。これらの外因性色素は、適切に脳組織に浸透するには時間がかかる（〜60から90分）し、その穏やかな毒性によって制限されています。大きな開頭術も持っています以前VSDI 11を使用した開発ラットの脳を研究するために利用されて。新生児ラットは、はるかに大きな頭を持っており、成体マウスと同等のサイズのです...

開頭術は、脳の一部を明らかにするために神経科学者が使用する標準的な手順です。電気生理学の始まり以来、開頭術は神経科学の分野で未曾有のブレークスルーを可能にしました。大脳皮質と電極との密なマッピングは、これらのマップに基づいて仮説と理論を試験する実験につながった。我々は最近、皮質血流1,2,3および神経血管構造4の インビボイメージングのために開頭術が利用される新しい時代に入り、露出領域5,6,7内の皮質活動のリアルタイム視覚化を可能にする。多くの研究が、皮質ニューロン、グリア、およびコルの構造および機能を研究するために、 インビボ光学イメージング技術と組み合わせた頭蓋切開術を使用するがTICAL血管系8、9、さらなる調査が露出皮質の小領域によって制限され（ただし、10を参照）されています。 このプロトコルの目的は、大きな横方向の開頭術を作成squamosal骨に正中線から大脳皮質を露出し、ブレグマとラムダを超えて拡張するための方法を提供することです。この大きな開頭術は、関連皮質（retrosplenial、帯状、及び頭頂部）、第一級および第二モータ、体性感覚、視覚、及び聴覚皮質の同時観察を可能にします。この方法は、以前に皮質領域は、自発的及び刺激誘発性の皮質活動5、11、12の間に互いに相互作用する方法を複数調査する電圧感受性色素イメージング（VSDI）と結合されています。この手順の最も挑戦的な側面は、ヘッドの位置決めが含ま動物の、ヘッドプレートを固定し、頭頂骨から頭筋を分離しながら出血を回避することができます。ケアはまた、斜めの角度で頭蓋骨曲線として掘削および頭蓋骨除去プロセス中に撮影されなければなりません。

<table><tbody><tr><td>加熱パッドFHC</td><td></td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>細かいはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td>2ペア以上をお勧めします</td></tr><tr><td>春ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-00、15000-10</td><td>1ペアを硬膜除去用に指定する必要があります&nbsp;</td></tr><tr><td>ジェット歯のシェードパウダー</td><td>LANG デンタル</td><td>ジェット トゥース シェード パウダー</td>を<td>ジェット リキッド</td></tr><tr><td>ジェット トゥース シェード リキッド</td><td>LANG デンタル</td><td>ジェット トゥース シェード リキッド</td><td>ジェット パウダーと混合する液体&nbsp;</td></tr><tr><td>ドリルヘッド - 超硬バーズ FG 1/4 389</td><td>ミッドウェスト デン</td><td>タル 385201</td><td></td></tr><tr><td>アガロース パウダー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>ゲルフォーム</td><td>シンクレア デンタル カナダ</td><td>ファイザー ゲルフォーム</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ウエスタン ドラッグ ディストリビューション センター リミテッド</td><td>124125</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン 2% エピネフリン</td><td>ウエスタン ドラッグ ディストリビューション センター リミテッド</td><td>125299</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン5&nbsp;mg / mL</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>ブチルシアノアクリレート接着剤 (VetBond)</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

脳活動のメソスケール広視野光学イメージングのために大きな横開頭術手順

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

開頭術は、in vivo実験のために脳を露出させるために一般的に実行される手順です。マウスの研究では、ほとんどのラボは、小さな開頭、典型的には3ミリメートル×3ミリメートルを利用します。このプロトコルは、マウスの時間と頭頂皮質上大脳半球の大部分を露出させ、実質的により大きな7ミリメートルX 6ミリメートル頭蓋窓を作成する方法を紹介（ -横4.5ミリメートル0 - 6ミリメートル、例えば、2.5をブレグマ）。この手術を行うために、ヘッドは約30°傾斜しなければならないと頭筋の多くが後退しなければなりません。骨の除去を大量に、この手順は、手術や実験を通して麻酔した動物と急性実験のために意図されます。 この革新的な大きな横頭蓋窓の主な利点は、皮質の両方の内側と外側の領域への同時アクセスを提供することです。この大規模な一方的な頭蓋窓は、細胞間の神経ダイナミクスを研究するために使用することができ、多電極電気生理学的記録、ニューロン活動（ 例えば、内因性または外因性のイメージング）の画像化、および光発生刺激を組み合わせることによって、異なる皮質領域の間で行うことができる。さらに、この大きな開頭術は皮質血管の広い領域を露出させ、側皮皮質脈管構造の直接操作を可能にする。

<html> 6mmの横 - 単一の半球内皮質領域間の相互作用を研究するために、我々は、矢状静脈洞及び5を横切って延びる大きな開頭術を用います。この頭蓋窓は、一次（モータ、体性感覚、視覚、聴覚）、二次（視覚モータ）、および右の脳半球の対応付け（retrosplenial、帯状回、頭頂協会）皮質（ 図3A）を含んでいました。この作業のために、我々は3膜電位の変化を反映する電圧感受性色素（VSD）イメージングを使用しました。このプロトコルはまた、他の外因性（ 例えば 、カルシウム17およびグルタミン酸18イメージング）又は固有イメージング実験のために有用であろう。後肢、前肢、ウィスカー、視覚的、または0.5％イソフルランを用いて軽く麻酔したマウスの聴覚系を刺激する場合、我々は、（皮質脱分極のコンセンサスパターンを観察し&gt;図3B）。以前の研究<sup c...

このプロトコルは、マウス大脳皮質の時間と頭頂領域の上に大規模な一方的な開頭手術を作成するための方法を提示しています。これは、皮質半球の広大な面積でリアルタイムイメージングのために特に便利です。

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

この広範囲側方開頭術の全体的な目的は、皮質半球の広範な領域においてリアルタイムイメージングを行うことです。この手法の主な利点は、観察のために皮質の広い領域を露出させることができ、光遺伝学などの技術と併用できる点にあります。本手法により、異なる時間的・空間的分解能において、細胞間の神経ダイナミクスおよび異なる脳回路間の神経ダイナミクスを特性評価するための知見を得ることが可能です。硬膜はしばしば脳表面や血管に付着しているため、出血や皮質損傷のリスクが高まります。そのため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。この手法は、脳回路の発達の根底にある神経生物学的メカニズムや、新しい経験、あるいはアルツハイマー病や脳卒中などの病理に対する生涯を通じた変化を研究するために適用できます。本手順を開始する前に、すべての手術器具をオートクレーブで滅菌し、手術の間、無菌状態が維持されるようにしてください。手術に十分な量の脳緩衝液が用意されていることを確認します。次に、麻酔をかけたマウスをヘッドホルダー装置に移し、37 °Cに設定した温度調節機能付き加熱パッドの上に置きます。マウスの上顎を歯ホルダーで固定します。次に、頭部を左方向に約30度回転させ、頭部の右側面を露出させます。続いて、イヤーバーの鈍端でマウスの頭部を固定します。その後、角膜の乾燥を防ぐためにタリミクス軟膏を塗布します。脳浮腫を軽減するため、デキサメタゾンを1 kgあたり4 mgの用量で筋肉内に注射します。手術部位の皮膚を、4%クロルヘキシジンに浸した綿棒で3回拭き、続いて70%アルコールで3回拭きます。開頭部位にリドカインを皮下注射します。解剖顕微鏡下で、耳の直後の中線から左に1 mmの皮膚をピンセットで持ち上げ、外科用ハサミで小さな水平切開を行います。右耳に向かって5〜6 mmの側方切開を行い、次に頭部の吻側に向かって切開します。最初の切開点にハサミを挿入し、吻側へ10 mm切開します。その後、右耳周辺と右目の近くの皮膚を切開し、頭蓋骨の右側と側頭筋を露出させます。露出した領域の最大幅が少なくとも7 mmになるようにしてください。さらに手術範囲を広げる必要がある場合は、皮膚をさらにトリミングします。綿棒を用いて、頭蓋骨の表面を円を描くようにこすり、骨膜を除去します。ヘッドプレートを確実に固定するためには、骨膜が完全に除去され、頭蓋骨が十分に乾燥していることが極めて重要です。次に、スプリングシザーとピンセットを使用して、側頭筋を頭蓋骨から分離します。筋肉を外側に切開し、鱗状骨に到達するまで牽引します。目の近くの鱗状骨の高さに沿って走る浅側頭静脈を損傷しないよう細心の注意を払ってください。損傷すると出血が起こる可能性があります。出血は、ブレインバッファーに浸したゲルフォームで制御します。重度の出血がある場合は、電気焼灼器を使用します。出血部位にシアノアクリレート系接着剤（ブチルシアノアクリレート）を滴下してください。この処法を開始するには、まずブレグマを標識して下部の脳領域の方向を定め、ヘッドプレートの下端周囲にエチルシアノアクリレート系接着剤を塗布し、開頭部位の上にヘッドプレートを接着させます。その後、頭蓋骨とヘッドプレートの間の隙間を歯科用セメントで埋め、開頭部位のみを露出させます。次に、歯科用セメントが乾燥して硬化するまで待ちます。続いて、歯科用ドリルで頭蓋骨の表面に軽く傷をつけることで、頭蓋窓の領域を概説します。ドリルを元の切込線に沿って慎重に動かし、深めていきます。その際、ドリルが頭蓋骨を貫通して脳に達しないよう十分に注意してください。同時に、数分おきにドリリングと、湿らせた丸めたティッシュによる頭蓋骨表面の拭き取りを交互に繰り返します。この非常に困難な初期工程では、下層の皮質を損傷させることなく、除去できるように高齢者の頭蓋骨を穿孔する必要があります。ゆっくりとした動作は緩みを生み、スムーズな動作は速さにつながります。穿孔中は、ピンセットまたは回転していないドリルビットで頭蓋骨を軽く押し、定期的にたわみがないか確認してください。骨にたわみが生じ始めたら、穿孔を停止し、ウィンドウ全体を脳緩衝液に浸してください。骨を軟化させ、硬膜が骨に付着する可能性を減らして頭蓋骨の除去を容易にするため、除去前に少なくとも5分間待機します。次に、前方端から頭蓋骨の除去を開始します。鉗子を用いて、硬膜から緩んだ頭蓋骨を慎重に剥離します。骨が緩んで硬膜の上に浮いた状態になったら、ピンセットでしっかりと掴み、硬膜から持ち上げます。この際、骨が脳に刺さらないように十分注意してください。ピンセットとスプリングシザーズを用いて、硬膜を慎重に剥離し、切り取ります。脳実質や血管を損傷しないよう十分に注意してください。頭蓋窓部位からすべての硬膜が除去されるまで、この操作を続けます。正しく行われれば、脳表面は非常に清潔に見え、血管が明瞭で、欠損や汚れがない状態になります。カバーガラスに70% ethanolをスプレーし、エアダスターを用いて静かに乾燥させます。ガラスに汚れやホコリがなく、完全に清潔であることを確認してください。次に、15 millilitersの脳緩衝液に200 milligramsのアガロースパウダーを溶解させ、加熱することで1.3% agaroseを調製します。熱いアガロースに温度計を挿入し、凝固温度のわずか上の約40 °Cまで冷却します。チューブに冷水を流すことで冷却を早めることができますが、アガロースの中に水が入らないように注意してください。温度を確認しながら、温度計でゆっくりとかき混ぜます。アガロースを塗布する直前に、頭蓋井戸から脳バッファーを除去します。気泡や粒子があるとイメージングに影響するため、それらが存在しないことを確認してください。次に、転送パイプヘッドでアガロースを吸い上げ、脳の上に直接滴下します。その後、速やかにカバーガラスを表面に被せ、四隅にアガロースドロップを置いてカバーガラスを固定します。ここに、広範囲の片側開頭術の顕微鏡写真を示し、各画像中の白丸でブレグマを示しています。0.5% isofluraneで麻酔をかけたマウスにおいて、対側ウィスカーへの刺激、聴覚刺激、対側前肢刺激、対側後肢刺激、およびLEDによる対側眼への視覚刺激後の皮質活性化パターンを示しています。一次感覚皮質の活性化から10〜25ミリ秒後に、あらゆる形態の感覚刺激による正中線の活性化が認められました。この手法に習熟すれば、3〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、失血を最小限に抑え、皮質を損傷させないようにすることが重要です。本手順を用いれば、光学イメージングなどの他のイメージング技術を併用することで、正常な脳および疾患状態の脳において、自発的活動が神経ダイナミクスにどのような影響を与えるかという重要な疑問への回答に役立てることができます。本技術の開発により、システム神経科学分野の研究者が、マウスの広範囲に離れた皮質領域間の相互作用や神経ダイナミクスを探索するための道が開かれました。このビデオでは、出血と皮質損傷を最小限に抑えながら、マウスに大規模な側方開頭術を行う方法を解説します。これにより、最も差し迫った科学的な問いに答えるために必要なデータを収集することが可能になります。

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオとプロトコルは、げっ歯類のガラスで覆われた頭蓋窓を移植する方法を示します。これらの製剤は、数ヶ月の時間スケール上の新皮質のin...

慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

方法は新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける蛍光色素でニューロンを標識に記載されている。まず、内因性シグナル光学イメージング、機能マップを得るために使用されます。その後、2光子顕微鏡は、マップのミクロドメイン内でラベルとイメージニューロンに使用されます。...

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

私達はのためのマウスモデルにおける間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ（TSCW）を作成する方法を紹介...

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック<emインビボで&gt;</em&gt;光干渉断層イメージング

ここでは、同じ生体動物内での侵襲的外科的介入(例えば生検)の前後の脳腫瘍細胞の高解像度タイムラプスマルチフォトンイメージングの方法について説明する。この方法は、これらの侵襲的外科的処置が腫瘍細胞の移動、侵襲的、増殖性の行動に対する影響を単一の細胞レベルで研究することを可能にする。...

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

頭蓋骨基腫瘍の内視鏡的内視鏡手術に至る患者ワークアップに拡散MRIトラクトグラフィーを統合するプロトコルを提示する。術前および術中段階においてこれらの神経イメージング研究を採用するための方法について説明する。...

内視鏡内視鏡頭蓋基外科における拡散MRIトラクトグラフィーの役割

この記事では、注入カニューレを補ったカスタムメイドのイメージングウィンドウの準備と、マウスの海馬のCA1領域への移植を示す。...

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

本プロトコルは、フードラップ、透明シリコーン、およびカバーガラスを使用して、大きな(6 x 3 mm2)頭蓋窓を作成することについて説明しています。この頭蓋窓は、同じマウスでの in vivo...

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

ここでは、ラットとマウスの高密度微小皮質電位法(μEcoG)記録のための2つのプロトコル(外科手術、移植、記録方法を含む)を紹介します。μECoG記録は、ラット聴覚皮質における層流ポリトロード記録、またはマウス体性感覚皮質における神経活動の光遺伝学的操作と組み合わせて行われます。...

げっ歯類における層流ポリトロードと光遺伝学とマイクロ皮質電図法の統合による皮質処理のマルチスケール研究

私たちは、光学多層干渉断層撮影(OMLIT)という新しいイメージング技術を導入し、脳標本内のすべての細胞をメソスケールで偏りなくイメージングでき、同じサンプル上のテープベースのシリアル走査型電子顕微鏡のイメージングワークフローにシームレスに統合できます。...

走査型電子顕微鏡互換光学イメージング法によるメソスコーピック全細胞脳マッピング

このプロトコルは、マウスに大きくて再封閉可能で硬膜を温存する頭蓋窓を作るための二段階の外科的手法を説明しています。この技術により、デフォルトモードネットワークのような分散型深部脳ネットワークから数週間にわたる慢性的かつ多モーダルな電気生理学的記録が可能になります。...

マウスデフォルトモードネットワークの縦方向多モーダル電気生理学記録を可能にする大型再封閉可能な頭蓋窓の手術プロトコル

学ぶ大きな横開頭術によるマウス脳皮質の広視野光学イメージング手法。神経動態や脳回路の相互作用をリアルタイムで観察し、Alzheimer病や脳卒中などの神経疾患研究に応用できます。

脳活動のメソスケール広視野光学イメージングのために大きな横開頭術手順

さらに動画を探す