Name: 3LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学ぶ3'LIFEアッセイを用いた高スループットmiRNA標的検出法。HEK293細胞とデュアルルシフェラーゼアッセイにより、数百の3'UTRライブラリーから翻訳抑制を測定し、高信頼性の標的を同定します。

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アドバイスと議論をしてくれたStephen Blazie、Karen Anderson、Josh LaBaerに感謝します。Karen Anderson、John Chaput、Josh LaBaerは試薬と機器を共有し、Michael GaskinとAndrea Throopは技術的なアドバイスとプロトコルを提供してくれました。ジャスティン・ウォルターはマーハー奨学生であり、マーハー家の寛大な支援に感謝しています。

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
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<li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3%27UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).</li>
<li>Lal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-24+Inhibits+cell+proliferation+by+targeting+E2F2%2C+MYC%2C+and+other+cell-cycle+genes+via+binding+to+%27seedless%27+3%27UTR+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements.</a> Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).</li>
<li>Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li>
<li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+microRNA+targeting+code%3A+functional+sites+with+centered+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li>
<li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838(2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li>
<li>Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mode+of+microRNA+target+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative mode of microRNA target recognition.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).</li>
<li>Jiao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+targeting+oncogenes+are+down-regulated+in+pancreatic+malignant+transformation+from+benign+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors.</a> PLoS One. 7 (2), e32068(2012).</li>
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<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3%27UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204(2013).</li>
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<li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNASU+plasmid+and+PSI%3ABiology-Materials+repositories%3A+resources+to+accelerate+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li>
<li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li>
<li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li>
<li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs%3A+a+network+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li>
</ol>

この研究は、アリゾナ州立大学のリベラルアーツアンドサイエンス学部とバイオデザイン研究所、およびNIH探索的/発達研究助成金1R21CA179144-01A1からの資金によって支援されています。

3&#39;LIFEアッセイは、高スループットでの3&#39;UTR中の機能のmiRNAのターゲットを識別します。このアッセイは、実験的に興味のあるmiRNAのための推定上の多数のターゲットを特定したい研究者のために有用です。アッセイがmiRNAの標的の機能的尺度を提供し、単一のmiRNAに対する3&#39;UTR ::シングルレポーターのバイナリテストが自信を持って取り組むことができるという点で、3&#39;LIFEアッセイは、3&#39;UTR駆動制御のために照会するための強力なアプローチであります個々の遺伝子のターゲティング状態。このアプローチを検証するために、我々は275の3&#39;UTRのパネルをスクリーニングし、2種のmiRNAに対して、 聞かせ-7C及びmiR-10bは 、このライブラリ内の10検証済みの標的遺伝子が含まれています。これら10個の遺伝子のうち8人は弾圧24を示しました。我々はまた、未検証のバイオインフォマティクス予測ターゲットの重要な濃縮、そして私たちのトップヒットのうち、正規のシード要素を含む予期せぬの3&#39;UTRを観察し、SUG3&#3...

この方法の全体的な目標は、検出し、正確に高スループットでマイクロRNA（miRNAの）ターゲットをマッピングすることです。 miRNAは、長さが約22ヌクレオチドの内因性の非コードRNAです。転写および処理に続いて、成熟miRNAは、タンパク質複合体中に組み込まれる（RISC）、複雑なRNA誘導サイレンシングと呼ばれます。各miRNAは、翻訳抑制またはmRNA切断1のいずれかで得られた、主にメッセンジャーRNAの3 &#39;非翻訳領域（3&#39;UTRを）（mRNAを）に位置要素を標的とするためにRISCを誘導します。 miRNAは、標準的なワトソン - クリックしてGに基づいて、標的部位を認識する：Uは、塩基対形成をウォブルし、本質的に縮重している、複数のミスマッチ塩基対を含有し、領域を膨らみました。多くのmiRNAが広く、彼らは生物学的役割の多様な範囲を再生する人間2,3に植物から保存されています。後生動物ではmiRNAは、細胞運命の決定4、発生のタイミング5を含む複数の生物学的プロセスに影響を与えることができます</sup&gt;、および頻繁に組織特異的な発現パターン6,7を示します。誤発現のmiRNAは、標的遺伝子の機能のみに基づいて細胞の挙動に大きな影響を持つことができ、異常な遺伝子調節をもたらすことができます。このように、miRNAは、神経変性8,9、糖尿病10及び11を含む癌疾患の広範囲に連結されています。バイオインフォマティクスとウェットベンチアプローチは各miRNAは、ハイスループットまたはゲノムワイドアプローチは潜在的な相互作用のこの大きなプールをプローブするために必要であることを示している、別個のmRNA 12-14の千数百人を標的にすることが可能であり得ることを示唆しています。 標的遺伝子を同定することは機構的に定義するmiRNAの機能の重要なコンポーネントであり、そうするために研究者が大規模に目標を明らかにすることができなければなりません。いくつかのアプローチは、バイオインフォマティクスの予測アルゴリズムを含む、miRNAの標的を同定するためのハイスループットシークエンシングが開発されていますターゲットとするmRNA、およびレポーターに基づくアッセイの。これらのアプローチのそれぞれが固有の長所と短所を持っています。 miRNAのターゲティングは、配列特異性によって案内されることを考えると、最も特にmiRNAのヌクレオチド2~6の、いくつかのアルゴリズムは、多くの生物のゲノム全体のmiRNA標的を予測するために開発されてきた（シード領域と呼ばれます）。これらのアルゴリズムは、検証済みのmiRNA標的の観察された塩基対形成のモチーフを使用して訓練し、頻繁にこのような厳しいシードのペアリング、サイトの保全、および/ ​​または熱力学的安定性15などのパラメータを利用しています。これらのフィルタは唯一の信頼度の高いターゲットに十分な相補性を有する推定多数のターゲットを絞り込みながら、彼らは、最近の証拠は16-24普及している示唆している種特異的および非標準のmiRNA標的部位を、除外することができます。また、これらの予測は、このような代替ポリアデニル化などのmiRNA標的部位を除外mRNAプロセシングのための仕組み、に取ることはありません25、26 RNA 編集 、RNAのメチル化27、及び協同的結合。このように、高い偽陽性および偽陰性率は、多くのアルゴリズム22,24,28のために報告されています。これらのアルゴリズムは、その後の実験的検証のための候補miRNAの標的を同定するのに有用であるが、これらの高いエラー率が系統的miRNA標的の検出のためのバイオインフォマティクスアプローチの有効性を制限します。 体系的に与えられたmiRNAの間の相互作用および潜在的標的と3&#39;UTRを探索するために、我々はの3&#39;UTR（3&#39;LIFE）24での機能要素の蛍光同定と呼ばれるハイスループットアッセイを開発しました。このアッセイは、直接的な相互作用およびデュアルルシフェラーゼレポーターシステムを使用してクエリのmiRNAによる試験3&#39;UTRの翻訳抑制。この系において、目的の遺伝子の3&#39;UTRは、ホタルルシフェラーゼ（Fluc細胞）レポーターリーディングフレームの下流にクローニングされます。レポーター短所tructは、HEK293T細胞内のクエリのmiRNAで共トランスフェクトされます。 miRNAのターゲティングは、試験Fluc細胞:: 3&#39;UTRレポーターおよび第非特異的ウミシイタケルシフェラーゼレポーターの間の相対的な変化を測定することによって決定されます。重要なのは、ルシフェラーゼアッセイは、レポーターの翻訳出力に影響を与える機能のmiRNA / mRNAの相互作用を検出します。このことは、これは3&#39;UTR基づく規制の独立したタンパク質の存在量のmRNAの分解や翻訳抑制の違いだけでなく、変化を迂回するには、そのようなRT-qPCRのやウェスタンブロットなどのmiRNA調節を検出する従来の方法に比べて重要な利点です。 ルシフェラーゼアッセイは、広く、それらの相対的な単純性と感度の直接のmiRNAの標的を検証するために利用されている、まだハイスループットスクリーニングにおけるそれらの使用は、高い消耗品試薬に関連するコスト、公共の情報源からの3&#39;UTRライブラリーの欠如、および存在しないことによって制限されています標準化されたルシフェラーゼのprotのocols、複数のデータセット全体での機能抑制を比較する際に困難をもたらします。 3&#39;LIFEアッセイの使用を容易にするために、我々は定期的に更新して展開され3&#39;UTRライブラリを作成、実験デザイン、非商業的なトランスフェクション24、ルシフェラーゼ試薬29の利用の簡素化に重点を置いて、を介して利用できました公共プラスミドリポジトリ30。 3&#39;LIFEアッセイのスケーラビリティは、バイオインフォマティクス同定された遺伝子の方の画面にバイアスをかけることなく、与えられたmiRNAによって標的化するための大きな3&#39;UTRライブラリーのスクリーニングを可能にします。標準的な予測の相互作用を試験することに加えて、この体系的なアプローチは、非標準および/または種特異的な相互作用を介して駆動される新規標的の同定を可能にします。重要なことは、タンパク質の産生を対象miRNAの効果は、一般的に控えめな翻訳抑制15,31 &lt;をもたらすことが理解されています/ SUP&gt;、miRNA調節の主な役割は、タンパク質の出力を微調整し、遺伝子発現の異常なレベルから保護し、細胞の特定のプログラム32,33にロバスト性を提供することであることを示唆しています。 3&#39;LIFE画面における負のmiRNA / mRNAの相互作用の本質的に多数と組み合わせルシフェラーゼアッセイの感度は、多数の遺伝子に標的化miRNAの微妙な効果の検出を可能にし、その遺伝子ネットワークの複数のコンポーネントの識別与えられたmiRNA 24によって規制されています。 ここでは、3&#39;LIFEプロトコルを記述し、275人の3&#39;UTRを（ 図1）のパネルに対して2つの十分に特徴付けられたmiRNA、 のmiR-10Bおよびlet-7cとをスクリーニングすることによって、それが実現可能だ実証します。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリシルグリシン</td><td>Σ</td><td>G1127-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kx PO4</td><td>Σ</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Σ</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Σ</td><td>FLAAS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Σ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Σ</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>シグマ</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>ルシフェリン</td><td>シグマ</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>シグマ</td><td>E0399</td><td></td></tr><tr><td>K H2 P O4</td><td>シグ</td><td>マ 1551139</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>シグマ</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>セレンテラジン</td><td>シグマ</td><td>C3230</td><td></td></tr><tr><td>PBS/HEPES</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>シグマ</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>シグマ</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td></td><td>T2600000</td><td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxiPrep キット</td><td>プロメガ</td><td>A2392</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルミニプレッププレート</td><td>Pall</td><td>8032</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルシャトルプレート</td><td>Lonza</td><td>V4SP-2096</td><td></td></tr><tr><td>5x Lysis Buffer</td><td>Promega</td><td>E1941&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>インスツルメンツ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル GloMax プレートリーダー</td><td>Promega</td><td>E9032</td><td></td></tr><tr><td>Biomech FX リキッドハンドラーロボット</td><td>Beckmann</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルシャトルシステム</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

3&#39;lifeアッセイを用いた高スループットにおけるmirna標的の検出

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

の3&#39;UTR中の機能要素の発光識別（3&#39;LIFE）は、照会の3&#39;UTRの何百もの配列内の特定のmiRNAの標的の迅速な同定を可能にします。標的の同定は、miRNAが標的との機能的読み出しを与え、翻訳出力を測定することによって、mRNAレベルでの結合を検出するデュアルルシフェラーゼアッセイに基づいています。 3&#39;LIFEが可能でコスト効率のゲノムワイドな画面を作り、非独占バッファーと試薬、および公的に利用可能なレポーターライブラリを使用しています。 3&#39;LIFEは、標準的な実験室の設定のいずれかで行うか、液体処理ロボットや他の高スループットの計測器を使用してスケールアップすることができます。私たちは人間の96ウェルプレート中でクローニングの3&#39;UTR、および2つのテストのmiRNAのデータセットを使用してのアプローチを例示し、及びmiR-10B-7Cてみましょう 。我々は、96ウェルフォーマットにおいてDNAの調製、トランスフェクション、細胞培養およびルシフェラーゼアッセイを行い、データのためのツールを提供する方法を示し分析。結論3&#39;LIFEで体系的、迅速、高い再現性であり、かつ高い信頼性目標を識別します。

照度計の出力ファイルには、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の両方の生の測定値が含まれています。と- MangoneラボのWebサイト（から入手可能な「3&#39;LIFE多分析」スプレッドシート-この生の形式は、「単板分析3&#39;LIFE」と互換性があり<a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ）。単板解析スプレッドシートを自動的にホタル/ ウミシイタケ比を計算し、適切な陰性対照を各miRNAを正規化し、各プレートを横切っ抑圧値を正規化します。このスプレッドシートは自動的に低ウミシイタケルシフェラーゼシグナルでウェルを特定し、陰性対照と比較して抑制を示す井戸を強調表示され、全体のプレート（ 図2）全体で抑制の手段を提供します。統計分析の詳細な説明のための24を参照してください。 複数の複製を分析することができますD「多分析」スプレッドシートを使用。各反復は、並べて比較し、データの...

3'非翻訳領域(3'UTRs)(3'LIFE)の機能的要素の発光同定は、miRNAまたは他の調節因子による3'UTRの機能調節を特定する技術です。このプロトコルは、96ウェルトランスフェクションやルシフェラーゼアッセイなどのハイスループット手法を利用して、機能的抑制のための数百の推定相互作用をスクリーニングします。

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

本実験の目的は、3'非翻訳領域（UTR）ライブラリーの中からマイクロRNAの標的を同定することです。これは、大規模でバイアスのないスクリーニングを容易にするため、マイクロRNA発現プラスミドおよび3' UTRが融合したルシフェラーゼレポータープラスミドをHEK 293細胞に共導入（コトランスフェクション）することで達成されます。トランスフェクションは、第2ステップとして96ウェルプレートを用いて行います。その後、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施し、マイクロRNAによる3' UTRの転写後調節を測定します。次に、複数のレプリケートおよび複数のプレートから得られたデータを解析します。数百個の3' UTRの結果から信頼性の高いmicroRNAターゲットを特定するため、デュアルルシフェラーゼアッセイで測定した翻訳抑制に基づき、各microRNAが固有の3' UTRセットをターゲットとしていることを示す結果を得ます。3' UTRアッセイは、目的のmicroRNAに対する多数のターゲット遺伝子を特定することで、その後の検証実験へと導くデータを提供し、microRNA生物学における重要な疑問に答えることができます。トランスフェクションの24〜48時間前に、トランスフェクションを行う96ウェルプレートの数に基づき、十分な量のHEK 293T細胞を用意します。96ウェルプレート1枚につき9 × 10⁶個の細胞が必要です。このデモンストレーションでは、十分に特性解析された2種類のmicroRNAを用いて、275種類のヒト3' UTRパネルに対するスクリーニングを行います。そのため、3枚の96ウェルプレートを使用します。通常、145 mmの円形培養プレートがあれば、3枚の96ウェルプレートを十分に収容できます。細胞が約90%のコンフルエンシーに達した時にトランスフェクションを行います。すべてのバッファーおよびプラスミドDNAは、トランスフェクション前に準備しておく必要があります。ヒト3' UTRクローンは、96ウェルプレートの1ウェルあたり約100 ng/µLになるように再懸濁し、miRNAベクターは500 ng/µLの濃度に再懸濁します。各miRNAおよびブランクコントロールプラスミドについて、10x firefly luciferaseバッファーおよび1x renilla luciferaseバッファーの調製試薬を事前に準備しておきます。トランスフェクション当日に、PBSおよびpH 7の1.5% HEPESを含むトランスフェクションバッファーを調製し、フォーミュレーションバッファーおよびプラスミドDNAの分量を準備します。ピペッティングのエラーや、リキッドリザーバーおよびマルチチャンネルピペットの使用による液量損失を十分に考慮し、96ウェルプレート1枚につき120反応分と

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。...

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示されている。より良いmiRNAの- UTRの相互作用を理解するために、我々は新たなルシフェラーゼ遺伝子およびアッセイ試薬、LightSwitchのシステムと対になって3...

3&#39;UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

循環マイクロRNAは、最近様々な癌および他の疾患のための有望で新規なバイオマーカーとして浮上している。この記事の目的は、マイクロRNAの循環の豊富さを定量化し、決定するために利用可能である三つの異なるプローブベースのリアルタイムPCRプラットフォームと方法を議論することです。...

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

私たちは、増幅を必要とせずに生物学的基質中の分子をバーコード化し、カウントすることにより遺伝子発現を定量化するマルチプレックスハイスループット遺伝子発現プラットフォームの使用について説明します。このプラットフォームを使用して、過敏性腸症候群の有無にかかわらず、全血中のマイクロRNA(miRNA)発現を定量しました。...

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna...

転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。...

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

ここでは、1)既知および新規のmiRNAをより正確に同定でき、2)完全に自動化され、自由に利用できる新しい完全に自動化されたmiRNAパイプラインmirMachineを紹介します。ユーザーは、短い送信スクリプトを実行して、完全に自動化された mirMachine...

mirMachine:植物miRNAアノテーションのワンストップショップ

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ3'LIFEアッセイを用いた高スループットmiRNA標的検出法。HEK293細胞とデュアルルシフェラーゼアッセイにより、数百の3'UTRライブラリーから翻訳抑制を測定し、高信頼性の標的を同定します。

3'LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

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