Name: 培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学ぶ 培養ヒト大腿骨組織外植モデルを用いた乳癌細胞の増殖・移動・定着の研究法。バイオルミネセンスイメージングと蛍光顕微鏡で骨転移ニッチにおける細胞動態を解析し、転移メカニズムの解明と治療戦略の開発に貢献する。

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これらの研究は、部分的には、オルタナティブ研究開発財団（107588）、国立衛生研究所（1U54CA136465-04S1）、およびカリフォルニア乳がん研究プログラム（201B-0141）からの補助金により、賄われた。私たちは、博士に感謝。彼らの寛大な寄付のためのアンドリュー·ウィルバーとR.スコット·マッキバー<pkt2 lubig=""> transponsonおよびPK / hUbiC-SB11トランスポザーゼプラスミド。私たちは感謝ジョンTamaresis、博士号を認めるTHR標本の収集を容易にするための統計的手法、移行のアッセイにアドバイスをフローサイトメトリー、ジョーゼットHenrichを実行するためのティモシー·ブラウン、そしてナンシーBellagamba上のアドバイス。 </pkt2>

大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目THR手術を受けている患者から採取した。すべての組織は、スタンフォード大学の研究コンプライアンス室の規則に従って匿名化検体として採取した。 1。乳癌細胞株（複数可）を選択する<ol><li>取得またはルシフェラーゼ-GFPレポーター構築物を有する所望の乳癌細胞株（複数可）をトランスフェクトする。以下の実験は、 スリーピングビューティートランスポゾンプラスミドPKT2 / LuBiGトランスフェクションすることによってMDA-MB-231およびMCF-7乳癌細胞株ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように操作（Fluc細胞）および高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用いて行った。とトランスポザーゼプラスミドPK / hUbiC-SB11 45,46。 注：トランスフェクトされた細胞株は、MDA-MB-231-Flucを-EGFPおよびMCF-7-Fluc細胞-EGFPと呼ばれている。 </li></ol> 2.組織Fの分離大腿ヘッドからragments <ol><li> THR手術後、生理食塩水で満たされた無菌の容器に廃棄された大腿骨頭を収集する。研究所に検体を移し、手術の1-3時間以内にそれを処理する。注：処理の遅延がある場合には、4℃で試料を置く。 </li><li>実験の各タイプについては、以下に定める滅菌手袋、外科鉗子、ピンセット、器具をすすぐために、70％イソプロパノールでビーカー、および組織培養容器：層流の組織培養フード内で吸収マットの上、以下の項目を配置することによって、作業領域を準備する。 </li><li>無菌手術用手袋を身に着けていることは、片方の手で丸い大腿骨ヘッドを保持する大腿骨の露出した上軸から希望のサイズ（〜2〜5ミリメ​​ートル）の小柱骨片を抽出する一方で骨鉗子を使用する。増殖のタイプに応じて、培養容器（ 例えば、6-、12-、または24ウェル組織培養プレートまたは遊走チャンバー）内に骨片を移し、コルonizationまたは遊走実験手順3、4または5に記載の方法。 注：上記のように骨組織断片は、それぞれ特定の増殖、コロニー化または移行アッセイのための最初のステップを完了した後に収穫する必要があります。 図2に示すように、断片は、サイズの範囲であろう。フラグメントの前または標準化の目的のために実験後に秤量することができる。 </li></ol> BLIを使用して、乳房細胞増殖を測定する骨の断片に隣接3.共培養乳癌細胞<ol><li>実験の前に、/50μlの2×10 5乳癌細胞を含有する懸濁液を調製し、培養物中の骨片を固定するための骨ワックスのプラグを用意する。 3ピースにP200のマイクロピペットチップをカットし、骨ワックスの小さい（〜35 mg）の作品をカットする「クッキーカッター」の方法で最大の作品の狭い方の端を使用しています。ペトリ皿に骨ろうプラグを排出する最小単位の広い方の端を使用してくださいストレージ用。 </li><li>各ウェルの12時の位置に骨ろうの部分を置き、静かに滅菌手袋をはめた人差し指で押し下げます。 </li><li>ピペット6ウェルプレートの各ウェルの中央にDMEM-10％FBS +ペニシリン-ストレプトマイシン中で1×10 5乳癌細胞を含む細胞懸濁液50μl。 （あるいは、必要に応じて分散されたパターンでシード細胞が）、細胞付着を促進するために、45分間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。 </li><li>各実験ウェルについての骨のワックスの1枚に1骨片を置き、それを確保するために骨鉗子で穏やかな圧力を適用します。下の3つのウェルのみをコントロールとして、骨のワックスを含有しながら、与えられたTHR標本から3骨片は、トップ3ウェルに入れられるように三連で実験を行う。 </li><li>を5mlピペットを用いて、穏やかにゆっくりと乳房細胞または骨断片を追い出し回避するために、各ウェルの側にDMEM-10％FBSを5ml提供。 37でプレートを置き76; 20〜24時間、C組織培養インキュベーター。 </li><li>生物発光イメージング（BLI）を実行するために、各ウェルに（300μgの/ mlの濃度を達成する）インキュベーターからプレートを除去し、ルシフェリン基質を加える。イメージは、次のパラメータを用いてIVISイメージングプラットフォーム上ですぐにプレート：1のFストップ、小さなビニング、1秒の露光時間は、レベルD.は、信号それぞれの強度だけでなく、平均的な輝き（光子/秒/平方センチメートルを測定/ステラジアン）。 </li><li>すべての実験およびコントロールウェルについての平均輝きを定量するために関心領域（ROI）の領域を定義するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 Excelシートにエクスポート平均放射輝度値は、統計を実行し、グラフを生成する。 </li></ol> 4.共培養コロニー形成を研究する骨の断片上に直接播種乳癌細胞と細胞数<ol><li>直接24ウェル組織培養プレート（1断片/ウェル）の空のウェルに骨片を配置するために鉗子を使用する。 </li><li>ピップ各骨片の上に直接1 X 10 3-6乳がん細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をETTE。細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。静かにフラグメントが完全に培地中に沈められていることを各ウェルなどの側面に1〜2ミリリットルDMEM-10％FBSを追加します。 20-24時間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、各ウェルを1mlのDMEM-10％FBSを含有する新鮮な24ウェルプレートに、各骨組織フラグメントを転送するために鉗子を使用する。 BLIを実行するには、手順上記の3.6から3.7に従ってください。さらに、断片は、蛍光顕微鏡を使用して表示、またはステップ6で説明したように、乳癌細胞数および特性の分析のための骨髄集団を得るためにフラッシュされる。 </li><li> BLI、ピペット蛍光ビスホスホネート標識溶液を5μl（事前以下の蛍光顕微鏡で定性的な評価のための完全な断片を製造するために、骨片の鉱化骨片を標識するために、各ウェルに）、製造業者の指示に従って比べ。さらに24時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>蛍光ビスホスホネート標識溶液中での培養の24時間後に、画像GFP（485 nm）であり、ビスホスホネートラベル（680 nm）に設定され、蛍光顕微鏡を用いて、フェノールレッドを含まない培地とビューを含む組織培養プレートにフラグメントを転送するために鉗子を使用する。 </li></ol> 5.骨組織フラグメントに乳癌細胞の移行を測定し、培養骨断片上清<ol><li>骨組織培養上清の方へ移行。 注記：特定のTHR標本から3断片を3上清を生成するために使用されるような三連での実験を行います。各実験について、マイグレーションが骨上清対コントロール培地のみを含む3つのウェルを含む3つのウェル間で比較される。 <ol><li>骨のTISの生成ウェル当たり2.2ミリリットルDMEM-10％FBSを含有する12ウェルプレートのウェルに、骨片を配置することにより、上清を訴える。 24時間、37℃の組織培養インキュベーター中で培養。 24時間後に培地を撤回し、2.2ミリリットルの新鮮なDMEM-10％FBSを交換してください。 DMEM-10％FBSを同じように含有処理対照ウェル。 注：培地は、手術に起因する組織損傷に応答して分泌された因子を除去するために24時間後に変更される。骨組織の上清を、FBS含有培地中で生成されるので、FBS含有培地を含むウェルのみ乳癌細胞遊走に対するFBSの寄与を制御するために含まれる。 </li><li> 48時間後に、レシーバプレートのウェルに各上清/対照培地とピペット0.9mlの収集。インサートは、後に、これらのウェルに配置される。挿入物を播種しながら組織培養インキュベーター中レシーバープレートをインキュベートする。注：残りの上清（蒸発後〜1ml）をセクレトーム事実上の分析のために収集することができるRS場合は44を希望する。 </li><li>トランスウェルインサートをシードするには、標準の、空の24ウェル組織培養プレートに入れます。 図1Aに示すように、各インサートの上部の、内膜表面にDMEM-10％FBS中に1×10 5個の乳癌細胞を含むピペット350μlの細胞懸濁液。付着を促進するために45分間37℃で組織培養インキュベーター中に播種された挿入物を含有する24ウェルプレートを置く。 </li><li>細胞をインサートに取り付けた後、製造業者の説明書に従って受け板にインサートを転送するために鉗子を使用する。角度インサート膜とウェル上清受信機との間の気泡の形成を防止するだけでなく、受信機にそれを置く各インサート。 37℃の組織培養インキュベーター中で20時間インサートレシーバープレートをインキュベートする。 注：インサート膜と受信機の間に気泡のためのレシーバープレートの下側​​を確認してもsupernatanトン。泡が表示されている場合は、特定のインサートを削除し、気泡が存在しないまでも受信機に再配置します。 </li><li> 20時間後、レシーバープレートからのインサートを削除する鉗子を使用しています。ステップの手順を使用すると、3.6から3.7イメージにに​​移行し、レシーバプレートウェルの底部に取り付けた細胞をBLIを行う。 </li></ol></li><li>骨組織片の方へ移行。 注記：特定のTHR標本から3フラグメントは、3つの別々のインサート内に配置され、3ガラスビーズを対照として、3つの別々のインサート内に配置されるように三連での実験を行います。 <ol><li>各ウェルに0.9ミリリットルDMEM-10％FBSをピペッティングすることによりレシーバプレートを準備します。挿入を準備している間、組織培養インキュベータにそれを置きます。 </li><li>挿入を種子に、蓋を持つプラスチック製のマイクロチューブボックスの表面にそれらを反転。 dは1×10 5乳癌細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をピペットirectly（反転インサート上で上を向いている）各挿入膜の外、底面に。蓋付きのマイクロチューブボックスが開いて割れてカバーし、細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養器に移す。 </li><li>組織培養フードにマイクロチューブボックスを転送し、右側アップシードの挿入をオンにし、レシーバプレートのウェル中にそれらを転送するために鉗子を使用する。各インサートカップにピペット0.450ミリリットルDMEM-10％FBS。ピンセットを用いて、それぞれの準備インサートカップにつの骨組織片（約3 mm）を転送する。必要に応じて、追加のウェルにおけるネガティブコントロールとしてガラスビーズを使用しています。 20時間組織培養インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li>遊走を測定するために、ウェルあたり1mlのDMEM-10％FBSを含有する標準的な24ウェル組織培養プレートを準備する。インキュベーターからレシーバープレートを取り外し、それぞれから骨片とビーズを転送するために鉗子を使用する標準プレートの別々のウェルに挿入します。ルシフェリンを追加基板を各ウェルに（300μgの/ mlの最終濃度を達成するため）、ステップ3.6から3.7までの手順を使用してBLIを行う。 </li></ol></li></ol> 6.追加前後の実験的解析<ol><li>フラッシュされた骨髄の分析。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブの最上部に配置された70μmのセルストレーナーに骨片を転送します。激しくコニカルチューブに骨髄細胞の懸濁液を得るために10mlのPBSで断片をフラッシュするために25 G針を用いた10mlの注射器を使用する。遠心分離機300×gで21℃で3分間、細胞懸濁液を、上清を吸引し、PBSまたはフローサイトメトリーのための他の所望の溶液中で細胞ペレットを再懸濁する。 注：再懸濁体積は遠心分離後の細胞ペレットのサイズは、用途に応じて変化する。 </li><li>生存率アッセイのため〜PBSの75〜300μlの体積は適切であり、これらの懸濁液は、市販fluorescencを用いて分析することができる電子基づく生存率アッセイは、製造業者の指示に従って、従来の血球計数器にピペットで入れ、倒立蛍光顕微鏡を用いて計数した。 </li><li> GFP陽性乳癌細胞の検出に基づいてフローサイトメトリー分析またはソーティングのために、濃度が1×10 6細胞/ mlであることFBS、2mMのEDTA、および10mM HEPES、例えば2％を含有する1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol></li><li> H＆E染色および免疫組織化学。 <ol><li>ヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）染色および/または免疫組織化学のための断片を処理するには、番号2鉛筆で標識されたプラスチック製のカセット内の断片を配置し、24時間、10％緩衝ホルマリンを満たした容器に水没。 </li><li>パラフィン包埋のためのプロセス組織切片、各フラグメント内鉱化骨片を考慮して脱灰工程を含む慣用のプロトコールを用いて染色する。 </li></ol></li></ol>

報告する開示はありません。

Mehra らは以前に、高品質の組織を明らかにし、転移プロセス47を研究するためのヒト骨髄サンプルの使用を検証し、剖検時に採取し、転移性前立腺癌患者の骨片の死後の収集と分析を記載している。ここでは、収集、処理および乳癌細胞移動、コロニー形成及び増殖を研究するための短期共培養系におけるTHR手術後の破棄大腿骨頭から得られたヒト骨組織の断片を使用するためのプロトコルを記載している。約30万股関節置換手術は、米国（米国整形外科学会、Orthoinfo.aaos.org）で毎年行われており、これらの標本は、一般的に破棄されます。この手術のための最も頻繁な適応症の一つは、関節痛を生じる大腿骨頭を覆う軟骨表面の漸進的な破壊につながる、股関節の変形性関節症である。人工股関節全replacem間、ENT手術は、上大腿骨の小部分は、大腿骨頭と一緒に削除されます。大腿骨は、乳癌転移48の一般的な部位であり、そしてこれらの試料は、小柱骨組織、転移性乳癌細胞のコロニー形成の部位を含む。人工股関節置換を受けるほとんどの患者は、ピーク乳がん発生率の年をブラケット年齢範囲50〜80歳です。したがって、こ...

腫瘍微小環境は広く、乳癌の進行および転移拡散1-3中の癌細胞の挙動の重要な決定因子として認識されている。ここに提示された方法の目的は、人間の骨組織、乳癌転移4-6の最も頻繁な部位の微小環境内での乳癌細胞の研究を容易にすることである。骨は、細胞と転移進行10,11に関与する分泌因子を抱くどちらも、鉱化と骨髄コンパートメント7-9で構成されている。広く生体マウスモデルで使用されるが、転移プロセス12-15の全身研究を促進、スケルトン内の細胞の相互作用は観察と直接摂動のために容易にアクセスすることはできません。マウス骨髄組織およびマウス骨髄細胞がより良いアクセスを提供し、クロストークおよび乳癌セルmのメカニズムに関する多くの知見が得られている研究及び培養するためのモデル系ネズミスケルトン16-22のetastasis。しかし、研究は、骨組織23,24のためosteotropismの種特異的なパターンが存在し得ることを示唆している。これらのパターンは、骨の可能性の決定因子である全てが骨組織の特性に固有の種特異的な差異は、免疫欠損マウス11、及び/又は実験に使用したマウスは、比較的若い年齢で変化した骨髄集団から得られた差を反映している可能性が微小環境。 インビトロでは 、典型的には、骨髄由来の骨芽細胞または単層として培養された間質細胞として、または操作された3次元モデル系25〜35内の特定の骨の細胞型に焦点を当ててきたヒト骨共培養において乳癌細胞を研究するために近づく。 2次元の細胞培養モデルは、in vitroでの柱を形成し、がん研究のために近づいているが、それは長い細胞の挙動は基本メートルに変更されることが認識されている培養系18,36,37 onolayer。これは、コラーゲンのような天然材料からなるマトリックス - 足場ベースのモデルを含む3次元の生体組織の複雑性を模倣工学的微小環境が開発された、または合成ポリマーが組織様微小環境を作成するために特定の細胞型を播種36-41。工学的ア ​​プローチも制御し、微小環境18,19,41-43のホルモン環境を研究するためのバイオリアクタープラットフォームの使用が含まれている。バイオミメティックモデル及びバイオリアクターを制御する設定で複雑 ​​な組織微小環境の多くの要素を提供し、成功した骨18,19,35,42,43の乳癌転移の研究を進めるために適用されているが、操作されたモデル系は、一般的に内蔵されていない天然の骨の環境内に存在する細胞型および細胞外マトリックス成分の全スペクトル。 最近まで、乳癌細胞は、ヒト骨組織の天然の、無傷の、3次元微小環境内で検討されていない。我々は最近、（THR）手術が44標本人工股関節全置換から単離されたヒト骨組織フラグメントを用いた共培養モデルの開発を報告した。これらの標本は、短期培養でマイクロ転移のメカニズムを研究するために必要な鉱化と骨髄コンパートメントの両方を抱く。以前の研究では、骨片44（MDA-MB-231-Fluc細胞）とを共培養し、ルシフェラーゼを発現する乳癌細胞の増殖をモニターするために生物発光イメージング（BLI）を使用するための原理の証明を確立した。ここでは、乳癌細胞癌の増殖、コロニー化、及びヒト骨組織外植片を使用して、ネイティブの微小環境のコンテキスト内での移行を研究するための詳細な実験プロトコルを提示する。 まず、乳房を測定するための骨片に隣接する共培養乳癌細胞のためのプロトコルを提示BLIを使用して細胞増殖。このセクションでは、乳房の細胞懸濁液を骨ろう片により固定される骨片に隣接する6ウェルプレート中の細胞スポットとして播種する。対照ウェルは、骨のワックス、ない骨片が含まれている。セルスポットがアタッチすると、培地を添加し、プレートをBLIにより測定される生物発光シグナル強度（細胞数に関連する）、その後24時間、培養されている。次のステップでは、コロニー形成および増殖を研究するために、骨片に直接播種共培養乳癌細胞のための方法を提示する。ここでは、乳房細胞懸濁液をコロニー形成細胞数を追跡するために時間をかけてBLI、蛍光顕微鏡により培養物中に監視された骨組織断片上に直接ピペットで移す。この方法では、骨髄区画は、フローサイトメトリー、または骨髄生存率アッセイによりコロニー形成さ乳癌細胞の解析のために任意の時点での骨片から洗い流すことができる。 さらに、我々はデ乳癌細胞遊走を測定するための2つの異なるアプローチをスクライブ。第一の方法のステップは、骨組織培養上清に向かって移動を測定するために概説されている。このプロトコルでは、乳癌細胞は、内側に播種され、トランスウェルの上面は、（ 図1Aに示されるように）8μmの孔径を有する膜を挿入する。挿入物は、次いで、骨組織上清または対照培地を含有するウェルを有する受け板内に配置される。 20時間のインキュベーション期間にわたって、乳癌細胞の少数がダウンそれらがBLIによる検出に取り付ける下部組織培養ウェルへの挿入膜を通って移動する。第二の移行方法で乳癌細胞をトランスウェルインサート膜の下側、外表面上に播種される。骨組織断片を挿入カップおよび乳癌細胞内に配置される（ 図1Bに示すように）骨片にコロニーを形成するために、膜を通って移行し、これその後、BLIを使用して画像化される。

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>10% ウシ胎児血清と 1% ペン/連鎖球菌</td></tr><tr><td>マッコイズ 5A ミディアム (1X)</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 16600-082</td><td>10% ウシ胎児血清と 1% ペン/連鎖球</td></tr>菌 <tr>ウ<td>シ胎児血清</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ペニシレン ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ブラストシジン (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>トランスフェクション細胞株に使用されるサプリメント培地。</td></tr><tr><td>ファルコン&reg;透明PETメンブレン付き24ウェルプレート用細胞培養インサート(8.0 &mu;Corning</td> <td>Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 24ウェルTC処理ポリスチレン細胞培養インサート コンパニオンプレート</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリンホタル、カリウム塩5g(30mg / ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>セルストレーナー70 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning</td><td>Incorporated 3513</td><td></td></tr><tr><td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>骨ワックス</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 イメージングプラットフォーム</td><td>キャリパーライフサイエンス/パーキンエルマー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リビングイメージソフトウェアプログラム&nbsp;</td><td>キャリパーライフサイエンス/パーキンエルマー</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL イメージングシステム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ バージョン4.2</td><td></td></tr><tr><td>オステオセンス 680 EX</td><td>パーキンエルマー</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 乳がん細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 乳がん細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス 抗ヒトサイトケラチン抗体</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

骨は、乳癌転移の最も一般的な部位である。それは広く微小環境に影響を与える癌細胞の挙動が認められているものの、ほとんどは人間の骨組織の天然の微小環境内での乳癌細胞の特性および動作について知られている。我々は、追跡定量化の微小環境内でのヒト乳癌細胞を調節するためのアプローチを開発した人工股関節全置換手術の後に廃棄された大腿骨頭から単離された培養されたヒト骨組織断片。ルシフェラーゼおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のために操作乳癌細胞を用いて、我々は、再現性生物発光イメージング（BLI）を用いて、遊走および増殖パターンを定量することができ、蛍光顕微鏡を用いて、骨片内のトラックの細胞の相互作用、および後の乳癌細胞を評価するフローサイトメトリーでのコロニー形成。このモデルの主な利点は、1）ネイティブ、アーキテクチャ的に無傷組織のマイクロE関連するヒト細胞型を含み、かつ迅速な定量的および定性的な監視と乳癌および骨細胞の性質、行動や相互作用の摂動を促進する微小環境、2）直接アクセスnvironment。主要な制限は、現在では、短期培養の研究のウィンドウを閉じ込める組織断片、有限の生存能力である。モデルシステムのアプリケーションは、乳癌および転移性のニッチ内の他の骨求め悪性疾患の基礎生物学を研究し、効果的に骨組織中の乳癌細胞を標的とする治療戦略の開発を含む。

大腿ヘッドから組織片を分離大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目人工股関節全置換術を受けた男性と女性患者（年齢の44から90歳）の同数から収集した。各廃棄された大腿骨頭は、鉱化骨片と骨髄から構成される小柱骨組織を保有上部の大腿骨の小部分が含まれています。この組織は、小さな断片を抽出するために、外科骨鉗子を使用して、シャフト（図2A）の外科的に露出断面を通じてアクセス可能です。抽出された片の組織学は、鉱化および骨髄成分を明らかにし、 図2Bに示されている。抽出された部品の外観は、図2Cに示すように、骨髄の脂肪含有量に応じて、黄色から赤色の範囲の異なる患者から得られた大腿骨頭を横切って変化する。 W電子ルシフェラーゼ及びEGFPの発現のために操作乳癌細胞との動的相互作用を測定するために短期的アッセイにおいてこれらの骨組織フラグメントの使用を示す。 生物発光イメージングを使用して、乳房細胞増殖を測定する骨の断...

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

この手順の目的は、ヒト骨組織外植体モデルシステムを用いて、乳がん細胞の増殖、コロニー形成、および遊走を研究することである。これは、大腿骨頭の手術検体から海綿骨組織片を分離し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質を発現する乳がん細胞と共に培養することで達成される。細胞の増殖を測定し、骨組織片における乳がん細胞のコロニー形成を確認するために、生物発光イメージングを用いる。乳がん細胞のコロニー形成パターンを蛍光顕微鏡で観察します。骨髄画分は断片からフラッシュ洗浄し、発光および染色アッセイを用いたフローサイトメトリー解析に供することが可能です。組織培養上清および骨組織断片への乳がん細胞の遊走は、バイオルミネッセンスイメージングを備えたTranswell遊走チャンバーを用いて測定します。骨は乳がんの最も頻繁な転移部位であり、最終的にこのモデルは、骨転移ニッチ内における乳がん細胞を研究するための新たな知見を提供するものとなります。このモデルの大きな利点は、ヒト骨組織断片の微小環境に直接アクセスできることであり、短期間の共培養実験中に乳がん細胞の挙動を容易に観察および解析できることです。この手法は、乳がんの骨転移の根底にあるメカニズムに関する重要な疑問を研究し、効果的に予防および治療するための治療戦略を特定することを目的として活用できます。このモデルは乳がんの転移に関する知見を提供できるだけでなく、前立腺がんなどの他の骨親和性悪性腫瘍の研究にも利用可能です。各アッセイにおいて、骨組織片を様々な部位から採取する必要があります。まず、大腿骨検体を生理食塩水中で回収および輸送し、バイオセーフティーキャビネット内でサージカルグローブを着用してワークステーションを準備します。片手で大腿骨頭を保持し、サージカルローンを用いて海綿骨を抽出します。断片のサイズは約2〜5 mmです。この工程ではピンセットは使用できません。高品質な外科用鋸が必要です。本実験では、DMEMに10%FBSを加えた培地を用いて、50 µLあたり100,000個の細胞を含む乳がん細胞懸濁液を調製します。加えて、マイクロピペットチップの先端を切断したものを用いて、骨片の固定に使用するボーンワックスのプラグを作成し、ペトリ皿に保存しておきます。次に、ピンセットでプラグを6ウェルプレートに移し、滅菌手袋を使用して、プラグを12時の位置に押し込みます。次に、細胞懸濁液 50 µL を各ウェルの中心にピペッティングします。細胞の接着を促進するため、プレートを組織培養インキュベーターに 45 分間置きます。プレートのインキュベーション後、プレートに接着した細胞を含む骨片を抽出します。3 つのウェルのボーンワックス上に骨組織片を配置し、それぞれを GER で押し付けます。骨片を配置しなかった残りの 3 つのウェルをコントロールとして使用します。次に、各ウェルの壁面にDMEM（10%FBS添加）を5 mLずつゆっくりと加えます。この際、ボーンワックスや骨片が脱落しないように注意してください。その後、培養物を20〜24時間インキュベートします。翌日、まず細胞のイメージングを行います。各ウェルに300 µg/mLのルシフェリンを添加し、直ちにIvisイメージングプラットフォームでプレートをイメージングしてください。この実験では、前回と同様に乳がん細胞懸濁液が必要となります。骨片を抽出した後、ピンセットを用いて各骨片を24ウェルプレートの空のウェルに転移させ、次に50 µLの細胞懸濁液を各骨片に直接ピペッティングし、細胞の接着を促進させるためプレートをインキュベーターに45分間入れます。細胞が接着したら、各ウェルに骨片が浸るのに十分な量である1～2 mLの培地を静かに加えます。その後、プレートを組織培養インキュベーターに20～24時間置きます。Ivisイメージング、蛍光イメージング、またはIvisイメージング解析用の骨髄細胞採取の準備として、骨片を24ウェルプレートに移し、1ウェルあたり1 mLの新鮮な培地を加えます。各ウェルに300 µg/mLのLuciferを添加し、前述の蛍光顕微鏡観察の手順に従って操作します。骨片の骨棘を標識するため、蛍光ビスホスホネート標識溶液を各ウェルに5 µLずつピペットで加え、プレートをさらに24時間インキュベートします。24時間後、ピンセットを用いて断片をフェノールレッドフリー培地を含むプレートに移します。次に、485 nmで画像化するように設定した蛍光顕微鏡を用いてプレートを観察し、GFP発現乳がん細胞のコロニー形成部位を特定します。また、680 nmを用いてビスホスホネート標識骨棘を同定します。その後、細胞数や特性を解析するために、骨髄コンパートメントをフラッシュします。フラグメントを、50 mLのコニカルチューブの上に置いた70 µmストレーナーに移します。次に、25Gの針を装着した10 mLシリンジを用い、10 mLのPBSでフラグメントを激しく洗浄（フラッシング）します。この懸濁液を室温で300 ×gで3分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引して廃棄します。フローサイトメトリーまたは生存率アッセイに従い、PBSまたはその他の任意の溶液で骨髄細胞のペレットを懸濁させます。まず、骨組織片を作成します。骨片を12ウェルプレートのウェルに入れます。各ウェルに2.2 millilitersのDMEM 10%FBSを入れたウェルプレートを用意し、骨片を加えないコントロールウェルをいくつか設けます。プレートを24時間培養します。その後、培地を吸引して交換し、さらに24時間培養を続けます。培養開始から48時間後に、上澄みを0.9 milliliters分回収プレートに移し、回収プレートを一時的にインキュベートします。空の24ウェルプレートにトランスウェルインサートを配置します。次に、100,000個の乳がん細胞を350 µLで各インサートに播種します。その後、細胞の接着を促進するために、プレートを45分間培養します。45分後、ピンセットを用いてインサートをレシーバープレートに移行させます。インサートを受容容器に入れる際は、必ず傾けて入れてください。気泡が形成されないよう、十分に回旋させます。その後、インサートを入れたプレートを37 °Cで20時間インキュベートし、翌日に回収します。ピンセットを使用してインサートを取り出し、それぞれに 300 micrograms per milliliter の Lucifer を加えます。レシーバープレートの生物発光イメージングを行い、メンブレンを通過してレシーバープレートのウェルの底に接着した乳がん細胞を検出します。まず、レシーバープレートに培地を満たし、組織培養インキュベーター内に設置します。インサートに細胞を播種します。蓋付きの空のマイクロチューブボックスにインサートを逆さまに配置します。次に、各インサートメンブレンの外側底面に、50 µLで100,000個の細胞を添加します。蓋を少し開けた状態でボックスに蓋をし、組織培養インキュベーターでインサートを45分間インキュベートします。次に、ピンセットを使用してインサートを反転させ、10% FBS含有DMEM 0.45 millilitersを分注したレシーバープレートのウェルに各インサートカップを移します。その後、各インサートに3 mmの骨片またはガラスビーズを加え、プレートを20時間培養します。翌日、ピンセットを用いてフラグメントとビーズを、1 mLの新鮮な培地が入ったウェルプレートに移します。各ウェルに300 µg/mLのLuciferinを添加し、生物発光イメージングを行います。MDA MB 2 31 F.Luke EGFP。乳がん細胞の増殖を測定するため、固定化した骨片に隣接させて乳がん細胞を共培養した。24時間の培養後の生物発光イメージングにより、下段3つのウェル（骨片なし）と比較して、上段3つのウェル（骨片あり）では乳がん細胞の増殖が促進されていることが示された。3つの異なる手術検体由来の骨片を用いた実験結果においても、骨片がない場合と比較して、骨片がある場合に増殖が促進されることが示された。3つのケースすべてにおいて、骨組織片の直下に播種したMCF 7 Luke EGFP細胞の定着が、24時間後の生物発光イメージングで観察されました。48時間後には、播種密度の低下に伴い信号が減弱しました。ビスホスホネート試薬で標識し直接播種した断片では、石灰化領域および骨髄区画内へのGFP陽性乳がん細胞の定着が認められました。多孔性遊走膜を介した骨組織培養上清に向かう乳がん細胞の遊走は、対照群への遊走と比較して、上段の3つのウェルで顕著に認められました。下段の3つのウェルには培地が認められました。また、単一のTHR検体由来の3つの骨片への遊走も観察されましたが、ビーズへの遊走は認められませんでした。このビデオを視聴することで、大腿骨頭検体からヒト骨組織片を抽出する方法と、それらを共培養アッセイに導入して、遊走、コロニー形成、増殖を含む乳がん細胞の挙動を測定する方法について十分に理解することができます。

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