Name: 気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶTリンパ球由来リンパ球微小粒子（LMP）のin vitro製造法と気道上皮細胞に対するアポトーシス誘導効果。FACS解析による特性評価と組織培養技術を用いた病態生理学研究手法を解説。

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ビジョン保健研究ネットワーク - この作品は、ヘルスリサーチ（178918）、フォン·ド·RECHERCHEエンサンテケベックのカナダの研究所からの助成金によってサポートされています。

注：男性C57BL / 6マウス（5-7週齢）をチャールズ·リバー·ラボラトリーズインターナショナル社（セント·コンスタント、ケベック州、カナダ）からのものであり、CHUサントジャスティン動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って操作。マウス気管支組織外植片は、上皮細胞上のLMPのアポトーシス促進効果を調査するための主要な気管支上皮細胞の良い情報源を提供する。このプロトコルは、のLMP のインビトロ発生、ならびにLMPで処理した気管支組織外植片におけるアポトーシス上皮細胞を検出するための方法を記載する。このプロトコルは、3つのセクションで構成されています。 1.のLMP産生および特徴注：汚染を防止するために、この実験で使用されるすべての材料は滅菌されているか、オートクレーブしていることを確認してください。特に断りのない限り、無菌状態の下で生物学的安全キャビネット内で室温ですべての手順を実行します。 1.1）刺激とMPのコレクション9 <ol><li> 37℃の水浴1000万CEM T細胞のアリコートを解凍する。 10ミリリットルで希釈し、予め温めた無血清200 GX 5分で15ミリリットル滅菌チューブと遠心分離機で、例えばX-VIVOのような造血中。予め温め培地5mlの上清と再懸濁細胞を吸引除去する。 </li><li>このようなX-VIVOとして予め温め造血媒体15 mlの（懸濁細胞）T75組織培養フラスコに細胞を移し、5％CO 2で37℃で加湿インキュベーター中で4日間インキュベートする。 </li><li> 4日後、100mlの新鮮な培地を含有するT175組織培養フラスコ中にすべての培地および細胞を移す。彼ら200万細胞/ mlの密度に成長するまで、同じ条件下で約72時間細胞をインキュベートし続ける。 </li><li>均等に4 T175フラスコをそれぞれ含む150ミリリットルの新鮮な培地と細胞を2万個/ mlの密度まで（約48時間のインキュベーション）に成長するまで、細胞培養を継続する間にセルを分割する。 </li><li&gt; 5分間200×gでの遠心分離によって各フラスコから細胞を収集し、200万/ mlの細胞密度を維持するために、150ミリリットル新鮮な培地を含む新しいT175フラスコに300×10 6個の細胞を懸濁します。 </li><li>を0.5μg/ mlの最終濃度で培地に（2 mg / mlのでDMSOに溶解）アクチノマイシンDを添加し、24時間インキュベートする。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブにすべての培養液を移し、5分間750×gで細胞をスピンダウン。大細胞断片を除去するために15分間1500×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に上清を移し。 </li><li> 50分間12000×gで250ミリリットルボトルと超遠心機に上清を移し。上清を捨て、ペレットを収集します。 </li><li>洗浄50分間12000×gで遠心分離によって50mlチューブ中で40 mlの滅菌PBSにペレットのLMPが富化。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>最後の洗浄上清を収集。車両の制御に使用される。 1でのLMPペレットを一時停止mlのPBSと1.5 mlの滅菌マイクロチューブに移す。アリコートとストア（複数の空き融解サイクルを避けるために）-80℃でのLMPを単離した。 </li></ol> FACS分析4を介してMPの1.2）キャラクタリゼーション<ol><li>のCaCl 2なしで2アネキシンバッファのサンプル、1とし、別のを準備します。ヘペスが10mM、NaClが140 mMの、プラスマイナス5のCaCl 2。 </li><li>粒子を除去するために0.22μmのフィルターを用いてアネキシンバッファおよびFACSフローシース流体をフィルタ。 </li><li> FACSチューブに5 mMのCaCl 2をアネキシンバッファー44μlの中のLMPの1μLに希釈する。のCaCl 2なしアネキシンバッファの44μL（陰性対照）でのLMPの1μlの別のチューブを準備します。 </li><li>各チューブにアネキシンV-Cy5での5μlを加え、よく混ぜる。暗所でRTで15分間インキュベートする。各チューブ内FACSフローシース液の400μlのミックスを希釈することにより反応を停止します。 </li><li> BEAを数える7μmの10μlの（20万ビーズ）を追加各管中の内部標準としてのds懸濁液は絶対数を取得する。 </li><li>相対的な大きさのゲート（FSC-H、PMT E00、スケールログ）と相対粒度（SSC-H、PMT 325、ログスケール）のサイズ·キャリブレーション蛍光ビーズを使用して、フローサイトメーター上のドットプロットを確立さ1μm（ゲート1）と7ミクロン（ゲート2）でビーズゲートを数える。 </li><li> 2万カウンティングビーズがゲート2に到達するまでの信号を取得することにより、ドットプロット（ログスケール、PMT 765）アネキシンのための確立されたゲートとFL-4チャネルを使用してFSC-H / SSC-Hプロット上のLMPサンプルを分析します。 </li><li>のCaCl 2を含有アネキシンバッファ内のLMPのアネキシンV陽性の事象を決定し、その後のCaCl 2（ネガティブコントロール）することなく、アネキシンバッファ内のLMPのイベントを引く。 </li><li>次式に基づいてMPの絶対数を計算する。 <img alt="式1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> MP Pの1.3）の決定rotein濃度（ブラッドフォードアッセイ） <ol><li> 1.25〜20 / mlのからのタンパク質標準の5連続希釈を準備します。ピペット連で清潔な試験管に各標準と試料液を800μL。各チューブにブラッドフォード色素試薬を200μlを追加します。室温で5分間インキュベートその後、よく混ぜる。 </li><li> 595 nmの吸光度を測定します。標準曲線の線形回帰を使用してのLMPのタンパク質濃度を決定します。 </li></ol> 2.気管支組織外植とのLMPトリートメント注：無菌の作業環境には特に注意してください、そして無菌的に以下の実験に使用される溶液及び培地を調製。 、完全な治癒培地を調製100ミリリットル組織ヒーリング中に（氷上で解凍）血清を用いて組織ヒーリングミディアムサプリメントの1ミリリットルを加え、よく混ぜます。 気管支組織外植片の2.1）の準備<ol><li>培養前に、1cm 2の6領域を傷つけるメスの刃で各100mmの組織培養皿の表面のエッジにそれぞれ。コートはそれぞれの培養皿のコーティング溶液2mlと100mmの組織培養皿に傷、37℃の加湿CO 2インキュベータO / Nで皿をインキュベートする。真空が余剰液を吸引し、組織洗浄​​媒体15mlで料理を埋める。 </li><li>動物のケア倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってCO 2吸入により（5〜7週齢）C57BL / 6マウスを安楽死させる。 </li><li>無菌的には、メス、デュモンスーパーファインピンセット、および外科はさみで肺組織を解剖。慎重に実質および血管を取り除く。該当する場合は、研究室への輸送のための氷冷組織洗浄媒体に肺組織を置きます。 </li><li>さらに組織洗浄培地中に沈め気管支を解剖し、末梢肺組織から1〜2.5ミリメートルの直径を有する気管支の分離。メスで〜5ミリメ​​ートルの厚さの気管支リングにスライス気管支組織。 </li&gt; <li>気管支断片をピックアップし、料理の傷領域上に配置する無菌の湾曲したmicrodissecting鉗子ですくい運動を使用してください。 </li><li>組織洗浄媒体を取り外し、それらを皿に付着させ〜室温で5分間の断片をインキュベート。 </li><li>各ディッシュに完全な治癒中の10ミリリットルを追加し、制御された雰囲気モジュラーインキュベーターチャンバーに配置します。高いO 2混合ガス（70％O 2、25％N 2及び5％CO 2）を有するチャンバを洗い流す。ベンチトップ軌道インキュベーター内室を置き、37℃でそれを振る。培地フラグメント上に断続的に流れることができるように、毎分10サイクルで24時間チャンバーを振る。 </li><li> 24時間インキュベートした後、位相差倒立光学顕微鏡で組織外植片を観察します。完全な、細い髪の動きとその後のLMPの治療のために活発な気管支上皮と気管支植片を選択します。 </li></ol>2.2）のLMPトリートメント<ol><li>解凍成長培地サプリメントを氷上で血清および線維芽細胞阻害剤と次のように完全増殖培地を準備します。血清及び増殖培地100mlに200μlの線維芽細胞阻害剤による成長培地サプリメントを1ml加える。完全に混合する。使用前に10分間37℃で、完全増殖培地を温める。 </li><li>を800μg/ mlの濃度でのLMPストックを調製するためにPBSで新しい無菌のエッペンドルフチュー​​ブに孤立のLMPを希釈する。 </li><li> 12ウェル組織培養プレートの各ウェルに完全な増殖培地を0.5mlを加える。 </li><li>組織培養プレートの各ウェルに、前のプロトコル（2.1節）から湾曲したmicrodissecting鉗子と、選択した気管支植片を転送します。 </li><li>のLMP処理ウェルと対照ウェルを識別するために、適切に培養プレートにラベルを付けます。そして25μlの制御車両（40 / mlの最終濃度）を各ウェルのLMPの治療に25μLのLMPの株式を追加します（LMP<html> S対照ウェルへの生産）。 </li><li>穏やかに振盪しながら37℃で制御された雰囲気モジュラーインキュベーターチャンバー内のインキュベーションを続けます。 </li><li> 24時間後、PBSで外植3回洗浄し、次のステップ（4％パラホルムアルデヒド[PFA]固定）に進みます。 </li></ol> 3.病理組織学的検査 3.1）次のステップに進む前に、次のソリューションを準備<ol><li> 137のNaCl、2.7のKCl、10のNa 2 HPO 4、1.76 mMのKH 2 PO 4、pHが7.4を混合して1×PBS緩衝液を準備します。 </li><li> 、4％PFAを調製400mlの水に20gのPFAを溶解、攪拌しながら60℃で加熱すること。解決策をクリアする10 M NaOHを数滴を追加します。次に1×PBS緩衝液を追加し、7.4に500ミリリットルとpHに音量を調整します。フィルタとアリコート。 -20℃で保存する。 </li><li>以下の脱水や水分補給の試薬を準備します。 100％、90％、70％、50％エタノール及びキシレン。 </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2）植固定および組織節脱パラフィン<ol><li> 4％PFAの1.5ミリリットルで標識されたマイクロ遠心チューブ内の各植片を置き、4℃でO / Nインキュベートする。 1×PBSで2回植片をすすぐ。 </li><li>アルコール系を通して外植片を脱水し（70％エタノール：各3回、30分間、90％エタノール：各2回​​30分間、100％エタノール：3回30分ずつ、次にキシレン：3回20分ずつ）。ドラフト内で室温ですべての手順を実行します。 </li><li>オーブンで58℃のパラフィンに組織外植を埋め込む。ロータリーミクロトームを用いて5μm厚の組織切片を準備します。 </li><li> 56℃の水浴中で切片をフロートし、次いで標識された組織スライド上に切片をマウントする。 1時間65℃で手動染色ラックと乾燥でスライドを置きます。スライドを室温で冷却する。 </li><li>パラフィンを除去するために10分間、キシレンをそれぞれ含む4個の連続染色ディッシュ内のラックを浸し。目、その後、100％、95％のキシレンを除去し、エタノール系列でラックを浸し次に、80％、70％、次いで50％エタノール（各ステップで5分間）エン。エタノールを除去し、5分間水道水でラックをすすぐ。 </li></ol> 3.3）ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色<ol><li>固定組織切片で作業を続ける。 15分間マイヤーのヘマトキシリン​​で満たされた染色皿にラックを配置。 20分間ヘマトキシリン​​を除去するために水道水でラックをすすぐ。 </li><li> 30秒間の95％エタノール中で30 sec.Place蒸留水に置く。 1分間のエオシンYソリューション染色皿に置きます。 2分ごとに、95％エタノール、100％エタノール、キシレン2変化を通して脱水する。 </li><li>過剰エオシンが除去されることを保証するために、顕微鏡下でクイックチェックを実行します。カバーガラスでカバーした後、各スライド上に封入剤（フィッシャーSP15-100）の2から3滴を置きます。 </li></ol> 3.4）In Situ細胞死検出の場合 ：TUNELアッセイ<ol><li>開始する前に、プロテイナーゼKワーキング溶液を調製：20μg/ mlの中で10mMトリス/塩酸、pHは7.4。 </li><li>セクション3.2（外植固定および組織切片の脱パラフィン）の5〜ステップ1を繰り返します。脱イオンH 2 Oでスライドをすすぐ</li><li> 10分間1X PBSでスライドを浸し。過剰のPBSを排出します。プロテイナーゼK希釈標準溶液をRTで30分間、組織切片をインキュベートする。リンスは、1×PBSで2回スライドする。 </li><li>細胞死検出キットの取扱説明書に記載されているようにTUNELアッセイを実行します。封入剤を使用してマウントし、カバーガラスを使用して手動でカバースリップ。 </li><li>光学顕微鏡下でサンプルを分析します。茶色のアポトーシス細胞を分析するために4.5 Proの画像を使用してください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

MPは、細胞間のクロストークのアクティブなメディエーターであり、それらの研究は、科学の多くの分野において有望である。11本研究は、アポトーシスT細胞株由来のLMP のインビトロでの大規模生成のための詳細なプロトコルを提示した。これらのMPは、リンパ球分子の大きなレパートリーを発現し、生物学的細胞および組織の恒常性の調節に関与している。しかし、異なる供給源に由来のLMPは、生物学的に異なっていてもよい。4,9,12,13 のLMPは、in vitroでそれらを生成するために使用される刺激は、それらが由来する細胞によって異なる特性を示す。このように、 生体内で生成されたのLMPからのデータの不死化細胞株由来のLMPを使用して、in vitroで得られたデータの外 ​​挿は、慎重に行われるべきである。 このプロトコルは、国会議員の単離のために必要ないくつかの遠心分離工程を説明する。したがって、Careful操作は、こ...

微粒子(MP)は、細胞の活性化またはアポトーシス後に放出される生物学的に活性なサブミクロン膜小胞です。MPは、健康な細胞と損傷した細胞の両方に由来し、多くの生理学的および病理学的プロセスに関与しています。1 MPは、ヒト血漿だけでなく、炎症組織やアポトーシス組織でも検出されています。細胞膜由来MPの生物学的有用性は、細胞シグナル伝達モデルや薬理学的ツールなど、さまざまな環境で実証されています。2,3 私たちはこれまでに、アクチノマイシンD刺激(アポトーシスの誘導)後にTリンパ球に由来するLMPが血管新生を抑制し、内皮細胞の生存と増殖を阻害することを示しました。4,5 LMPの抗血管新生効果は、in vitroでTリンパ球を活性化するために使用される刺激によって大きく異なる可能性があります。6
気道上皮は、物理的および機能的な保護バリアとして機能します。気道内のTリンパ球の数が増えると、細胞の損傷や気道の炎症に寄与する可能性があります。7 私たちは、LMPがヒト気管支上皮細胞のアポトーシスを誘導することを示しました8、これはLMPがin vivoで気管支上皮のバリア機能を変化させる可能性があることを示しました。アポトーシス細胞は、in situ DNA断片化を検出するTUNEL法を用いて同定することができます。
このプロトコルの全体的な目標は、Tリンパ球細胞株からのLMPのin vitro生産を示し、気道上皮細胞に対するそれらのプロアポトーシス効果を実証することです。In situ細胞死の検出により、LMPは気道気管支上皮細胞死を強く誘導することが示され、LMPを介した気道上皮の損傷が損傷した上皮のバリア機能に影響を与える可能性があることが示唆されました。

<table><tbody><tr><td>LMPの産生と特性評価</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM T細胞&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 ミディアム&nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Flask T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Flask T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin&nbsp;D&nbsp;</td><td>シグマケミカル(株)</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & マイクロ;mフィルター</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td></td><td></td>559933</tr><tr><td>FACSフロー溶液</td><td>BDバイオサイエンス342003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光マイクロビーズ(1&micro;m)</td><td>分子プローブ&nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>ポリステレン計数ビーズ (7 & micro;m)</td><td>前髪研究所</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン FACS チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1 ml ピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>25 ml ピペット</td><td>アルティデント</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 円錐形ポリプロピレン マイクロ チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルポリプロピレンチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルポリプロピレンチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 高速ポリプロピレン共重合体チューブ</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 高速ポリプロピレンボトル</td><td>ベックマン</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>プロテインアッセイ (Bradford アッセイ)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質アッセイ標準 II</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>試験管 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>試験管 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>セルインキュベーター&nbsp;</td><td>マンデル</td><td>ヘラセル150</td><td></td></tr>低速<tr><td>遠心分離機</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>アバンティJ8250ml</td><td></td></tr><tr><td>ボトル用高速ローター</td><td>ベックマン</td>JLA16.25050505050505000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ベックマン</td><td>シリーズ 600</td><td></td></tr><tr><td>気管支組織外植片および切片&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6マウス(5-7週齢)&nbsp;&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウスエアウェイプリマセル&トレード;システム:</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;リブバック炭素鋼メスブレードベ</td><td>クトンディキンソンAcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr>メス<tr><td>ハンドル</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>位相差倒立顕微鏡</td><td>オリンパス光学(株)&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>高O2ガス混合物&nbsp;</td><td>バイタエア・カナダ社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モジュール式培養器チャンバー</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000インキュベーションオービタルシェーカー</td><td>バーンステッドラボライン&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル組織培養プレート</td><td>ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック組織培養皿 (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>14060-09</td><td>直線、シャープ、長さ9cm</td></tr>半<tr><td>湾曲グレーフ鉗子</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>加湿CO2インキュベーター</td><td>マンデル・サイエンティフィック・カンパニー・インク&nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;病理組織学的検査&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルマリンホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;インターナショナル株式会社</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>メルク KGaA, ダルムシュタット</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;グルタルアルデヒド&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ株式会社&nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>カコディレート</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドVWR</td><td>サイエンティフィック社&nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー科学&nbsp;インターナショナル株式会社</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>メイヤーズヘマトキシリン</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>MHS16</td><td>ファンネル 濾紙付き&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;インターナショナル・インク&nbsp;&nbsp;</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>エオシン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ株式会社&nbsp;</td><td>HT110116</td><td>濾紙付きファンネル&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&trade;実装媒体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社&nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>外科医療工業株式会社</td><td>84503</td><td>24回;24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>TUNEL検出キット</td><td>In Situ細胞死検出、POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズ(株)</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコンイメージングジャパン株式会社</td><td>E800</td><td></td></tr>染色<tr><td>皿一式</td><td>ウィートン・インダストリーズ社</td>皿<td>、ラック、カバー</td>を含む<td>900200</td></tr><tr><td>1.5 mlエッペンドルフチューブ</td><td>Sarstedt Inc.&nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>オービタルおよびレシプロウォーターバス</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td>Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

細胞間コミュニケーションにおける細胞膜由来の小胞の生物学的役割への関心が近年増加している。微粒子（MPは）は0.1μm〜1μmの直径の範囲の、小胞のような一種類であり、そして典型的に活性化またはアポトーシスを起こして、真核細胞の細胞膜から脱落。ここでは、D.のLMPアクチノマイシンで刺激しアポトーシスCEM T細胞からTリンパ球由来の微粒子（のLMP）の生成が多段階分画遠心法によって単離し、フローサイトメトリーを使用して特徴づけられる記述する。このプロトコルはまた、マウス初代呼吸気管支組織外植片から派生気管支上皮細胞上のLMPのアポトーシス促進効果を実証するための、その場で細胞死検出法を提案する。本明細書に記載の方法は、in vitroでのアポトーシスリンパ球からのLMPの豊富な量を単離するための再現可能な手順を提供する。のLMPは、導出このように様々な疾患モデルの特性を評価するために使用され、薬理学および毒性試験のためにすることができる。気道上皮は、外部環境と下層組織との間に保護物理的および機能的なバリアを提供することを考慮すると、気管支組織外植片ではなく、不死化上皮細胞系の使用は、気道管組織を必要とする研究のための有効なモデルを提供する。

のLMPは（FACS）分析およびMPの97％（≤1μm）をアネキシンV-Cy5での陽性（ 図1Aおよび1B）であった1μmのビーズを使用してゲート制御を蛍光活性化細胞ソーティングによって、アネキシンV染色10で特徴付けた。典型的には、のLMPの約2.5mgが、このプロトコルに従って得た。 C57BL / 6マウスからの気管支組織外植片は、車両とのLMP処理を行った。気管支セクションの組織病理学的分析は、気管支上皮の構造的完全性に対するのLMPの効果を明らかにした。対照外植では、気管支上皮は（ 図2A）、主に損傷を受けていないでした。しかし、のLMP処理した外植で、表在上皮細胞層が損傷や紛失、および上皮細胞の高さと密度（ 図2B）の大幅な減少があったした。 TUNEL陽性染色（アポトーシスのマーカー）（対照と比較してのLMP処理した気管支上皮でより顕著であった<stronG&gt;図3）。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always...

細胞膜小屋微粒子（MPS）を単離し、それらの病態生理学的効果は、様々なモデルで研究することができるアクティブな生物学的な小胞である。ここでは、Tリンパ球（のLMP）由来のMPを生成する気道上皮細胞に対するアポトーシス促進効果を実証するための方法を記載する。

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

本手順の目的は、Tリンパ球細胞株からのリンパ球マイクロパーティクル（LMP）のin vitroでの作製方法を示し、気道上皮細胞に対するそのプロアポトーシス効果を実証することである。まずLMPを作製し、次に、単離したLMPを FACS解析により特性評価することでこれを達成する。次に、気管支組織外植片を培養します。最後に、気管支外植片にLMP処置を行います。最終的に、ヘマトキシリン・エオジン染色などの組織病理学的検査およびNC2細胞死検出を用いて、LMPが気管支上皮層の損傷および上皮細胞のアポトーシスを誘発することを示します。本手法の、ヒト末梢血からのマイクロパーティクル分離などの既存手法に対する主な利点は、細胞株由来のマイクロパーティクルをin vitroで大規模に生成できる点にあります。一般的に、本手法に慣れていない方は、気管支外植え培養の重要なステップにおける準備が容易ではないため、困難を感じる可能性があります。培養を開始するには、4枚のT 175フラスコにそれぞれ150 millilitersの新鮮な培地と共にCEMT細胞を分注し、37 degrees Celsiusで1 milliliterあたり2 million cellsの密度まで培養します。各フラスコから200 times Gで5分間遠心分離して細胞を回収し、300 times 10 to the six cellsを150 millilitersの新鮮な培地を含む新しいT 175フラスコに再懸濁します。1 milliliterあたり2 million cellsの密度を維持するため、最終濃度0.5 micrograms per milliliterとなるようにactin mycin Dを37.5 microliters培地に添加し、37 degrees Celsiusで24時間培養します。すべての培地を50 mLコニカルチューブに移し、750 ×gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させます。次に、上清を50 mLコニカルチューブに移し、1500 ×gで15分間遠心分離して大きな細胞破片を除去します。続いて、上清を250 mLボトルに移し、12,000 ×gで50分間超遠心分離します。次に上清を捨て、ペレットを回収します。50 mLチューブ内で、40 mLの滅菌PBSを用いてLMP濃縮ペレットを洗浄し、12,000 ×gで50分間遠心分離します。この手順を2回繰り返します。最後の洗浄で得られた上清を回収し、1 mLのPBSとともにビークルコントロールとして使用します。ペレットを懸濁させて1.5 mLの滅菌マイクロチューブに分注し、単離したLMPを-80 °Cで保存します。ファックス解析によりマイクロパーティクルを特性評価するには、まず塩化カルシウムを含むネキシンバッファーと含まないネキシンバッファーの2種類のサンプルを準備します。ファクステューブ内で、LMPs 1 µLを塩化カルシウム含有ネキシンバッファー 44 µLで希釈します。同様に、塩化カルシウム不含のネキシンバッファーを用いて別のチューブを準備します。次に、各チューブに X and V sci five を 5 µL加え、よく混ぜ合わせてから、室温の暗所で15分間インキュベートします。インキュベーション後、400 µLのfax fluシース液を使用します。反応を停止させるため、内部標準として7 µmのカウントビーズ懸濁液を各チューブに10 µLずつ添加します。絶対数を算出するために、フローサイトメーター上で相対サイズ（FSCH）および相対顆粒度（SSCH）の既定のゲートとドットプロットを設定します。ゲート1用に1 µmのサイズ校正用蛍光ビーズを、計数ビーズ用に7 µmのビーズを使用します。ゲート2については、確立されたゲートを用いたFSC-H/SSC-Hプロットおよび、アネキシン・ドットプロット用のFL4チャンネルを用いてLMPサンプルを解析します。ゲート2で10,000個の計数ビーズに達するまで信号を取得し、塩化カルシウムを含むアネキシン緩衝液中のLMPにおけるアネキシン陽性イベント数を決定し、そこから塩化カルシウムを含まないアネキシン緩衝液中のLMPのイベント数を差し引きます。以下の式に基づき、LMPの絶対数を算出します。メス、Dumont超極細ピンセット、および外科用鋏を用い、無菌的に肺組織を解剖します。肺実質と血管を慎重に除去します。さらに、組織洗浄液に浸した状態で気管支を解剖し、直径1〜2.5 mmの気管支を末梢肺組織から分離します。メスを用い、滅菌済みの湾曲マイクロ解剖用ピンセットですくい上げるようにして、気管支組織を約5 mm厚の気管支ランクに切り分けます。気管支の断片を拾い上げ、あらかじめ準備しておいたディッシュの擦過領域に配置します。テキストプロトコルに従い、組織洗浄液を除去し、断片を室温で約5分間インキュベートして、ディッシュに密着させます。各ディッシュに10 millilitersの完全治癒培地を加え、高酸素ガス混合気を備えた制御雰囲気モジュラーインキュベーターチャンバーに入れ、チャンバー内をフラッシングします。その後、ベンチトップ型オービタルインキュベーターに設置し、37 degrees Celsiusで24時間、10 cycles per minuteで振盪し、培地が断片の上を断続的に流れるようにします。インキュベーション後、位相差反転顕微鏡下で組織外植体を観察します。微細な毛様運動が完全であり、気管支上皮が活性的な気管支外植体を選択し、以降のLMP処理に用います。LMPを処理するには、選択した気管支外植片を数え、12ウェル組織培養プレートの各ウェルに印を付けます。各外植片について、0.5 millilitersの完全増殖培地を滅菌エッペンドルフチューブに移します。次に、処理群の外植片に対しては25 microlitersのlおよびpストックを添加し、対照群には25 microlitersのコントロールビークルを添加します。コントロールの外植片については、チューブを軽く叩いてよく混合します。曲線マイクロ解剖ピンセットを用いて、混合した培地を印を付けた12ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注します。選択した各気管支外植片を、組織培養プレートの各ウェルに転移させます。24時間後、緩やかな振盪を加えながら、制御雰囲気モジュールインキュベーターチャンバー内にて37 °Cでインキュベーションを継続します。PBSを用いてEXPLANを3回洗浄し、固定、H&E染色、およびTUNELアッセイに進みます。ここに示されるテキストプロトコルに従い、LMPをAnnexin V染色によるFACS解析で特性評価し、1 µmビーズを用いてゲーティングを行ったところ、MPの97%がAnnexin V陽性でした。通常、本プロトコルに従うことで約 2.5 mg の LMP が得られました。C57BL/6 マウスから摘出した気管支組織を、媒体および LMP で処理しました。この図では、気管支切片の組織病理学的解析により、気管支上皮の構造的完全性に対する LMP の影響が示されています。コントロール群の摘出組織では、気管支上皮はほとんど損傷していませんでした。しかし、LMP処理した摘出組織では、表面の上皮細胞層が損傷または消失しており、ここで見られるように、上皮細胞の高さと密度が著しく減少していました。アポトーシスのマーカーであるTUNEL陽性染色は、対照組織と比較してLMP処理した気管支上皮でより顕著に認められました。この手順を行う際は、マイクロ粒子の作製および組織外植え培養において、無菌状態で作業することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

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バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

学ぶTリンパ球由来リンパ球微小粒子（LMP）のin vitro製造法と気道上皮細胞に対するアポトーシス誘導効果。FACS解析による特性評価と組織培養技術を用いた病態生理学研究手法を解説。

気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成

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