Name: エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 学ぶRT-qPCRによる水質検査法で、遠心超濾過と核酸抽出を用いてエンテロウイルスとノロウイルスを定量するEPAメソッド1615。ポリオウイルス回収率20%、マウスノロウイルス30%を達成し、飲料水と環境水の安全性評価に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、標準曲線試薬の開発に使用されたクローンを準備してくださったEric Rhodes博士、サンプル処理の支援を提供してくださったBrian McMinn氏、統計解析に携わってくださったLarry Wymer氏、この研究で使用されたSabinポリオウイルス血清型3を提供してくださったウィスコンシン州マーシュフィールドの米国農務省のMark Borchardt博士、そしてワシントン大学のH. W. Virgin博士に感謝します。 ミズーリ州セントルイス、マウスノロウイルス用。また、著者らは、ストックラボ試薬の調製を支援してくれたGretchen Sullivan氏、マウスノロウイルスストックの増殖を支援してくれたMohammad Karim博士、水サンプルの収集を許可してくれた地元の民間井戸の所有者と公益事業体に感謝しています。この研究はEPAによってレビューされ、公開が承認されましたが、必ずしも公式のEPAの方針を反映しているとは限りません。商号または商用製品への言及は、使用を推奨または推奨するものではありません。

注：使用データシートには、プロトコルのすべてのステップを追跡するために、例えばデータシートは、補足材料表S2、S4に示されています。 1.標準曲線の準備<ol><li> TSMを使用して、2.5×10 8粒子/ mlの濃度になるように、製造業者によって供給された濃度から、それを希釈することにより標準曲線試薬（ 例えば 、アーマードRNA EPA-1615）の作業ストックを準備します（/ mlの2.5×10 8 GC） IIIバッファ。 -20℃で1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアを使用して250μlのアリコートに作業用ストックを分割します。 注 ：代替標準曲線の試薬 ​​として使用するための準備作業のウイルスの株式およびプラスミドの手順については、補足材料プロトコルステップS1を参照してください。 </li><li>作業ストック一定分量の一つ以上を解凍します。 、2.5×10 7の濃度を与え、2.5×10 6、2.5×1.5 mlのマイクロチューブを使用して5〜10倍連続希釈液を調製します10 5、2.5×10 4、2.5×10 3、GC / mlです。 <ol><li> TSM IIIバッファの225μlに2.5×10 8 GC / mlの作業ストックの25μLを追加することで、最初の希釈を準備します。ボルテックスミキサーを使用して、5-15秒間混合します。 </li><li> TSM IIIバッファの225μlにステップ1.2.1で製造した希釈液の25μlのを追加することで、次の希釈を準備します。再び混合し、次の3つの10倍希釈液を準備するために同様のプロセスを続行します。 </li></ol></li><li>標準曲線作業ストックからのRNAとすぐに第3の手順を用いて5希釈液を抽出します。 </li></ol> 2.第三紀濃度<ol><li>上部試料室に、1×PBS、0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）の少なくとも10ミリリットルを添加することによって収集された各試料についての遠心濃縮器（分子量30,000カットオフ）を準備します。そのソリューションは、薄いチャネル濃度室を満たしていることを確認した後、4℃でO / Nを保持します。 <ol><li&gt;流体を捨てます。過剰のBSAを除去した後、水を廃棄し、滅菌試薬グレードの水の少なくとも10mlでコンセントレータ1時間をすすぎます。 </li></ol></li><li>別々の遠心濃縮にSに等しい各試験サンプル、アッセイのサンプル量から二水濃縮物の量を追加します。 <ol><li>式1を使用して、Sを計算します <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Dをアッセイオリジナル水試料の容量である場合には、TSVは、総サンプル量で、FCSVは最終濃縮サンプルボリュームです。 Sの計算の例については、補足材料S2を参照してください。 </li></ol></li><li>遠心20スイングバケットローターで4℃で3,000-6,000×gで各試験サンプル - 30分。薄いチャネル濃度室でボリュームを確認してください。 <ol><li>ボリュームは、20分以上再度400μlの、遠心分離機よりも大きい場合。番目のサンプルまで遠心分離し続けます電子薄いチャネル濃度室未満400μlに減少しました。上清を除去しないでください。 </li></ol></li><li>ウイルス回収を増加させるための無菌0.15 Mリン酸ナトリウム、pHは7〜7.5の1mlで遠心濃縮の側面を洗ってください。サンプルが400未満μlに減少されるまで、3,000-6,000×gで、4℃で再び遠心分離。この洗浄工程をさらに1回繰り返します。 </li><li> 、100〜200μlのマイクロピペットを用いて慎重に測定し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（ すなわち 、マイクロチューブに200μlのを転送し、残りの流体が完全に描画することができますまで、マイクロピペットを調整することで、残りの濃縮物を測定するために、各濃縮サンプルを転送）ピペット先端に。 0.15 Mリン酸ナトリウム、pHは7〜7.5は400±2μlに最終容量を調整するために、追加します。 </li><li> processeすることはできません任意の濃サンプル3.保留に進むことで、すぐに核酸を抽出dはすぐに超えない24時間4℃で。 </li></ol> 3.核酸単離<ol><li>ラベルされた1.5mlの微小管を分離するために、ステップ1.3からステップ2.5または標準曲線希釈から各試験サンプルから三次濃縮のステップ3.3で説明し、200μlのように調製した抽出緩衝液200μlを追加します。 -70℃以下に残りの三次濃縮液を凍結。以下の例外を除いて、血液試料のスピンプロトコルの核酸抽出キットを製造者の指示に従って、各試料から核酸を抽出します。 </li><li>水試料にプロテアーゼを追加したり、核酸抽出キット付属の抽出緩衝液を使用しないでください。 </li><li>キャリアRNAを抽出緩衝液を準備<ol><li>キャリアRNAの310μgの含有するバイアルにキャリアRNA希釈緩衝液の310μLを加えます。溶解した後、約50μLを含む6アリコートに分割する混ぜます。 -20で保存°C。 </li><li> 0.027μgの/μlとキャリアRNAの濃度を得るための抽出緩衝液1ml当たり解凍したキャリアRNAの28μLを追加します。抽出キットに付属のものの代わりにキャリアRNA-改正抽出緩衝液を使用してください。 </li></ol></li><li>リボヌクレアーゼを添加することにより溶出バッファーのマスター溶液を調製する（RNアーゼ）阻害剤抽出キットで提供される溶出緩衝液への400単位/ mlの最終濃度まで。 <ol><li>カラムにRNaseインヒビターで溶出緩衝液50μlを配置することにより、スピンカラムを結合核酸から溶出RNA。 1分間待ってから、室温で1分間、6,000×gで遠心します。 </li><li>ステップ3.4.1を繰り返し、その後、列を削除し、廃棄します。 </li></ol></li><li>ステップ3.4.2からのRNA抽出物のアリコートを準備します。 6標準曲線作業ストックの一定分量と、少なくとも15μlの各を含む各標準曲線の希釈を準備します。少なくとも含む他のすべてのRNAサンプルの4アリコートを準備22μlの各。それらは4時間以内に逆転写することによって処理することができる場合、4℃で各サンプル、標準曲線コントロールの1つのアリコートを保存し、それ以外の場合は、-70℃以下にすべてのアリコートを保存します。 </li></ol> 4.逆転写（RT） <ol><li> 10倍に等しい（マイクロリットル中）に存在するオリゴヌクレオチドのナノモル（ナノモル）の数量を用いて各バイアルにPCRグレードの水の量を添加することにより、表1にリストされた各オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの100μMストック溶液を調製しますバイアル（バイアルラベルにか、製造元の仕様書に示されるように（例えば、）363μlの36.3ナノモルを含むプライマーを懸濁します。溶解するために混ぜます。 <ol><li>ソリューションの作業10μMのを準備するために、PCRグレードの水で100μMのソリューションを1:10に希釈します。 </li></ol></li><li> 表2のガイドを使用して、クリーンルーム内でのRTマスターミックス1と2を準備します。RT Masteのピペット16.5μLウェルマルチチャンネルピペットを用いて各PCRプレートにミックス1 R。 </li><li>解凍、凍結した場合、各フィールドのサンプルとラボ強化さサンプルマトリックスからの核酸抽出物（LFSM; すなわち 、播種水マトリックス試料）。 <ol><li> RNase阻害剤の400単位/ mlを含有する溶出緩衝液中で5と1：25：各フィールドとLFSMサンプル1を希釈します。 </li><li> 、研究室試薬ブランク（LRB、すなわち、試薬グレードの水を使用して、負の品質管理）、性能評価（PE;解凍、凍結した場合、しかし、ラボ要塞はブランク（ すなわち 、シードされた試薬グレードの水を使用して、ポジティブな品質管理LFB）を希釈していません; すなわち 、播種試薬グレードの水サンプルは、試験の開始前に実験室の性能）、パフォーマンステスト（PTを評価するために使用される; すなわち 、試験中に実験室での性能を評価するために使用される分析者に未知の力価を有する播種試薬グレードの水サンプル）、NAバッチネガティブ抽出制御、または標準曲線のセットからRNAを抽出しました。 </li></ol&gt; </li><li> （RTプレート例については、図S1を参照）試験サンプルおよびコントロールの三重井戸を使用して、別々のPCRプレートのウェルに、すべての試験サンプル、コントロール、および標準曲線からのRNAの6.7μLを置 ​​き、標準曲線のために井戸を複製します。 <ol><li>テンプレートを含まないコントロール（NTC）のための独立したPCRプレートのウェルに溶出緩衝液の6.7μLを置きます。 2-8 RTプレートあたりNTC、最初のサンプルのための2つを使用して、すべての第四の追加のサンプルについて、2つ以上を含みます。 </li><li>プレート全体に負の抽出とNTCコントロールを配布します。 </li></ol></li><li>耐熱プレートシーラーでPCRプレートをシール。 5-10秒間のサンプルを混合した後、≥500×gで簡単に遠心します。 </li><li> 99℃で4分間プレートをインキュベートした後、サーマルサイクラーで4℃に急速に冷却します。 ≥500 XG簡単で再び遠心分離。 </li><li>慎重にプレートシールを除去し、各ウェルにRTマスターミックス2の16.8μlを添加します。セアル≥500×gで混合し、短時間の遠心分離に続いて、耐熱性のプレートシーラー、と再びプレート。 </li><li>サーマルサイクラーでプレートを置き、42℃、99℃で5分、で60分間続いた後、4℃の保持サイクルにより、25℃で15分間実行します。 </li><li>プロセス直ちにまたは定量PCR（ステップ5）、またはストアサンプルで8時間内で以下を-70℃で、それらを処理することが可能になるまで。 4℃で8時間以内に処理することができる店舗のサンプル。 </li></ol> 5.リアルタイム定量PCR（定量PCR） <ol><li>いずれの試験サンプルを実行する前にG型肝炎試薬のロットごとに肝炎G Cqの値を意味するかを決定します。 <ol><li> NTCコントロール（ステップ4.1.1）のために記載したように調製10の反復を用いてRTアッセイを実行します。 （5.5.3までの流れ5.2）以下に説明するように、肝炎GのqPCRアッセイを実行します。 10回の平均はCq値を計算します。 </li><li> RTマスターミックス1中のG型肝炎試薬量を調整した （表2）、必要に応じて、25及び32単位の間の平均Cqの値を取得します。水の容積を変化させることにより上昇または下降量を補償することは、アッセイあたり16.5μLでのRTマスターミックス1最終容量を維持するために追加されました。 </li><li>調整された量を反映するために、5.1.2および変更表2にステップ5.1.1を繰り返して調整を確認してください。 </li></ol></li><li>私は肝炎のためのノロウイルスgenogroup II、マウスノロウイルスについては、表7（ノロウイルスgenogroupのV）、 および表8 は 、表6、ノロウイルスgenogroupためエン ​​テロウイルスについては、表3のガイドを使用して、クリーンルーム内でのqPCRマスターミックスを調製し、 表4 および表5 G.ミックスは、各マスターミックスして、≥500×gで簡単に遠心します。 </li><li>各定量PCRアッセイのためによくし、別々のプレートあたり14μLを使用して、標識された光学反応プレートの適切なウェルにPCRマスターミックスを追加します（図S2 </stron図S1におけるRTのレイアウトに基づいて、定量PCRアッセイのための可能なレイアウトのためのG&gt;）。 </li><li>凍結した場合、室温でステップ4.8からRTプレートを解凍します。プレートミキサーを使用して混合した後、≥500×gで簡単に遠心します。 </li><li>光学反応プレートの適切なウェルに適切なcDNAの6μLを分注します。 ≥500 XG簡単で光反応プレートと遠心機でサンプルを混ぜます。 <ol><li>他のすべてのqPCRアッセイを実行する前に希釈されていないと希釈フィールドとLFSMサンプルの肝炎GのqPCRアッセイを実行します。フィールドまたはあるLFSMサンプル&lt;エンテロウイルスやノロウイルス定量PCRアッセイのための意味肝炎G Cqの値よりも大きい1 Cqを値の最低希釈を使用してください。 </li><li>メーカーの指示に従って定量PCRサーマルサイクラーソフトウェアをセットアップします。標準として標準曲線サンプルを識別し、それぞれの標準曲線希釈に、 表9に示したゲノムコピー値を入力します。 </li><li&gt;は95℃と60℃で1分で15秒間の45サイクル、続いて95℃で10分間定量PCRサーマルサイクラーでプレートを実行します。 </li></ol></li><li>各標準曲線は表10に与えられた許容可能な値を満たしているかどうかを決定します。例については、補足材料セクションS3を参照してください。 <ol><li>式2を使用して、標準曲線の全体的な標準偏差（STDDEV）を算出 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> Cqの各標準曲線の複製について報告された値であり、Cqのは複製の各セットの平均値であり、#Cqは正の値（ すなわち 、未確定ではない）を持っているすべての標準コントロールの複製のためのCqを値の合計数であり、＃性感染症は、正の値を持っている標準コントロールの数です。 </li><li>定量PCRサーマルサイクラー・ソフトウェアは、各標準曲線の傾きを計算していない場合は、式3を用いて勾配を計算し、60; <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> Cqには、使用される最高と最低の希釈液の平均値であり、GCのログをどこ表9から使用される最高と最低の希釈のためのゲノムコピー値のログです。 </li><li>式4を用いて、R 2の値を計算します。 <img alt="式（4）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> Cqには、すべての Cqを値の平均であるとログGCは各反復の平均ログのGC値です。 </li><li>式（5）使用して％の効率を計算します。 <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> 表10に指定された条件と、各サンプルの平均GC値を満たす標準曲線に基づいて、すべてのテストサンプル用のサーマルサイクラーソフトウェアによって計算されたGC値を記録します。で基準を満たしていない標準的な曲線を持つ任意のサンプルを再実行<strong&gt;表10または任意の負のコントロールは（LRB、NAバッチネガティブ抽出制御、またはNTC）が陽性です。再実行する際に判定基準を満たすために失敗したり、偽陽性のコントロールを持っている任意のサンプルを再処理。 </li><li>式6を用いて、各試験サンプルのためリットル当たりGC（GCのL）を決定します。 <img alt="式6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> GCは、ステップ5.7からの平均のゲノムコピー数であり、係数「199」は、第三級濃度の間に発生する容量削減の総希釈率で、RNA抽出およびRT-qPCRのステップ、DFは阻害を補償する希釈係数であります、およびDは、リットルでアッセイオリジナル水試料の体積です。 GC Lの計算の例については、補足資料のセクションS4を参照してください。 </li><li> 199により、ステップ5.5からの平均GC値を乗算し、0.3で割って合計LFBのGCおよびLRBのサンプルを計算します。 </li></ol>

<ol><li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li>
<li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li>
<li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li>
<li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li>
<li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus%2C+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li>
<li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li>
<li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22820-F-12-058%3A+Recreational+Water+Quality+Criteria%22">820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria</a>. , 1-63 (2012).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66(2010).</li>
<li>Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , U. S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li>
<li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus%2C+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li>
<li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li>
<li>Sen, K., et al. EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-56 (2004).</li>
<li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li>
<li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction. Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1990 Nov 11-15, , 833-853 (1990).</li>
<li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li>
<li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li>
<li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment%2C+using+real-time+reverse+transcription-PCR%3A+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li>
<li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li>
<li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li>
<li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li>
<li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay%2C+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li>
<li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li>
<li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li>
<li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria%2C+MS2+and+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , U.S. Environmental Protection Agency. (1996).</li>
<li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li>
<li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteroviruses%2C+adenoviruses%2C+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li>
<li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li>
<li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li>
<li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water%2C+using+Salmonella+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt%2C+humic+acid%2C+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ソースと飲料水のウイルス汚染の大規模国家の研究では、複数の分析ラボを使用する必要があります。これらの条件下での標準的な方法は、複数の研究室で生成されたデータが比較可能であることを保証するために必要とされます。ウイルス検出のための多くの公表された分子的方法が、非常に少数の標準化された分子の方法があります。 EPAメソッド1615は、具体的には、RT-qPCRにより水マトリックス中エンテロウイルスやノロウイルスの検出のために設計された標準化された方法です。 16,17と春に肝炎の検出ウイルスとノロウイルスに適用されている。標準化された分子法は、食品（2013年4月7日CEN / ISO TS 15216から1とCEN / ISO TS 15216から2）でウイルス検出のために利用可能です水16。すべての標準的な方法は、実験室による汚染に間およびイントラ実験室変動や偽陽性のデータを最小限にするために品質性能のコントロールや基準を含める必要があります。さらに、Eを誤ったデータを低減するために、PA法1615は、処理し、一方通行の作業の流れの間に仕事の分離を定めた分子法のEPAの指導、18の後に続きます 。これは、G型肝炎1,19内部統制およびRT-qPCRの15の阻害剤に起因する偽陰性の結果を最小限に抑えるための手順が含まれています。これは、すべてのフィールドデータがフィールド1リットル当たりのゲノムコピーで表現または飲料水をサンプリングするようにサンプリングし、水を分析し、両方の水の標準化されたボリュームと一緒に定量的アッセイを使用しています。効率的な単一の管（ワンステップ）RT-PCRアッセイは、市販されているが、この方法は、意図的に独立したアッセイを使用します。これは、各反応でアッセイすることができる試料の量を最小化するという欠点を有しているが、複数のプライマーセットを使用することでより大きな柔軟性を与えます。 RT-のqPCRアッセイは、によって制限され、のみ使用プライマーおよびプローブと同じくらい良い、おそらく何のプライマーセットは、グループ内のすべてのウイルスの亜種を検出しませんされています。エンテロウイルスプライマーセットがあるため選ば​​れましたそれは、20,21はエンテロウイルス血清型の多種多様を検出し、それによって検出されたウイルスは、未処理の地下1の消費による健康への影響に関連している、保存された5 &#39;非コード領域を標的とします。二つのプライマーセットは、Iが22,23 genogroupノロウイルスの検出のために使用されます。最初は、若い子供の健康への影響との間には強い相関関係に起因して選択し、ウイルス1を検出しました。彼らは株24,25の広い多様性を検出するので、私はプライマーセット第genogroupとgenogroup IIノロウイルスに使用するプライマーセットを選択しました。 水の中のウイルスRNAを検出するための定量PCRおよびRT-qPCRの手順の主な利点にもかかわらず、いくつかの制限があります。まず、消毒剤によって不活性化されるものを含む感染性および非感染性両方のウイルス粒子は、これらの方法によって増幅することができます。 Borchardtの結果は、これが未処理の地下水fの問題のあまりであることを示唆しています地域社会と同様のROMの帯水層は、消毒地表水1の場合よりも勉強しました。培養可能なウイルスのため、この問題は、培養物26,27との組み合わせでPCRを使用して克服することができます。この問題はまた、核酸架橋剤28-30の使用を介していくつかのウイルスの対処されてきました。この後者のアプローチは、ウイルス、次亜塩素酸により不活性化し、UVにより不活性化にとって有効ではないため、より効果的です。 これらの分子の手順の第2の制限は、典型的にアッセイすることができる濃縮試料の量は、培養手順6,31に使用されるものよりもはるかに小さいことです。この問題は、多くの場合、いずれかのサンプルは小さい体積中に再懸濁し、又は第三のサンプル濃縮工程6,32,33を添加することによってすることが可能な有機凝集による二次標準濃度のためのポリエチレングリコールベースの手順を置換することによって処理されます。方法1615は、centrifを使用していますugal限外ろ過は、第三級の濃度を提供します。遠心限外濾過、水と試験サンプル中の任意のウイルスの両方の濃度および分子アッセイの小分子インヒビターが低下コンポーネント30,000未満ダルトンを除去します。水中に存在した任意のウイルスのための&gt; 10 5の全体的な濃縮係数のこの三次濃縮工程の結果がテストされています。 第三の制限は、環境試料中の分子の手順の阻害剤の存在です。阻害剤を除去するための多くのアプローチが開発されてきたが、何のアプローチは、本質的な阻害のレベルを推定するように設計された内部対照を利用して、すべての水マトリックスおよびウイルス型6,34,35のために有効ではありません。この方法で使用される肝炎G試薬は、すべての反応および抑制を推定するためのRT-qPCRのアッセイにおいて、ウイルスRNAの一定のレベルを提供することによって、この要件を満たします。とき、tの最高の彼は、サンプル濃縮物は限りウイルス濃度は、濃度14,15阻害剤よりも高くなっているように希釈することができ、除去アプローチは阻害を削除することができない阻害剤。 本明細書中に記載の標準曲線の手順は、利点と主要な制限の両方を持っています。利点は、試薬が、単一の制御は、全てのアッセイに使用されることを可能にする、単一の試薬に供給するに必要なすべてのコンポーネントを使用することです。この試薬は、特にノロウイルスアッセイのために有利です。ノロウイルス粒子は、それが非常に困難な標準として使用するためのウイルス粒子を得ることができる感染した個体から得ることができます。多くの重要な利点は、RNA標準は、RNA 36の正確な定量化のために不可欠であるものとして、それは、一つの試薬 ​​のすべての標的のRNAウイルスのRNA標準を提供することです。しかし、正確にウイルスを定量する能力は、マトリックス効果は考慮されないという事実によって制限されます。これは、ゲノムのコピーを意味します数値は、絶対的とみなすことができず、相対的な用語でのみ考慮されるべきです。これは、標準曲線ワーキングストックのアリコートの十分な数（ステップ1.2）は、完全な研究をカバーするために準備することをお勧めします。例えば、各250μlのアリコートを6 RTプレートに十分な試薬を提供します。それは研究が500サンプルの分析が必要になることが知られている場合、12のアリコートの最小値は、（アリコートあたりRTプレート/ 6 RTプレートあたり500サンプル/ 7サンプル）を必要とされるであろう。 EPAメソッド1615は、パフォーマンスベースの方法です。多くのメーカーは、本明細書で指定されたものと同等の試薬を作り、これらの試薬があれば、性能基準が満たされているように置換され得ます。また、正のRT-qPCRのコントロールとして機能し、標準曲線は、パフォーマンスの問題のトラブルシューティングを行うには価値があります。性能は、RNAの分解、試薬貯蔵寿命、冷凍庫の故障、機器のキャリブレーション、および技術的なエラーに辞退することができます。パフォーマンスの問題が容疑者でなければなりませんこれらは標準曲線のための性能仕様を満たさない場合、EDは、標準曲線を図4に示したものと異なる場合、または。 RT-のqPCRアッセイは、非常に堅牢です。完全な失敗は、RNAまたは技術的なエラー（たとえば、欠けている試薬）の不適切な取り扱いに起因する可能性が高いです。細心の注意は、リボヌクレアーゼからRNAの分解を低減するために、抽出し、RT工程間のRNAサンプルの取り扱いに注意が必要です。 地下から地上と試薬グレードの水およびマウスノロウイルスの回収からポリオウイルスの回収率は、EPAメソッド1615の性能受け入れ基準（ 表11）を満たし、他33,37,38によって報告されたものと類似しています。 LFBサンプルからのマウスノロウイルスの回収率は、ポリオウイルスのものよりはるかに低かったとポリオウイルス固有の合格基準を満たしていないだろう。試薬グレードの水から下のマウスノロウイルスの回復の理由は不明です。本明細書の結果と同様に、カリムとcolleaゲスは、水道水39から4％のノロウイルスGI.1の回復を報告しました。リーら 37は、マウスノロウイルスと18％の人間ノロウイルスGII.4それぞれ、ディスクフィルターを用いて蒸留水から26％の平均回収率を報告しました。リーや同僚と同様の条件を用いて、金とコはそれぞれ38、これらのウイルスのために46％と43％の回収率を観察しました。ギボンズら 40海水からのヒトノロウイルスGII.4の回収率100％を中心に得られるが、キムとコ38は、類似または海水よりも高い濃度で蒸留水に塩を添加すると、著しくマウスウイルスの回収率を低下させ、得られたことがわかりましたGII.4回復で約2倍の減少です。

定量的PCR（定量PCR;この原稿で使用される用語の定義については、補足資料を参照）、逆転写定量PCR（RT-qPCRを）は、環境や飲料水の中に人間の腸内ウイルスを検出し、定量化するため、特に行う多くのウイルスのための貴重なツールであります複製または細胞培養系では不十分複製しません。どちらのツールは、多くのウイルス型は世界1-6全体の環境や飲料水の中に存在していることを実証しました。彼らは飲料水で見つかったウイルスが流行患者7-10によって流されたものと同一であることが示されているような疾患のアウトブレイク調査の間に増幅されたゲノム断片の塩基配列決定と相まってこれらの使用は、水性ウイルス伝播の証拠を提供してきました。 定量PCRおよびRT-qPCRの両方が便利な公衆衛生上のツールです。例えば、米国環境保護庁（EPA）によって行われた研究からのデータは強い関係があることが示されました定量PCRやレクリエーション水域における健康影響によりトゥイーン指標の測定。その結果、EPAの最終2012レクリエーション水質基準は、レクリエーションビーチ11,12を監視するための定量PCR法を含んでいます。 RT-qPCRの1によって測定されるようにBorchardtらはまた、地下水に未処理の地下水やウイルスを使用して、地域社会における急性胃腸炎との間に強い関連性を発見しました。 本稿の目的は、EPAメソッド1615 13,14の分子アッセイ成分を記述することです。このアッセイは、陽電フィルタを通過し、環境や飲料水の元の体積に基づいてリットル当たりエンテロウイルスとノロウイルスゲノムコピー（GC）の定量的な推定値を提供するために、RT-qPCRのを使用しています。分子の手順の概要を図1に示されている。プロトコル部1は、標準曲線を調製するための手順を詳述します。これらの規格は、RNが含まれている試薬から調製されます全てのプライマー/プローブセットの標的配列のコピー。第2節では、第三級濃度の手順を説明します。第3節では、濃縮水と対照試料からRNAを抽出するための手順を説明します。各試験サンプルからのRNAを逆三重アッセイおよびプライム転写（第4）のランダムプライマーを使用して転写されます。 （; 図2第5項）、各逆転写反応からcDNAをqPCRにより三重に分析されている5つの別々のウイルス特異的なアッセイに分割されます。アッセイは、多くのエンテロウイルスとノロウイルスおよびRT-qPCRを15に阻害されている試験サンプルを同定するためのG型肝炎RNAを含む試薬を検出するように設計されている科学文献（ 表1）からのプライマーおよびプローブを使用します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mlチューブチャンバー</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg;C クール ブリック</td><td>Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Buffer II and 25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg;C冷凍庫</td><td>VWR97043-346</td><td>手動霜取り冷凍庫</td><td></td></tr><tr><td>である必要があります-70&deg;Cまたは低温冷凍庫</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルチャンバー</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>アーマードRNA EPA-1615</td><td>アスラゲン</td><td>カスタムオーダー</td><td>RT-qPCRアッセイの定量に使用</td></tr><tr><td>アーマードRNA G型肝炎ウイルス</td><td>アスラゲン</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Steris</td><td>Amsco ラボシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>NuAir 実験装置 供給</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td> <td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>結晶グレード以上</td></tr><tr><td>バッファー AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>キャリア RNA 希釈バッファー</td></tr><tr><td>バッファー AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>抽出バッファー</td></tr><tr><td>キャリアRNA</td><td>Qiagen</td><td>該当なし</td><td>バッファーに付属のキャリアRNAを使用 AVL</td></tr><tr><td>遠心分離ボトル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-562-23 または 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>クールセーフボックス</td><td>ダイバーシファイドバイオテック</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>プロメガ</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 プローブ マスターキット</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td>ス <td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>02-682-550</td><td>リボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼフリーのチューブをスナップキャップ付きで使用</td></tr><tr><td>マイクロサイドIII</td><td>フィッツジェラルド</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシール 'A' フィルム</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>HSA5001</td><td>ヒート耐性</td></tr><tr><td>マイクロシール 'F' フィルム</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリーズ</td><td>MSA1001</td><td>冷凍庫 耐性</td></tr><tr><td>ミニプレートスピナー</td><td>ラブネット インターナショナル</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>レイニン</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>マルチチューブチャンバー</td><td>ダイバーシファイド・バイオテック</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>光学反応プレート</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ</td><td></td>4314320</tr><tr><td>PCR ヌクレオチドミックス</td><td>プロメガ</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>PCR プレート</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリーズ</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>PCR グレードの水</td><td>ロシュ</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>米国 バイオロジカル</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>プレートミキサー</td><td>サイエンティフィック インダストリー</td>ズ <td>マイクロプレート ジーニー</td><td></td></tr><tr><td>プリオネックスゼラチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>バッファー AW1 (第 1 洗浄バッファー)、AW2 (第 2 洗浄バッファー)、AE (溶出バッファー) が含まれています。エタノールは使用前にバッファー AW1 および AW2 に添加する必要があります。キットに付属のバッファーALは使用しないでください</td></tr><tr><td>定量的PCRサーマルサイクラー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4351405</td><td></td></tr><tr><td>ランダムプライマー</td><td>プロメガ</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>RNase阻害剤</td><td>プロメガ</td><td>N2515またはN2615</td><td></td></tr><tr><td>ROXリファレンス色素</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IIまたはIII 逆転写酵素</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022または18080044</td><td></td></tr><tr><td>手術用手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4314879</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>ビバスピン20遠心濃縮器ユニット</td><td>ザルトリウス-ステディム</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

エンテロウイルスと文化およびrt-qpcrにより水中のノロウイルス発生のepaメソッド1615測定。パートiii。 rt-qpcrによりウイルス検出

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615は、環境水や飲料水中に存在するエンテロウイルスとノロウイルスを測定します。この分析法は、規制対象外汚染物質モニタリング規則のモニタリング期間 3 において、複数の分析ラボで使用するための標準化されたメソッドを持つことを目標に開発されました。ここでは、水サンプル濃縮物からのウイルスリボ核酸(RNA)の抽出と、逆転写定量PCR(RT-qPCR)を使用してエンテロウイルスとノロウイルスの濃度を定量的に測定するためのプロトコルを示します。分子アッセイのウイルス濃度は、標準曲線に基づいて、1リットルあたりのウイルスRNAのゲノムコピー数で計算されます。この分析法では、データ品質を向上させ、ラボ間およびラボ内のばらつきを減らすために、多くの品質管理を使用します。この方法は、ポリオウイルス3型およびマウスノロウイルスをヒトノロウイルスの代替として播種した地上および試薬グレードの水からのウイルス回収を調べることによって評価されています。ポリオウイルスの平均回収率は、地下水で20%、試薬グレードの水で44%でした。RT-qPCRアッセイによるマウスノロウイルスの平均回収率は、地下水で30%、試薬グレードの水で4%でした。

ここでは、逆転写定量PCRを使用して、環境水と飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを定量化する手順を紹介します。EPA メソッド 1615 のこの標準化された手順による地下水からの平均ウイルス回収率は、ポリオウイルスで 20%、マウスノロウイルスで 30% でした。

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

この手順の目的は、逆転写定量PCRを用いて、水中のエンテロウイルスおよびノロウイルスの濃度を測定することです。これは、遠心超ろ過を用いて水試料からウイルス粒子を三次濃縮することで達成されます。次に、プロトコルに従って標準曲線の試薬を調製します。続いて、ウイルス濃縮液および標準曲線試料から核酸抽出を行います。その後、1/5および1/25に希釈したウイルスRNAを、ランダムプライマーと逆転写酵素を用いて逆転写します。最後に、リアルタイムPCR装置内でウイルス特異的プライマーおよびプローブを用いてウイルスcDNAの増幅を行い、標準曲線に基づいてサンプルのゲノムコピー数を算出します。ISO 15216などの他の標準化された手法と比較して、EPAメソッド1615の主な利点は、水サンプル専用に設計されており、エンテロウイルスアッセイが含まれていることです。この手法は、環境微生物学分野のリスク評価担当者に対し、飲料水およびレクリエーション用水中のウイルスによるリスクを判定するための最新の状態を提供することができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、手法に組み込まれた標準化への対応に苦労することになります。本手法は非常に詳細であり、厳格に従う必要があります。手法のわずかな変動が否定的な結果を招く可能性があるため、視覚的なデモンストレーションが不可欠です。本日は、Nichole Brinkman、Jennifer Cashdollar、Shannon Griffin、そして私、Shay Foutが手順を実演します。私たちは全員、オハイオ州シンシナティにあるEPA国立暴露研究室の専門スタッフです。テキストプロトコルに従って標準曲線を作成した後、採取した各サンプル用に遠心濃縮器を準備します。具体的には、上部サンプルチャンバーに1X PBSおよび2% BSAを少なくとも10 milliliters加えます。一晩インキュベートし、洗浄した後、テキストプロトコルに記載されている手順でサンプルを添加し、各テストサンプルをスイングバケットローターを用いて3000から6000 times g、4 °Cで20〜30分間遠心分離します。サンプルを適切に濃縮し、新しいマイクロ遠心チューブに移した後、0.15 molar リン酸ナトリウム緩衝液を加え、最終容量を 400 µL ± 2 µL に調整します。核酸を抽出するため、抽出用緩衝液 200 µL を陰性抽出コントロール用に、また tertiary concentrate 200 µL を各テストサンプルまたは標準曲線希釈用として、それぞれ別のマイクロ遠心チューブに分注し、抽出キット製造元の説明書のテキストプロトコルの修正に従って RNA を抽出します。プロトコルに従ってプライマーとプローブを調製した後、ここで示すように、クリーンルーム内で逆転写マスターミックス1および2を調製します。マルチチャンネルピペットを用いて、16.5 µLのRT master mix oneを各PCRプレートのウェルに分注します。次に、400 units/mLのRNase inhibitorを含む核酸抽出キットの溶出バッファーを用いて、融解したフィールドおよびラボ強化サンプルマトリックス（fortified sample matrix）またはLSFMサンプルの1/5および1/25希釈液を調製します。すべてのテストサンプル、コントロール、および標準曲線の核酸を6.7 µLずつ、それぞれ別のPCRプレートのウェルに分注します。なお、テストサンプルとコントロールは3連（triplicate）、標準曲線は2連（duplicate）のウェルを使用してください。テンプレートなし対照（NTC）ウェルに、溶出バッファーを6.7 µL加えます。RTプレート1枚あたり2〜8個のNTCを配置し、最初のサンプルに対して2個、その後は追加の4サンプルごとに2個以上のNTCを、プレート全体に分散させて配置してください。耐熱性のプレートシーラーを使用してPCRプレートを密閉し、各ウェルがしっかりと密封されていることを確認します。その後、サンプルを5〜10秒間混合し、500 ×g 以上で短時間遠心分離します。サーモサイクラーを用い、プレートを99 °Cで4分間インキュベートします。プレートを4 °Cまで冷却し、再度短時間遠心分離します。次に、プレートシールを慎重に取り除き、各ウェルに16.8 µLのRT master mix twoを添加します。プレートをシールして軽く混合および遠心分離した後、プレートをサーモサイクラーにセットし、25 °Cで15分間、続いて42 °Cで60分間、99 °Cで5分間処理し、最後に4 °Cで最大8時間保持するか、長期保存の場合は-70 °Cでサンプルを保存します。クリーンルームにおいて、エンテロウイルス、ノロウイルスGenogroup I、ノロウイルスGenogroup II、およびG型肝炎ウイルスのガイドに従い、定量PCRマスターミックスを調製します。各マスターミックスを混合し、短時間遠心します。次に、この例に示すように、ラベル付きの光学反応プレートの適切なウェルに、qPCRアッセイごとに別々のプレートを使用して、PCRマスターミックスを14 µLずつ加えます。適切なウェルに、対応するcDNAを6 µLずつ分注します。その後、サンプルを混合し、短時間遠心します。プロトコルに従ってサーモサイクラーのソフトウェアを設定し、他のすべてのqPCRアッセイを実行する前に、未希釈および希釈したフィールドおよびラボ強化試料マトリックス（LFSM）サンプルを用いて肝炎G qPCRアッセイを実行します。各サンプルの平均Cq値を、肝炎G試薬の新ロットごとに予め決定された平均肝炎G Cq値と比較してください。エンテロウイルスおよびノロウイルスのqPCRアッセイには、平均肝炎G Cq値より1 Cq値未満の差である、フィールドまたはLDFサンプルの最も低い希釈度を使用します。製造元の指示に従って、定量PCRサーモサイクラーのソフトウェアを設定します。標準曲線サンプルを標準として指定し、各標準曲線の希釈段階について、ここに示したゲノムコピー値を入力します。プレートを95°Cで10分間加熱した後、90°Cで15秒間、次いで60°Cで1分間のサイクルを45回繰り返します。各標準曲線が、この表に示された許容値に適合しているかを確認します。テキストプロトコルの式に従って標準偏差、傾き、R²、および効率（%）を算出した後、この表で指定された基準を満たす標準曲線に基づき、サーモサイクラーのソフトウェアによって算出された全テストサンプルのゲノムコピー数（GC値）および各サンプルの平均GC値を記録します。今算出した平均ゲノムコピー数をGCとして、以下の式を用いて各テストサンプルの1リットルあたりのGCを決定します。係数199は、3次濃縮、RNA抽出、およびRT-qPCRステップの間に行われた容量反応の総希釈倍率である。DFは阻害を補正するための希釈倍率であり、Dはリットル単位で表した元の水サンプルの分析量である。最後に、先に算出した平均GC値に199を掛け、0.3で割ることにより、ラボ添加ブランク（LFB）またはラボ試薬ブランク（LRB）サンプルの総GC量を算出します。全体として、ウイルスの回収率は、3箇所の公共処理場および1箇所の私用井戸から回収された計7組のサンプルセットから得られた、対となるフィールドLSFM地下水サンプルを用いて決定されました。LSFMサンプルの種菌レベルは、ポリオウイルス3型の300万MPN、およびマウスノロウイルスの500万PFUでした。標準曲線用試薬が当時入手困難であったため、EPAメソッド1615の初期の単一ラボ評価にはマウスノロウイルスが使用されました。地下水試料において、ポリオウイルスの平均回収率は20%（標準誤差2%）であったのに対し、マウスノロウイルスの平均回収率は30%（標準誤差3%）でした。各LFSMの通常の現場地下水試料からは、エンテロウイルスおよびノロウイルスは検出されませんでした。ラボ添加ブランク（LFB）およびラボ試薬ブランク（LRB）試料は、ウイルスを添加した試薬グレードの水および未添加の試薬グレードの水を用いて測定されました。ポリオウイルスの回収率は平均44%（標準誤差1%）であった一方、マウスノロウイルスの回収率は平均4%（標準誤差0.5%）であった。本図は、エンテロウイルスおよびノロウイルスジェノグループIIの代表的な標準曲線を示している。ノロウイルスジェノグループIIの曲線は、R2値0.9987、全体の標準偏差0.14、効率101%であり、標準曲線の基準を満たしている。エンテロウイルスの曲線は、R2値0.9874、全体の標準偏差0.58、効率103%で標準曲線の性能基準を満たしているが、感度はノロウイルスの曲線よりも約100倍低く、したがって検出限界が高い。このビデオを視聴することで、RT-qPCRを用いた水系エンテロウイルスおよびノロウイルスの濃縮および検出方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得すれば、濁度の低い試料の場合、約8時間で完了させることができます。濁度の高い試料については、特に第3段階の濃縮ステップにおいて、追加の時間が必要となる場合があります。この手順を行う際は、逆転写の前にサンプルをRNase汚染から保護することが重要です。PCRは非常に強力で有用な手法であることを忘れないでください。偽陽性および偽陰性の結果を最小限に抑えるために、ワークステーションの分離や適切なコントロールの使用などの予防策が必要です。

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

環境

オープンリーディングフレーム1（ORF1）ORF2接合領域に特異的なプライマーとTaqManプローブを利用して子どもの便からノロウイルス分離株の検出および遺伝子型の識別のためのワンステップRT-PCRアッセイ、ノロウイルスゲノムの中で最も保存領域です。説明します。非商業的、費用対効果の高いRNA抽出法が詳述されている。...

のTaqManワンステップRT-PCR法によるキッズスツールからノロウイルスの検出とGenogrouping

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA Method 1615は、環境水や飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを濃縮するために、電気陽性フィルターを使用します。この原稿では、メソッド 1615...

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

ここでは、バッファロー・グリーンモンキー腎臓細胞株を使用して培養可能なウイルス全体を測定する手順を紹介します。この手順は、環境水および飲料水中の感染性ウイルスの発生を測定するための標準化されたツールを提供します。...

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

環境硬質表面上のノロウイルスの検出と定量のために、マクロフォームベースのサンプリング方法が開発され、評価されました。...

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

ヒトアデノウイルスのスパイクを使用して、少量の水サンプルの最適なウイルス濃度条件を特定するためのアプローチが開発されました。ここで説明する手法は、他のウイルスターゲットの濃度パラメータを特定するために使用され、大規模なウイルス濃度実験に適用されます。...

水からのウイルス濃度のため、小容量の手順

ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去<em&gt;その場での</em&gt;回復ブリード水と細胞生存率への影響

私たちは、水のクリーンで正確なポイントサンプリングのためのシンプルで非侵入型で信頼性の高い方法であるVacuSIPを紹介します。このシステムは、底生懸濁液フィーダーによって吸い込まれた水と吐き出された水をその場で同時に収集するために開発され、評価され、粒子状物質と溶解した化合物の除去と排泄をきれいに測定しました。...

VacuSIP、のための改良INEX方法<em&gt;その場で</em&gt;微粒子と溶解した化合物の測定は、アクティブサスペンションフィーダによって処理します

このプロトコルは、RT-PCR の方法論を利用したティラピア生体ティラピア湖ウイルス (TiLV) を診断します。全体の方法は、総 RNA の抽出、続いて cDNA を合成して、従来の PCR またはバインディングの蛍光色素を結合 dsDNA を使用して量的な PCR によって TiLV...

ティラピア湖ウイルスを使用して従来 RT-PCR および SYBR の検出グリーン Rt-qpcr

15Nトレーサー研究のためのマイクロプロット設計は、複数の季節内の植物および土壌サンプリングイベントに対応するために記述されています。15N分析のための粉砕および計量の議定書を含む土および植物のサンプルの収集および処理のプロシージャは出される。...

15窒素分析のためのマイクロプロット設計と植物および土壌サンプル調製

学ぶRT-qPCRによる水質検査法で、遠心超濾過と核酸抽出を用いてエンテロウイルスとノロウイルスを定量するEPAメソッド1615。ポリオウイルス回収率20%、マウスノロウイルス30%を達成し、飲料水と環境水の安全性評価に有用です。

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

さらに動画を探す