培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

この手順の目的は、ヒト骨組織外植体モデルシステムを用いて、乳がん細胞の増殖、コロニー形成、および遊走を研究することである。これは、大腿骨頭の手術検体から海綿骨組織片を分離し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質を発現する乳がん細胞と共に培養することで達成される。細胞の増殖を測定し、骨組織片における乳がん細胞のコロニー形成を確認するために、生物発光イメージングを用いる。

乳がん細胞のコロニー形成パターンを蛍光顕微鏡で観察します。骨髄画分は断片からフラッシュ洗浄し、発光および染色アッセイを用いたフローサイトメトリー解析に供することが可能です。組織培養上清および骨組織断片への乳がん細胞の遊走は、バイオルミネッセンスイメージングを備えたTranswell遊走チャンバーを用いて測定します。骨は乳がんの最も頻繁な転移部位であり、最終的にこのモデルは、骨転移ニッチ内における乳がん細胞を研究するための新たな知見を提供するものとなります。

このモデルの大きな利点は、ヒト骨組織断片の微小環境に直接アクセスできることであり、短期間の共培養実験中に乳がん細胞の挙動を容易に観察および解析できることです。この手法は、乳がんの骨転移の根底にあるメカニズムに関する重要な疑問を研究し、効果的に予防および治療するための治療戦略を特定することを目的として活用できます。このモデルは乳がんの転移に関する知見を提供できるだけでなく、前立腺がんなどの他の骨親和性悪性腫瘍の研究にも利用可能です。

各アッセイにおいて、骨組織片を様々な部位から採取する必要があります。まず、大腿骨検体を生理食塩水中で回収および輸送し、バイオセーフティーキャビネット内でサージカルグローブを着用してワークステーションを準備します。片手で大腿骨頭を保持し、サージカルローンを用いて海綿骨を抽出します。

断片のサイズは約2〜5 mmです。この工程ではピンセットは使用できません。高品質な外科用鋸が必要です。

本実験では、DMEMに10%FBSを加えた培地を用いて、50 µLあたり100,000個の細胞を含む乳がん細胞懸濁液を調製します。加えて、マイクロピペットチップの先端を切断したものを用いて、骨片の固定に使用するボーンワックスのプラグを作成し、ペトリ皿に保存しておきます。次に、ピンセットでプラグを6ウェルプレートに移し、滅菌手袋を使用して、プラグを12時の位置に押し込みます。

次に、細胞懸濁液 50 µL を各ウェルの中心にピペッティングします。細胞の接着を促進するため、プレートを組織培養インキュベーターに 45 分間置きます。プレートのインキュベーション後、プレートに接着した細胞を含む骨片を抽出します。3 つのウェルのボーンワックス上に骨組織片を配置し、それぞれを GER で押し付けます。骨片を配置しなかった残りの 3 つのウェルをコントロールとして使用します。

次に、各ウェルの壁面にDMEM（10%FBS添加）を5 mLずつゆっくりと加えます。この際、ボーンワックスや骨片が脱落しないように注意してください。その後、培養物を20〜24時間インキュベートします。

翌日、まず細胞のイメージングを行います。各ウェルに300 µg/mLのルシフェリンを添加し、直ちにIvisイメージングプラットフォームでプレートをイメージングしてください。この実験では、前回と同様に乳がん細胞懸濁液が必要となります。

骨片を抽出した後、ピンセットを用いて各骨片を24ウェルプレートの空のウェルに転移させ、次に50 µLの細胞懸濁液を各骨片に直接ピペッティングし、細胞の接着を促進させるためプレートをインキュベーターに45分間入れます。細胞が接着したら、各ウェルに骨片が浸るのに十分な量である1～2 mLの培地を静かに加えます。その後、プレートを組織培養インキュベーターに20～24時間置きます。

Ivisイメージング、蛍光イメージング、またはIvisイメージング解析用の骨髄細胞採取の準備として、骨片を24ウェルプレートに移し、1ウェルあたり1 mLの新鮮な培地を加えます。各ウェルに300 µg/mLのLuciferを添加し、前述の蛍光顕微鏡観察の手順に従って操作します。骨片の骨棘を標識するため、蛍光ビスホスホネート標識溶液を各ウェルに5 µLずつピペットで加え、プレートをさらに24時間インキュベートします。

24時間後、ピンセットを用いて断片をフェノールレッドフリー培地を含むプレートに移します。次に、485 nmで画像化するように設定した蛍光顕微鏡を用いてプレートを観察し、GFP発現乳がん細胞のコロニー形成部位を特定します。また、680 nmを用いてビスホスホネート標識骨棘を同定します。その後、細胞数や特性を解析するために、骨髄コンパートメントをフラッシュします。

フラグメントを、50 mLのコニカルチューブの上に置いた70 µmストレーナーに移します。次に、25Gの針を装着した10 mLシリンジを用い、10 mLのPBSでフラグメントを激しく洗浄（フラッシング）します。この懸濁液を室温で300 ×gで3分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引して廃棄します。

フローサイトメトリーまたは生存率アッセイに従い、PBSまたはその他の任意の溶液で骨髄細胞のペレットを懸濁させます。まず、骨組織片を作成します。骨片を12ウェルプレートのウェルに入れます。

各ウェルに2.2 millilitersのDMEM 10%FBSを入れたウェルプレートを用意し、骨片を加えないコントロールウェルをいくつか設けます。プレートを24時間培養します。その後、培地を吸引して交換し、さらに24時間培養を続けます。培養開始から48時間後に、上澄みを0.9 milliliters分回収プレートに移し、回収プレートを一時的にインキュベートします。

空の24ウェルプレートにトランスウェルインサートを配置します。次に、100,000個の乳がん細胞を350 µLで各インサートに播種します。その後、細胞の接着を促進するために、プレートを45分間培養します。45分後、ピンセットを用いてインサートをレシーバープレートに移行させます。

インサートを受容容器に入れる際は、必ず傾けて入れてください。気泡が形成されないよう、十分に回旋させます。その後、インサートを入れたプレートを37 °Cで20時間インキュベートし、翌日に回収します。

ピンセットを使用してインサートを取り出し、それぞれに 300 micrograms per milliliter の Lucifer を加えます。レシーバープレートの生物発光イメージングを行い、メンブレンを通過してレシーバープレートのウェルの底に接着した乳がん細胞を検出します。まず、レシーバープレートに培地を満たし、組織培養インキュベーター内に設置します。

インサートに細胞を播種します。蓋付きの空のマイクロチューブボックスにインサートを逆さまに配置します。次に、各インサートメンブレンの外側底面に、50 µLで100,000個の細胞を添加します。

蓋を少し開けた状態でボックスに蓋をし、組織培養インキュベーターでインサートを45分間インキュベートします。次に、ピンセットを使用してインサートを反転させ、10% FBS含有DMEM 0.45 millilitersを分注したレシーバープレートのウェルに各インサートカップを移します。その後、各インサートに3 mmの骨片またはガラスビーズを加え、プレートを20時間培養します。

翌日、ピンセットを用いてフラグメントとビーズを、1 mLの新鮮な培地が入ったウェルプレートに移します。各ウェルに300 µg/mLのLuciferinを添加し、生物発光イメージングを行います。MDA MB 2 31 F.Luke EGFP。

乳がん細胞の増殖を測定するため、固定化した骨片に隣接させて乳がん細胞を共培養した。24時間の培養後の生物発光イメージングにより、下段3つのウェル（骨片なし）と比較して、上段3つのウェル（骨片あり）では乳がん細胞の増殖が促進されていることが示された。3つの異なる手術検体由来の骨片を用いた実験結果においても、骨片がない場合と比較して、骨片がある場合に増殖が促進されることが示された。

3つのケースすべてにおいて、骨組織片の直下に播種したMCF 7 Luke EGFP細胞の定着が、24時間後の生物発光イメージングで観察されました。48時間後には、播種密度の低下に伴い信号が減弱しました。ビスホスホネート試薬で標識し直接播種した断片では、石灰化領域および骨髄区画内へのGFP陽性乳がん細胞の定着が認められました。

多孔性遊走膜を介した骨組織培養上清に向かう乳がん細胞の遊走は、対照群への遊走と比較して、上段の3つのウェルで顕著に認められました。下段の3つのウェルには培地が認められました。また、単一のTHR検体由来の3つの骨片への遊走も観察されましたが、ビーズへの遊走は認められませんでした。

このビデオを視聴することで、大腿骨頭検体からヒト骨組織片を抽出する方法と、それらを共培養アッセイに導入して、遊走、コロニー形成、増殖を含む乳がん細胞の挙動を測定する方法について十分に理解することができます。