培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。

この手順の目標は、ヒト骨組織explanモデルシステムにおける乳がん細胞の増殖、コロニー形成、および移動を研究することです。これは、大腿骨頭外科標本から海綿骨組織片を分離し、ルシフェラーゼを発現する乳がん細胞と緑色蛍光タンパク質で培養することによって達成されます。生物発光イメージングは、細胞の増殖を測定し、骨組織断片中の乳がん細胞のコロニー形成を確認するために使用されます。

乳がん細胞のコロニー形成のパターンは、蛍光顕微鏡法によって画像化されます。骨髄コンパートメントは、発光および染色アッセイによるフローサイトメトリーによる分析のために、フラグメントから洗い流すことができます。組織培養、上清、骨組織片への乳がん細胞の移動は、生物発光イメージングを備えたトランズウェル遊走室で測定されます 骨は乳がん転移の最も頻繁な部位であり、最終的にこのモデルは、骨転移ニッチ内の乳がん細胞を研究するための新しい窓を提供します。

このモデルの大きな利点は、ヒトの骨組織断片の微小環境に直接アクセスできるため、短期間の共培養実験中に乳がん細胞の挙動を簡単に観察および分析できることです。この方法は、乳がんの根底にあるメカニズム、骨への転移に関する重要な問題を研究するために使用でき、その作用を効果的に予防および治療するための治療戦略を特定することを目的としています。このモデルは乳がんの転移に関する洞察を提供しますが、前立腺がんなどの他の骨探索悪性腫瘍の研究にも使用できます。

骨組織片は、各アッセイのさまざまなポイントで採取する必要があります。これは、生理食塩水で大腿骨標本を採取して輸送し、手術用手袋を着用したバイオセーフティキャビネットでワークステーションを準備することから始まります。片手で大腿骨の頭をつかみ、外科用生を使用して海綿骨を取り出します。

断片の大きさは約2〜5ミリメートルを示しています。このステップでは、鉗子は機能しません。あなたは良質の外科的生が必要です。

この実験では、DMEMの50マイクロリットルあたり100,000個の細胞と10%FBSを含む乳癌細胞懸濁液を調製します。さらに、マイクロピペットチップのカットオフ端を使用して骨片を動員するための骨ワックスのプラグを準備し、プラグをペトリ皿に保管します。次に、鉗子を使用して、プラグを6ウェルプレートに移し、滅菌手袋を使用して、プラグを12時の位置に押し込みます。

次に、細胞懸濁液の50マイクロリットルをそれぞれの中心にピペットで移します。プレートを組織培養インキュベーターに45分間よく置き、細胞の接着を促進しますが、プレートはプレートに付着した細胞で骨片を抽出します。骨組織片を3つのウェル内の骨ワックスに置き、GERの3つのウェルなしのフラグメントサーバーコントロールを使用してそれぞれを押し下げます。

次に、5ミリリットルのDMEMと10%FBSを各ウェルの壁にゆっくりと加えます。骨のワックスと骨片は外れてはなりません。その後、培養物を20〜24時間インキュベートします。

翌日、最初にセルをイメージ化します。各ウェルに1ミリリットルあたり300マイクログラムのLuciferを添加し、すぐにIvisイメージングプラットフォームでプレートをイメージングします。この実験には、前の実験と同様に乳がん細胞懸濁液が必要です。

骨片を抽出した後、鉗子を使用して各断片を24ウェルプレートの空のウェルに移し、次に50マイクロリットルの細胞懸濁液を各骨片に直接ピペットで移し、プレートをインキュベーターに45分間移して細胞の接着を促進します。細胞が付着したら、骨片を沈めるのに十分な量の培地を各ウェルに1〜2ミリリットルずつ加えます。次に、プレートを組織培養インキュベーターに20〜24時間置きます。

Ivisイメージング、蛍光イメージング、またはIvisイメージングのための分析のための骨髄細胞の採取の準備として、骨片をウェルあたり1ミリリットルの新鮮な培地を入れた24ウェルプレートに移します。各ウェルに1ミリリットルあたり300マイクログラムのLuciferを添加し、蛍光顕微鏡法について前述したように進めます。5マイクロリットルの蛍光ビスリン酸標識溶液を各ウェルにピペットで注入して、骨片の骨棘を標識し、プレートをさらに24時間インキュベートします。

24時間後、鉗子を使用してフラグメントをフェノールレッドフリー培地を含むプレートに移します。次に、乳がん細胞を発現するGFPと680ナノメートルをコロニー化するために485ナノメートルでイメージングするように構成された蛍光顕微鏡を使用してプレートを観察します。二リン酸標識骨棘体を同定し、細胞数または特性の分析のために骨髄コンパートメントを洗い流す

断片を50ミリリットルのクロニクルチューブチューブを介して70ミクロンのストレーナーに移します。次に、25ゲージの針が付いた10ミリリットルの注射器を使用して、10ミリリットルのPBS遠心分離機でフラグメントを激しく洗い流します。懸濁液を室温で300Gで3分間ペレット化し、細胞を吸引し、supinate reusを廃棄します。

PBSまたはフローサイトメトリーまたは生存率アッセイごとに他の目的の溶液で骨髄細胞のペレットを曲げます。まず、骨組織スネットを生成します。骨片を12のウェルに入れます。

ウェルプレートには、ウェルあたり2.2ミリリットルのDMEM 10%FBSが含まれており、骨片のない一部のコントロールウェルを残します。プレートを24時間培養します。次いで、培地を吸引して交換し、さらに24時間、48時間培養中に0.9ミリリットルのスーピネートをレシーバープレートに移し、レシーバープレートを一時的にインキュベートしながら培養を続ける。

トランズウェルインサートを空の24ウェルプレートに入れます。次に、iPet 100, 000個の乳がん細胞を350マイクロリットルで各インサートに注入します。その後、プレートを45分間培養して細胞の付着を促進します45分後、鉗子を使用してインサートをレシーバープレートに移します。

インサートをレシーバーに入れるときは、必ず角度をつけてください。泡が形成されないようによくsupinate。次に、翌日、プレートをインサートで摂氏37度で20時間インキュベートします。

鉗子を使用してインサートを取り外し、それぞれにミリリットルあたり300マイクログラムのルシファーを追加します。レシーバープレート上で生物発光イメージングを行い、メンブレンを通過してレシーバープレートウェルの底に付着した乳がん細胞を検出します。まず、レシーバープレートに培地をロードし、組織培養インキュベーターに入れます。

インサートをシードします。蓋付きの空のマイクロヒューズチューブボックスでそれらを反転させます。次に、50マイクロリットルの100, 000個の細胞を各インサートメンブレンの外底面に追加します。

蓋にひびが入ったまま箱に蓋をし、インサートを組織培養インキュベーターで45分間インキュベートします。次に、鉗子を使用してインサートを反転させ、レシーバープレートのウェルを10%FBSのDMEMの0.45ミリリットルで各インサートカップに移します。次に、各インサートに3mmの骨片またはガラスビーズを追加し、プレートに20時間カットします。

翌日、鉗子を使用して、破片とビーズをミリリットルの新鮮な培地が入ったウェルのあるプレートに移します。1ウェルあたり1ミリリットルあたり300マイクログラムのLuciferを添加し、生物発光イメージングを進めます。MDA MB 2 31 F.ルークEGFP。

乳がん細胞を固定化骨片に隣接して共培養し、乳房細胞の増殖を測定しました。培養24時間後の生物発光イメージングでは、上の3つのウェルに骨片が存在する場合、下の3つのウェルに骨片がない場合と比較して、乳がん細胞の増殖が促進されることが示されました。3つの別々の手術標本の断片を用いた実験の結果は、骨の存在下と非存在下での増殖の増加を示しました。

3例すべてにおいて、骨組織片の真下に座っているMCF seven F Luke EGFP細胞のコロニー形成が、24時間後の生物発光イメージングで観察されました。シグナルの減少は、48時間後の播種密度の低下と関連していました。ビスフォスフォネート試薬で標識した直接播種フラグメントにより、石灰化および骨髄コンパートメント内のGFP陽性乳がん細胞のコロニー形成が明らかになりました。

多孔質移動膜を横切って骨組織培養に向かう乳がん細胞の移動、上の3つのウェルで見られた上清は、コントロールへの移動と比較して堅牢でした。下部の3つの井戸に見られる中程度。また、特定のTHR標本から3つの骨片への移動も観察されましたが、ビーズへの移動は観察されませんでした。

このビデオを見れば、大腿骨頭部標本からヒト骨組織断片を抽出し、それらを共培養アッセイに開始して、移動、コロニー形成、増殖などの乳がん細胞の挙動を測定する方法について十分に理解できるはずです。