アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

この手順の全体的な目標は、アデノウイルス血清型5ベクターワクチンの開発のための抗原キャップ取り込み戦略を利用することです アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチ これは、抗原キャプシド取り込み戦略を使用して原理の証明として、複数のクローニングステップを使用して、修飾プラスミド、A D 5 R one K-W-S-H-V-R five hissを構築します。次に、二価のアデニルウイルスベクター。R 1 KはHVR 5でした。

ヒスはレスキューされ、繁殖し、浄化されます。次に、ウイルス力価と、ウイルスカプシド上の取り込まれた抗原の抗原性表示が特徴付けられます。最後に、D5陽性血清による中和を回避するDivalent Adenウイルスベクターの可能性を、抗原キャプシド取り込み戦略を使用して評価します。

複数のクローニングステップを使用して、修飾プラスミド、A D 5 R one K-W-A-S-H-V-R five hissを構築します。本日は、抗原キャプシド取り込み戦略のデモンストレーションを行います。この戦略は、アデノウイルスの捕捉物に目的の抗原をタンパク質として表示するだけでなく、その抗原に対する強固な体液性応答を可能にするため、導入遺伝子発現法などの他の戦略と比較して有益です。

この方法の視覚的な実証は、キャップ修飾アデノウイルスの生成に関するステップを学ぶことが困難であるため、多くの変数が推奨ウイルスベクターの開発に寄与するため、制限酵素の選択、他者に関心のあるエネルギーのレンズ手順を実証することが重要である。今日は私の2人のポスドク、Lin Lin Gu博士とNitra Farrow博士です。また、アレクサンドル・クレン、研究室の研究員 シャトルプラスミドを構築するには、GEとCCCのそれぞれ6ユニットをHVRの1KWAフラグメントから6マイクログラムまで追加します。

消化反応を摂氏37度で3時間インキュベートします。電気泳動により2%agrosゲル中の消化断片を分離し、製造元のプロトコルに従ってDNAゲル抽出キットを使用してフラグメントを精製します。次に、精製されたフラグメントの12ナノグラムを、以前に構築したシャトルプラスミドの100ナノグラムのaGサイトおよびACCサイトにライゲーションします。

HVR 5 ヒス、6 pH 5 s、および室温で 10 マイクロリットルの反応量を 2 時間。次に、ライゲーション反応の1マイクロリットルを50マイクロリットルのエレクトロコンピテントDHファイブアルファセルに加え、エレクトロエイトを加えてから950マイクロリットルのSOC培地を添加します。形質転換細胞を摂氏37度、200RPMで1時間インキュベートしてから、100〜200マイクロリットルの培養物をLB CANYプレートに広げます。

摂氏37度で一晩インキュベートします。Echo R oneとPME oneをそれぞれ6ユニットずつ使用して、精製したシャトルプラスミド6μgを摂氏37度で3時間消化します。相同組換えアームと二重修飾エクソン5遺伝子を含むフラグメントを精製した後、SUA oneを使用してバックボーンプラスミドを直鎖化し、PAD5、δH5を使用して相同組換えを行う。

エレクトロポレーションを使用して、精製されたシャトルフラグメントとバックボーンプラスミドのそれぞれ100ナノグラムを50マイクロリットルのエレクトロコンピテントBJ 5 180 3細胞に共変換します。翌日のこのビデオで前述したように、約10のコロニーを缶マイシンを含む3ミリリットルの液体LBに選択し、テキストプロトコルに従ってスクリーニングする前に一晩成長させます。次に、100ナノグラムの精製プラスミドを、以前に実証したようにDHファイブアルファ細胞に形質転換し、添加したウイルスベクターをレスキューします。

まず、PAC one を使用して、100 マイクロリットルの体積で 15 マイクロリットルのベクトルを線形化します。消化後37°Cで3時間インキュベートします。ヒュームフードの下で直鎖状プラスミドを抽出する。

等量のフェノールクロロホルム、イソアミルアルコールを反応遠心分離機に10, 000 Gで1分間加え、上清を収集してから抽出を繰り返す前に抽出し、抽出した容量に回転させます。300マイクロリットルの100%エタノールと10マイクロリットルのアセテートスピンを10, 000Gで10分間加えます。次に、上清を捨てた後、700マイクロリットルの70%エタノールを加えてから、再度回転させます。

ペレットを再懸濁し、DNAを定量したら、3マイクログラムの直鎖状プラスミドと市販のリポソームトランスフェクション試薬を、製造元の指示に従って、事前に調製した80%コンフルエントHEK 2 93細胞のT25フラスコにトランスフェクションします。6時間インキュベートした後、フラスコをインキュベーターに戻す前に、トランスフェクション培地を完全な培地と交換してください。プラークが滅菌フードの下で完全な細胞変性効果またはCPEを発現したら、フラスコから残りの細胞をこすり落とし、培養物を300Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。

次に、2%FBSを含む1ミリリットルの培地を使用して、細胞ペレットを再懸濁します。次に、4ラウンドの凍結融解を行って細胞を破砕し、ライセートを摂氏4度で10分間遠心分離します。レスキューされたウイルスを含むS上清を採取し、ウイルスベクターを大規模培養で増殖させます。

T 25フラスコからのウイルス溶解液の3分の1を、HEK 2 93細胞を含むT 75フラスコに溶断します。完全なCPEを発生させ、前に実証したようにサピネートを回収した後、全ウイルスの半分を1つ以上で増殖させます。次に、HK2 93細胞のT1 75フラスコは、T1 75フラスコから単離されたウイルスを1ダース以上で増殖させます。

T 1 75フラスコの細胞は、1ミリリットルあたり33グラムおよびミリリットルあたり1.45グラムを1ポイント調製した後です。塩化セシウム溶液は、超遠心チューブに4ミリリットル、1ミリリットルあたり1.33グラムの塩化セシウムを追加し、同じチューブの底に4ミリリットル、1ミリリットルあたり1.45グラムの塩化セシウムを追加します。同じチューブの上部に4ミリリットルのウイルス溶解物supinateを加え、次いで110, 000Gおよび4°Cでチューブを3時間遠心分離する。

これにより、成熟した下位ウイルスバンドと欠陥のある上位ウイルスバンドが内部で分離されます。3ミリリットルの注射器に取り付けられた33ゲージの針を使用して、下部のバンドを収集します。次に、5人のヒッピーを使用して、溶液を最大4ミリリットルにします。

次に、さらに2つの塩化セシウムグラジエントを調製した後、希釈したウイルスを上にロードし、グラジエントを110,000Gおよび摂氏4度で一晩遠心分離します。ボンネットの下。先ほど示したように、バイラルバンドを収集します。

次に、33ゲージの針と3ミリリットルの注射器を使用して、ウイルス溶液を透析カセットに注入します。テキストプロトコルに従って調製した1×透析緩衝液の700ミリリットルにカセットを入れ、緩衝液を3時間ごとに4回交換した。次に、針と注射器を使用します。

カセットからウイルス溶液を採取し、ウイルスの物理的力価を測定します。ウイルス溶解バッファーを使用して、バックグラウンドコントロールとして使用されるウイルスと透析バッファーの両方を1〜10および1〜20で希釈し、すべてのチューブを摂氏56度で10分間インキュベートします。バイオ光度計の電源を入れ、吸光度のモードを光学密度260ナノメートルに設定します。

1:10に希釈した透析バッファーを使用し、空白のボタンをクリックしてバックグラウンド信号のバランスを取ります。バイオ光度計の画面で10プラス90を入力します。チューブを1:10に希釈したウイルスのチューブと交換し、1:10に希釈したウイルスの信号を読み取ります。

1〜20の希釈を測定するには、1〜20に希釈した透析バッファーを使用して、画面上で5と95を入力するバックグラウンドのバランスを取り、バッファーチューブを1〜20の希釈ウイルスチューブに交換して信号を読み取ります。2つのウイルス読み出し数に1.1×10を掛けて12を掛け、2つのdiluからの2つの個々の力価に基づいて、VP/ミリリットルあたりの単位で平均力価を計算します。テキストプロトコルに従ってマウスのウイルスを評価し、レスキューされたウイルスがウイルスキャプシドの表面に抗原性HIV抗原とhistタグを表示するかどうかを示します。

メジャープロテインHeon 5。イライザは、ここに示すように、ヒト2F5モノクローナル抗体およびマウス抗ヒスタグモノクローナル抗体をそれぞれ用いて実施し、ヒト2Fファイブ抗体およびマウス抗ヒス抗体をそれぞれ二価に結合し、5個のウイルス粒子を添加し、一方、ネガティブコントロールには結合がなかった。ヒトの2つのF 5抗体とマウスの抗HIS抗体の両方が検出した特定のバンドが約117キロダルトンのみであったため、E izaデータを確認するために5ベクターウェスタン血液分析を使用しました。

DIVALENTには、Heon fiveタンパク質のサイズに対応する5つのウイルスを追加します。構築した5種類のウイルスを添加して陽性を5個追加することで中和を回避する可能性を評価するために、中和アッセイを実施した。その結果、対照の5ベクターを添加した陽性血清を添加せずに処理した場合の相対発光単位またはrluは、血清で処理した場合よりも12倍高かったことが示され、ウイルスが中和されたことが示唆されました。

対照的に、構築された二価ADファイブウイルスのR使用には、処理されたサンプルと未処理のサンプル間でほとんど差がなかったことから、構築されたウイルスが中和を免れたことが示唆されました。このビデオをご覧いただければ、5ベクターワクチン開発のための抗原キャプシド取り込みアプローチについて、より深く理解できるはずです。現在、この戦略を希少な血清型ベクターと組み合わせて使用しています。

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