気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成

この手順の全体的な目標は、Tリンパ球細胞株からのリンパ球微粒子またはLMPのin vitro産生を示し、気道上皮細胞に対するそれらのプロアポトーシス効果を実証することです。これは、最初にLMPを作成することによって達成されます。次に、分離された LMP はファックス分析によって特徴付けられます。

次に、気管支組織外植片を培養します。最後に、気管支外植片のLMP処理が行われます。最終的には、ヘマット、トイン、エオシンなどの病理組織学的検査やNC二細胞死検出を用いて、LMPによる気管支上皮層の損傷や上皮細胞のアポトーシスを認めます。

この技術の主な利点は、ヒト末梢血からの微粒子の単離などの既存の方法よりも優れている点は、細胞株に由来する微粒子の大規模な生成をin vitroで実行できることです。一般的に、この方法に不慣れな個人は、気管支explan培養の重要なステップを準備するのが容易ではないため、苦労するでしょう。文化を始めるために。

それぞれ150ミリリットルの新鮮、培地を含む4つのT1 75フラスコ内のCEMT細胞は、摂氏37度でインキュベートし、1ミリリットルあたり200万個の細胞の密度でインキュベートします。各フラスコから細胞を200倍Gで5分間遠心分離することにより収集し、6つの細胞に300倍10を曲げて、150ミリリットルの新鮮な培地を含む新しいT1 75フラスコに入れます。1ミリリットルあたり200万個の細胞密度を維持するには、37.5マイクロリットルのアクチンマイシンDを最終濃度0.5マイクログラム/ミリリットルで培地に加え、摂氏37度で24時間インキュベートします。

すべての培地を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞をGの750倍で5分間スピンダウンします。次に、上清を50ミリリットルの円錐管に移し、Gの1500倍で15分間遠心分離して、大きな細胞断片を除去します。次に、上清を250ミリリットルのボトルに移し、Gの12,000倍で50分間超遠心分離機

次に、上澄みを捨ててペレットを収集します。40ミリリットルの滅菌PBSを使用して、LMP濃縮ペレットを50ミリリットルのチューブで洗浄し、Gの12, 000倍で50分間遠心分離します。この手順を 2 回繰り返します。

最後の洗浄から上清を収集して、1ミリリットルのPBSで車両制御として使用します。ペレットを懸濁し、1.5ミリリットルの滅菌マイクロチューブ分注に移し、単離されたLMPをマイナス80°Cで保存します。ファックス分析で微粒子を特性評価するには、まず、塩化カルシウムを含むサンプルとカルシウムを含まないサンプルの2つのサンプルを調製します。

ファックス管で、1マイクロリットルのLMPを44マイクロリットルのネキシン緩衝液に塩化カルシウムで希釈します。塩化カルシウムを含まないネキシン緩衝液を使用して別のチューブを調製します。次に、X sci 5 および V sci 5 マイクロリットルを各チューブに加え、室温で 15 分間、暗所でよくインキュベートします。

インキュベーション後、400マイクロリットルのファックスインフルエンザシース液を使用してください。反応を停止するには、各チューブに内部標準として10マイクロリットルの7ミクロンカウントビーズ懸濁液を追加します。絶対カウントを得るために、相対サイズ、FSCH、および相対粒度SSCHのゲートとフローサイトメーター上のドットプロットを確立します。

ゲート1に1マイクロメートルのサイズ校正された蛍光ビーズを使用し、7マイクロメートルでビーズをカウントします。ゲート2については、確立されたゲートを使用してF-S-C-H-S-S-C-Hプロット上のLMPサンプルを分析し、アネキシンドットプロットのFL 4チャネルを使用して、歩行2で10, 000カウントビーズに到達するまでの信号を取得し、塩化カルシウムを含むネキシン緩衝液中のLMPのex NVイベントの陽性を決定し、塩化カルシウムを含まないネキシン緩衝液中のLMPのイベントを減算します。次の式に基づいて LMP の絶対数を計算します。

メスデュモンの極細ピンセットと手術用ハサミを使用して、肺組織を無菌的に解剖します。実質と血管を慎重に取り除きます。組織洗浄培地に沈められた気管支をさらに解剖し、直径1〜2.5ミリメートルの気管支を末梢肺組織から分離します。

メスを使用して、滅菌湾曲したマイクロ解剖鉗子によるすくい動作を使用して、気管支組織を約5ミリメートルの厚さの気管支ランクにスライスします。気管支の破片を拾い上げ、以前に準備した皿の傷のある部分に置きます。テキストプロトコルに従って、ティッシュ洗浄培地を取り出し、断片を室温で約5分間インキュベートして、皿に付着させます。

各皿に10ミリリットルの完全なヒーリングメディウムを追加し、高酸素ガス混合物を含む制御された雰囲気のモジュラーインキュベーターチャンバーに置き、チャンバーを洗い流し、ベンチトップオービタルインキュベーターに入れ、摂氏37度で毎分10サイクルで24時間振とうして、培地がフラグメント上を断続的に流れるようにします。インキュベーション後、位相差顕微鏡と倒立光学顕微鏡で組織説明を観察します。その後のLMP治療のために、完全な微細な髪の動きと活発な気管支上皮を備えた気管支エクスプランを選択します。

LMPを治療するには、選択したばかりの気管支エクスプランをカウントし、12ウェル組織培養プレートの各ウェルに印を付けます。各explanについて、0.5ミリリットルの完全な増殖培地を滅菌einorチューブに移します。次に、治療計画ごとに25マイクロリットルのlおよびpストックを追加するか、25マイクロリットルの制御車両を追加します。

コントロールのために、外植片はチューブを優しくたたくことによってよく混合します。混合培地を、湾曲したマイクロ解剖鉗子を備えたマーク付きの12ウェル組織培養プレートの各ウェルに移します。選択した各気管支x explanを組織培養プレートの各ウェルに移します。

摂氏37度の制御された雰囲気のモジュール式インキュベーターチャンバーでインキュベーションを継続し、24時間後に穏やかに振とうします。PBSを使用してEXPLANを3回洗浄し、hおよびe染色の固定とトンネルアッセイに進みます。ここに示すテキストプロトコルによれば、LMPはファックス分析によるネキシンV染色で特性評価され、1マイクロメートルビーズを使用してゲート化され、mpの97%がネキシンVのSF陽性でした。

典型的には、このプロトコルに従って約2.5ミリグラムのLMPが得られた。C57黒色6匹マウスから気管支組織摘出術を行い、ビヒクルおよびLMP処理を行った。この図では、気管支切片の病理組織学的解析により、LMPが気管支上皮の構造的完全性に及ぼす影響が明らかになりました。

コントロールしています。説明によると、気管支上皮はほとんど損傷を受けていませんでした。しかし、LMP処理された外植片では、表在性上皮細胞層が損傷または失われ、ここで見られるように上皮細胞の高さと密度が有意に減少しました。

アポトーシスのマーカーであるトンネル陽性染色は、対照組織と比較して、LMP治療された気管支上皮でより顕著でした。この手順を試行する際は、微粒子を産生し、組織説明培養を行う際には、無菌条件で作業することを忘れないでください。