無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

この手順の全体的な目標は、匂い刺激剤に応答した嗅覚ニューロンの膜特性の変化を測定することです。これは、最初に嗅上皮を解剖し、それを灌流チャンバーに移すことによって達成されます。2番目のステップは、顕微鏡下で目的のOSNを見つけて選択することです。

次に、選択したOSNの樹状突起ノブをパッチクランプし、臭気物質で刺激しながら分析します。最終的に、OSN樹状突起ノブの穿孔パッチクランプは、膜レベルでのOSN機能特性を特徴付けます。この方法は、嗅覚、感覚ニューロンの記録、定義された匂い芸術受容体の発現、さらにはパッチクランプの記録など、嗅覚分野の重要な問題に対処するのに役立ちます。

これらのニューロンの膜特性に関する情報を提供します。刺激力のあるピペットは、1mmのグラスから準備するか、炎を使用して事前に引っ張ったものを購入します。6本のピペットを先端から約1cmの角度で45度の角度に曲げます。

次に、6本の曲がった先端ピペットを7本目のストレートピペットの周りに配置し、アイレットをガイドとして使用して、熱収縮チューブで包みます。ピペットのもう一方の端にあるシュリンクラップを加熱します。シュリンクラップを多めに塗ります。

これにより、プレポ7バレルの刺激ピペットができます。現在、マルチバレル極性を使用して、7バレル刺激ピペットを引っ張ります。引っ張ったら、アイレットの周りに白い接着剤でアセンブリを強化します。

次に、接着剤が必要な溶液を一晩乾燥させます。ナイスタチン溶液は、使用する直前に新鮮にする必要があります。.必要に応じて、3ミリグラムのナイスタチンを量り、50マイクロリットルのDMSOに加えます。.

次に、混合物を20秒間渦巻きます。次に、混合物を2〜3分間超音波処理して、完全に希釈します。次に、20マイクロリットルの混合物を5ミリリットルの細胞内ストック溶液に加えます。

ボルテックスを20秒間混合し、続いて2〜3分間の超音波処理を行います。次に、作業溶液を氷の上で冷やし、準備された光から遮蔽し続けます。このように、作業ソリューションは数時間有効です。

マイクロフィルムを装備したシリンジに作業溶液をロードします。使い切るまで1時間の使用には良いでしょう。ただし、装填したシリンジは氷の上に置いて保存してください。

次に、長いネックと2ミクロンの開口部を持ついくつかの記録電極を引っ張ります。目標は、ナイスタチン溶液をロードすると15〜20メガオームの抵抗を得ることです。最後に、刺激ピペットにリンガーで希釈した臭気物質を入れます。解決。

このプロトコルでは、生後2〜4週間の間にマウスを用意します。本発表では、タウGFPまたはIRESタウGFPを発現するマウス、またはISタウGFPマウスを用いて使用する。対象の または を発現するすべてのニューロンは、GFP でラベル付けされます。

この方法は、すべてのゾーンで使用または表現できます。ただし、背側ゾーンで発現するORの場合、解剖と記録が容易になります。まず麻酔をかけ、次にマウスの首を切ることから始めます。

このプロトコルの結果は、解剖の質によって異なります。これらの解剖ステップは、できるだけ短く、正確でなければなりません。手術を開始するには、解剖ハサミを使用して背に沿って縦方向に切り込み

皮膚を引き離して取り除きます。次に、下顎に沿って切り、歯と平行に冠状に切り込みを入れます。したがって、上顎の切歯を抜きます。

次に、頭の周り、目の後ろに冠状動脈を切開し、後頭部を捨てて、前部を氷冷リンガーに移します。次に、解剖顕微鏡下で、5〜10分以内に中隔を分離します。腹側に沿って縦方向のカットから始めます。

次に、鼻腔の背側外側に沿って背骨を縦方向に切断します。次に、ほとんどの骨と口蓋を取り除きます。単離された中隔を移し、室温で酸素化されたリンガーの容器に上皮を取り付けます。

5分以内に、録音する前に最終的な準備をします。溶液が温かすぎないと、準備が損傷して見えます。記録のために神経上皮にアクセスします。

まず、鉗子で下にある中隔から上皮をはがします。次に、マイクロバンナハサミを使用して、中隔の前端を切断して上皮を解放します。次に、鋤骨鼻器官を慎重に取り外します。

背側に付着しているところを切り落とします。これで、分離された上皮を記録室の粘液側を上にして移動させることができます。所定の位置に配置されたら、ハープを使用して組織を平らにします。

次に、チャンバーを正立顕微鏡に移します。40 x 水浸対物レンズの下で神経上皮を視覚化し、室温で新鮮なリンガーで連続的に灌流します。目的の細胞(この場合はEGFPを発現する)の検索を開始するには、480ナノメートルの光を使用して、530〜550ナノメートルの範囲で光を放出する細胞をスキャンします。

標的樹状突起ノブおよびosnは、明視野下で80〜160 xでレビューした場合、支持細胞と明確に区別できるはずです。次に、電極にSスタチン溶液をロードします。形成された気泡を軽くたたいて、電極をホルダーに取り付けます。

次に、正の圧力をかけます。予想される抵抗は15〜20メガオームです。次に、正圧を維持しながら電極をセルに持っていきます。

抵抗が約40メガオームに増加したら、圧力を解放し、わずかに負圧を加えます。ギガシールを作成する場合、膜電位は約マイナス75ミリボルトに固定する必要があります。細胞が開いたので、実験を進めます。

刺激、プロトコルを適用し、必要に応じて薬理学的治療で灌流して、単一の臭気物質でテストします。200 ミリ秒から 500 ミリ秒の自発的なアクティビティを記録します。臭気物質を500ミリ秒適用し、その後、記載されているプロトコルを使用して最大10秒間応答を測定します。

EGFPでタグ付けされたニューロンを発現するMOR23をパッチし、異なる濃度のalで刺激した。電流クランプモードでは、lyalはMOR 23の配位子です。あるいは、セルを電圧クランプモードでシミュレートしました。

電圧クランプモード記録では、さまざまな特性が監視されました。最大振幅応答を使用して電気生理学で古典的に行われた応答を定量化するために、線量応答をヒル方程式を使用してプロットしました。これらの結果は、検出しきい値、時間的、動的、ダイナミック レンジ、彩度レベルなど、各 OSN のエンコード プロパティに関する情報を提供します。

一度習得すれば、この技術の解剖部分は10〜15分以内に行うことができます。このビデオを見れば、マウスで明確な匂い受容体を発現する嗅覚ニューロンの機能特性を探る方法についてよく理解できるはずです。