定位注入法を適用すると、動物の行動の遺伝的影響を研究するために、
2015年5月10日
cDNAを発現するレンチウイルスまたはshRNAの定位注射は、マウスの特定の脳領域における遺伝子発現を調節することができます。ここでは、そのようなオープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）のような行動のタスク、と定位注射を結合するためのプロトコルを提示します。
この手順の全体的な目標は、標的領域での遺伝子発現の調節が動物の行動にどのように影響するかを評価することです。これは、最初に標的遺伝子の発現を調節するためのレンチウイルスを作成することによって達成されます。2番目のステップは、定位注射を使用して、ERげっ歯類の特定の脳領域にレンチウイルスを注入することです。
次に、不安や抑うつなどの行動は、確立された行動パラダイムを用いて定量的に測定することができます。最後のステップは、正しい注射部位を確認するために組織学を行うことです。最終的には、定位注射と行動評価を組み合わせることで、標的領域の特定の遺伝子がマウスの行動にどのように影響するかを示すことができます。
この手法が既存の方法よりも優れている点は、科学者が小さな標的領域で単一の遺伝子の発現を変更し、マウスの行動変化を評価できることです。この手順を開始するには、麻酔をかけたマウスを定位装置に置き、前歯を前歯クランプに掛けて顎を固定します。次に、頭を完全に安定させるために、イヤーバーを外耳道に挿入します。
次に、マウスの下に加熱パッドを置き、体温を調節します。手順全体を通して、乾燥を防ぐためにげっ歯類の目に人工涙液を置きます。その後、最初に10%ポビドンヨウ素を綿棒で円を描くようにこすり、手術部位を完全に清掃します。
その後、同じ方法で手術部位に70%エチルアルコールをこすります。このクリーニング手順をさらに2回繰り返します。マウスの準備ができたら、滅菌済み機器バッグを開けます。
器具に触れる前に手袋を交換してください。次に、滅菌布を取り出し、器具を布の上に置きます。次に、マウスの皮膚を血液端鉗子で優しくつかみ、メスを使用して切開します。
耳から約1.5センチメートル上から切開を開始し、耳から約0.5センチメートルまで伸ばしてbgmaを露出させます。bgmaが視覚化されたら、滅菌綿の先端を使用して、頭蓋骨の表面を覆っている血液を優しく取り除きます。次に、2つの綿の先端を使用して、皮膚を頭の側面に押し込みます。
次に、ヒュームフードに注射するウイルスを注射器に充填します。内部に気泡が溜まっていないことを確認してください。次に、定位装置に注射器を置き、完全に固定されていることを確認します。
その後、シリンジを頭蓋骨の表面の真上に来るまでゆっくりと下げます。次に、滅菌シリンジ針の先端をB bgmaとインタールーラルラインの交点に移動します。この点を 0 に設定します。
続いて、対象地域の座標を設定します。シリンジの針を穴を開ける目的部位に移動します。次に、ドリルビットを頭蓋骨に対して45度の角度でターゲットサイトの真上に置き、ドリルを開始します。
皮質の損傷を防ぐために、脳に穴を開けないように注意してください。その後、滅菌綿の先端で穴から血液を洗い流します。シリンジを下げて、先端が脳の表面にぴったりとく
るようにします。DV 座標を 0 に設定し、シリンジを目的の深さまで下げます。次に、毎分0.2マイクロリットルの速度で注射を開始します。注射が終了したら、約2分間待って、残留ウイルスが吸収されたことを確認します。
次に、シリンジをゆっくりと上げます。綿の先端を使用して、注射部位から液体を取り除きます。その後、皮膚を縫合し、定位システムから動物を取り除きます。
マウスが目を覚ますまでマウスを加熱パッドに置いたままにし、必要に応じて追加の鎮痛剤を投与します。この手順では、プラスチック製の正方形のアリーナを取得します。実験前にアリーナを70%エチルアルコールで洗浄してください。
次に、アリーナを床に置き、影とまぶしさを最小限に抑えるように照明が設定されていることを確認します。次に、マウスが画面に表示されるように検出設定を調整します。その後、カメラの電源を入れて動作タスクを記録し、マウスが壁に面するようにマウスをアリーナの中央正面に向けて配置します。
タイマーを5分に設定し、アリーナから離れるか、部屋を出ます。5分後、マウスをケージに戻します。次の動物に進む前に、70%エチルアルコールを使用してフィールドを徹底的に清掃してください。
次に、2リットルの透明なバケツに22度の水を入れます。バケツを床に置き、影とまぶしさを最小限に抑えるように照明が設定されていることを確認します。トラッキングソフトウェアを使用する場合は、カメラをバケットの真上に配置します。
マウスが画面上で見やすくなるようにソフトウェア設定を調整します。次に、カメラの電源を入れて、動作タスクを記録します。マウスを水の入ったバケツの真ん中にそっと置き、前足が立つようにします。
最初に水に触れて、頭が沈まないようにします。その後、行動エリアから離れる前にタイマーを6分に設定します。6分後、マウスをバケツから取り出し、余分な水を拭き取ってからケージに戻します。
これは代表的な脳スライスで、歯状回へのウイルスの注入が成功したことを示しています。この図は、対照マウスと実験マウスが新しいオープンフィールドの中心で過ごした時間を示しています。実験マウスは、不安の表現型を示すアリーナの中央で過ごす時間が有意に少なく、この図は、強制水泳試験で対照マウスと実験マウスが動かない時間を示しています。
実験マウスは、動かないで過ごした時間の長さにおいて、対照群と有意差はありませんでした。このビデオを見た後、視聴者はげっ歯類の行動を評価するために定位注射をどのように使用するかについてよく理解しているはずです。
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概要
本プロトコルでは、マウスの特定の脳領域における遺伝子発現を調節するための、レンチウイルスの定位注入法の使用について概説します。これらの注入と行動評価を組み合わせることで、不安およびうつに関連する行動への影響を評価します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 遺伝子治療
背景
- 立体定位注入により、脳領域への精密な標的設定が可能になります。
- レンチウイルスは、遺伝子発現を効果的に調節できます。
- オープンフィールドテスト（OFT）や強制水泳テスト（FST）などの行動試験は、不安やうつ状態を評価するための標準的な手法です。
- 遺伝子と行動の関係を理解することは、神経科学研究において極めて重要です。
研究目的
- 特定の脳領域における遺伝子調節が行動にどのような影響を与えるかを評価すること。
- 定量的な測定のために、確立された行動パラダイムを利用すること。
- 組織学的解析を通じて、注入の正確性を確認すること。
使用された手法
- 標的遺伝子の発現を調節するためのレンチウイルスの作製。
- げっ歯類の特定の脳領域への定位注入。
- オープンフィールド試験および強制水泳試験を用いた行動評価。
- 注入部位の組織学的確認。
主な結果
- 投与後の行動変化を定量的に測定した。
- 組織学的解析により、注入部位が正確に標的化されていることを確認した。
- 遺伝子発現の調節が、不安および抑鬱行動に影響を及ぼした。
- これらの複合的なアプローチにより、遺伝子と行動の関係についての知見が得られた。
結論
- 立体定位注入と行動評価を組み合わせることは有効である。
- この手法により、特定の遺伝子が行動に果たす役割を解明できる。
- 今後の研究において、さらなる知見を得るために本プロトコルを活用することが可能である。
よくある質問
業界における実用的な関連性
本プロトコルでは、マウスの脳領域における精密な遺伝学的解析を可能にし、特定の遺伝子が不安および抑うつ関連行動をどのように調節するかを評価します。定位的にレンチウイルスを導入し、定量的な行動指標と組み合わせることで、神経科学研究におけるターゲットの検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。この手法は、分子ターゲットと表現型結果を関連付ける予測の信頼性を提供し、中枢神経系（CNS）創薬における初期段階のポートフォリオ決定に寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 特定の神経回路における遺伝子機能の仮説検証を可能にし、行動の根底にある生物学的メカニズムを解明する。
- 運用上の価値： 広範な脳損傷を伴わずに遺伝子発現を調節できる、標的特異性の高い集中的かつ可逆的な手法を提供する。
- 予測的価値： 遺伝子操作を定量可能な不安およびうつに関連する行動に結びつけることで、表現型スクリーニングをサポートする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状況： 遺伝学的または薬理学的調節に対する定量的で再現可能なアウトカムとして、標準化された行動パラダイム（OFT、FST）を確立します。
- 拡張性： 外科的手法および注入のワークフローは、複数の標的部位やウイルス構築物を用いたハイスループット研究に適応させることが可能です。
- データの質： 組織学的確認によって標的への送達を保証し、ばらつきを抑えて行動データの信頼性を高めます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患への関連性：不安およびうつ病に関連するエンドフェノタイプをモデル化し、中枢神経系（CNS）疾患におけるトランスレーショナルなバイオマーカーの整合を可能にします。
- 前臨床の連続性：ターゲットヒットから疾患に関連する神経回路におけるin vivo検証まで、メカニズムの追跡調査をサポートします。
- リスク調整済み意思決定：化合物の投資前にターゲットと行動の関係におけるリスクを低減し、go/no-go判断を容易にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの仮説設定から表現型検証に至るディスカバリー・コンティニュアム（発見の連続体）に適合しており、行動に関連する脳領域における遺伝的修飾因子の反復的な検証を可能にします。
- 探索生物学：特定の脳領域における遺伝子機能の仮説駆動型の検証をサポートし、行動に関与する経路を明らかにします。
- スクリーニング：遺伝学的または実験的条件間で比較可能な、定量的で標準化された行動出力を生成します。
- 分析：測定可能な従属変数（中央滞在時間、不動時間）を算出することで、対照群と実験群の間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：分子操作を、ヒトの不安およびうつ病モデルに対する面面的妥当性を備えた行動表現型へと結びつけます。
- エンタープライズでの再利用：この立体定位・行動プラットフォームは、複数の遺伝子、脳領域、または行動アッセイにわたって再利用でき、運用効率を向上させます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 回路特異的な遺伝子変調を通じてメカニズムの曖昧さを軽減し、ターゲットの信頼性を向上させます。
- 運用的価値： 標準化された手術、注射、および行動試験手順により、再現性を高めます。
- 戦略的価値： 化合物スクリーニングキャンペーンの前にCNSターゲットの早期デリスキングを可能にし、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 行動に関連する表現型の遺伝的ドライバーを検証することで、リスク調整後のターゲット優先順位付けに情報を供します。
実施上の留意点
- 定位固定手術、ウイルス操作、および齧歯類の行動試験に関する専門知識が必要です。
- 滅菌済み手術器具、定位固定装置、マイクロシリンジ、および行動トラッキングシステムに依存します。
- 一貫した結果を得るために、手術、組織学、および行動科学の各チーム間での標準化が必要です。
- 動物モデル間でのウイルス力価、注入量、および術後回復の変動を考慮しなければなりません。
- 急性または亜急性の行動評価に限定されており、慢性的な影響を評価するには縦断的な研究デザインが必要です。
