アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

本手順の全体的な目的は、抗原カプシド組み込み戦略を利用して、組換え二価アデノウイルスベクターを実証原理として用いたアデノウイルス5型ベクターワクチンのアプローチを開発することです。抗原カプシド組み込み戦略を用いて、複数のクローニングステップにより修飾プラスミドA D five R one K-W-S-H-V-R five hissを構築します。次に、二価アデノウイルスベクターR one K was HVR fiveを作成します。

Hissを回収し、増殖させて精製します。次に、ウイルス力価およびウイルスキャプシドに組み込まれた抗原の抗原提示能を解析します。最後に、抗原キャプシド組み込み戦略を用いることで、2価アデノウイルスベクターがD5陽性血清による中和を回避できる可能性を評価します。

改変プラズミド A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss を構築するために、複数のクローニング工程が用いられます。本日は、抗原カプシドへの組み込み戦略について実演します。この戦略は、導入遺伝子発現法などの他の戦略と比較して有益です。なぜなら、目的の抗原をアデノウイルスのカプシド上にタンパク質として提示させるだけでなく、その抗原に対する強固な液性免疫応答を誘導できるためです。

キャップ修飾アデノウイルスの作製に関する手順は、制限酵素の選択や目的遺伝子の長さなど、推奨されるウイルスベクターの開発に多くの変数が関与しているため、習得が困難であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要になります。本日の実演は、私のポストドクターであるLin Lin Gu博士とNitra Farrow博士、および研究員のAlexandre Krenが行います。シャトルプラスミドを構築するために、HVR 1 KWA断片6 µgに対し、GE 1およびCCC 1をそれぞれ6ユニットずつ添加します。

消化反応液を37°Cで3時間インキュベートします。消化断片を2%アガロースゲル電気泳動で分離し、メーカーのプロトコルに従ってDNAゲル抽出キットを用いて断片を精製します。次に、精製した断片12 ngを、 previously constructed shuttle plasmid（既作のシャトルプラスミド）100 ngのA1およびACC1部位にライゲーションします。

HVR five hiss six pH five sを用いて、室温で2時間、反応液量10 µLで反応させます。その後、ライゲーション反応液1 µLを、エレクトロコンピテントDH5α細胞50 µLに加え、エレクトロポレーションを行った後、SOC培地950 µLを加えます。形質転換した細胞を37 °C、200 RPMで1時間インキュベートし、その後、培養液の100～200 µLをLB CANYプレートに塗布します。

37 °Cで一晩インキュベートします。精製したシャトルプラスミド6 µgを消化させるため、Eco RIとPme Iをそれぞれ6 unitずつ使用し、37 °Cで3時間処理します。相同組換えアームと二重変異導入済みエクソン5遺伝子を含む断片を精製した後、SUA 1を用いてバックボーンプラスミドであるpAD5-ΔH5を線状化し、相同組換えを行います。

エレクトロポレーションを用いて、精製したシャトル断片100 nanogramsとバックボーンプラスミド100 nanogramsを、50 microlitersのエレクトロコンピテントBJ 5 180 3細胞に共導入します。このビデオで先に示したように、翌日にカナマイシンを含む3 millilitersの液体LB培地に約10個のコロニーをピックアップし、一晩培養した後、テキストプロトコルに従ってスクリーニングを行います。次に、以前に示した方法で、精製したプラスミド100 nanogramsをDH five alpha細胞に形質転換し、adウイルスベクターを回収します。

まず、PAC oneを用いて、100 µLの液量で15 µLのベクターを直線化します。消化後、37 °Cで3時間インキュベートします。その後、ドラフトチャンバー内で直線化プラスミドを抽出します。

等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを反応液に加え、10,000 Gで1分間遠心分離し、上清を回収します。抽出と遠心分離を抽出口の容量に達するまで繰り返します。100%エタノール 300 µLと酢酸 10 µLを加え、10,000 Gで10分間遠心分離します。その後、上清を捨て、70%エタノール 700 µLを加えて再度遠心分離します。

ペレットを再懸濁し、DNA量を定量した後、メーカーの指示に従い、直線化したプラスミド3 µgと市販のリポソームトランスフェクション試薬を、あらかじめ調製したコンフルエンス80%のHEK 2 93細胞を含むT 25フラスコにトランスフェクションします。6時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を完全培地に交換し、フラスコをインキュベーターに戻します。無菌フード内で、プラークが完全な細胞変性効果（CPE）を示したとき、残っている細胞をフラスコから掻き取り、培養液を300 G、4 °Cで10分間遠心分離します。

次に、2% FBS含有培地1 mLを用いて細胞ペレットを再懸濁します。続いて、凍結融解を4回繰り返して細胞を破砕し、得られたライセートを4 °Cで10分間遠心分離します。回収したウイルスを含むS上清を用いて、ウイルスベクターの大スケール培養を行います。

T 25フラスコ内のウイルス溶解液の3分の1から全部を、HEK 2 93細胞を含むT 75フラスコに移します。完全なCPEの発現を待ち、前述の方法で上清を回収した後、全ウイルスの半分を1つ以上のT 1 75フラスコのHEK 2 93細胞で増殖させます。その後、T 1 75フラスコから単離したウイルスを12本以上のフラスコで増殖させます。

1.33 g/mLおよび1.45 g/mLの塩化セシウム溶液を調製した後、T 75フラスコで培養した細胞を用意します。超遠心管に1.33 g/mLの塩化セシウムを4 mL加え、さらに同じチューブの底部に1.45 g/mLの塩化セシウムを4 mL加えます。同じチューブの最上層にウイルス溶解液の上清を4 mL加え、110,000 ×g、4 °Cで3時間遠心分離します。

これにより、内部で成熟した下層のウイルスバンドを、欠損した上層のウイルスバンドから分離します。3 mL シリンジに取り付けた 33 ゲージの針を使用して、下層のバンドを回収してください。その後、5 回の分注を行い、溶液を 4 mL まで調整します。

次に、塩化セシウム密度勾配をさらに2本用意し、希釈したウイルスを上層に負荷して、110,000 G、4 °Cで一晩遠心分離します。装置内部にて。先ほど示した方法でウイルスバンドを回収します。

次に、33ゲージの針と3 mLシリンジを使用して、ウイルス溶液を透析カセットに注入します。テキストのプロトコルに従って調製した1x透析バッファー700 mLにカセットを浸し、3時間ごとにバッファーを4回交換します。その後、針とシリンジを使用して操作を行います。

カセットからウイルス溶液を回収し、ウイルスの物理的タイターを決定します。ウイルス溶解バッファーを用いて、ウイルスおよびバックグラウンドコントロールとして使用する透析バッファーの両方を1:10および1:20に希釈し、すべてのチューブを56 °Cで10分間インキュベートします。バイオフォトメーターの電源を入れ、吸光度モードを光学密度260 nmに設定します。

ブランクボタンをクリックし、10倍に希釈した透析バッファーを用いてバックグラウンド信号の補正を行います。バイオフォトメーターの画面に10+90と入力してください。チューブを10倍に希釈したウイルス液のチューブに交換し、10倍希釈ウイルスの信号を測定します。

1:20希釈液を測定するには、1:20に希釈した透析バッファーを使用し、画面上で「5 + 95」と入力してバックグラウンドを調整します。その後、バッファーチューブを1:20希釈ウイルスチューブに交換し、信号を読み取ります。2つのウイルス読取値に1.1 × 10¹²を乗じ、2つの希釈液から得られた個別の力価に基づき、単位をVP/mLとして平均力価を算出します。テキストプロトコルに従ってマウスでウイルスを評価し、レスキューされたウイルスがウイルスキャプシド表面に抗原性HIV抗原およびHisタグを発現しているかを確認します。

主要タンパク質Heon 5について。ここに示すように、ヒト2F5モノクローナル抗体およびマウスanti-Hisタグモノクローナル抗体を用いてそれぞれELISAを実施したところ、ヒト2F5抗体とマウスanti-His抗体の両方が2価のA5ウイルス粒子に結合したが、陰性対照であるA5ベクターには結合しなかった。ELISAのデータを確認するためにウェスタンブロット解析を行ったところ、ヒト2F5抗体とマウスanti-His抗体の両方で、117 kilodaltons付近にのみ特異的なバンドが検出された。

DIVALENTに、Heon 5タンパク質のサイズに相当するAd5ウイルスを添加しました。構築したAd5ウイルスがAd5陽性血清による中和を回避できるか評価するため、中和試験を実施しました。その結果、コントロールのAd5ベクターをAd5陽性血清で処理しなかった場合の相対発光単位（rlu）は、血清で処理した場合よりも12倍高く、ウイルスが中和されたことが示唆されました。

対照的に、作製した2価AD5ウイルスに対するRの使用量については、処理済みサンプルと未処理サンプルの間でほとんど差がなく、作製したウイルスが中和を回避したことが示唆されました。このビデオを視聴することで、Add5ベクターワクチンの開発における抗原カプシド組み込みアプローチへの理解が深まったはずです。現在、私たちはこの戦略を希少セロタイプベクターと組み合わせて使用しています。

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