Name: ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼虫の電位図解析法。ガラスマイクロ電極を用いて角膜に電極を配置し、視覚機能を生体内で評価する神経生理学的手法です。視覚科学の研究に応用可能です。

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私たちは、ゼブラフィッシュの維持管理のためにUNCゼブラフィッシュ養殖施設のメンバーに感謝します。また、ERG装置のセットアップを支援してくださったDiagnosys, LLCにも感謝いたします。さらに、電気生理学的方法の支援を提供してくださったPortia McCoy博士とBen Philpot博士の研究室にも感謝します。また、ゼブラフィッシュの幼虫のイラストをくださったリジー・グリフィスさんにも感謝いたします。この研究は、国立衛生研究所のF32 EY022279(JDCに)およびR21 EY019758(E.R.Wに)の支援を受けました。

動物の維持費と実験的なプロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の制度動物管理使用委員会によって承認され、実験動物福祉のNIH事務所との評価と実験動物管理国際認定協会のすべての要件を満たしていた。 注：標準のゼブラフィッシュの飼育および維持のためのERG分析用の幼虫を入手するには、公開されたプロトコルが18を採用した。幼虫は、自然繁殖を介して取得し、14時間の明/ 10時間暗サイクルの下に収納されている。このプロトコルは、5-7日後に受精（DPF）で幼虫のために最適化されているが、理想的に手続きに小さな変更を加えて、古い魚を行うことができた。ここでは、5 DPFで、野生型ゼブラフィッシュ幼生のTL株を使用しています。 1.マイクロピペットプロダクション<ol><li> 1.5×0.86ミリメートル（内径によって外径）と火災研磨ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して複数のマイクロピペットを引き出しますフィラメント（温度、821°Cの融点）及びP-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーボックス熱フィラメントを装備。 表1に記載のマイクロピペットを形作るためのプログラムを使用してください。 </li><li>先端の直径が10〜15ミクロンであり、円滑な先端開口（ すなわち、ギザギザのエッジ）を持っていることを確認するために、適切な目盛の定規で顕微鏡下で各マイクロピペットを確認してください。 </li><li>先端の損傷や埃への暴露を防止するために、マイクロピペットを慎重に格納します。ストレージオプションは、ラボテープ、フォーム内張りの箱、または市販のマイクロピペット貯蔵容器とのペトリ皿が含まれています。 注：他のマイクロピペットプラーとガラスキャピラリーは、正しいマイクロピペットの直径と高品質の先端が達成される限り長く使用することができる。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 圧力 </td><td> ヒート </td><td> 引く </td><td> 速度 </tD&gt; <td> 時間 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> 表1：ボックスの熱フィラメントを装備P-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーを使用して、マイクロピペットを製造するためのプログラムのマイクロピペットは、フィラメントを有する熱加工ホウケイ酸ガラスキャピラリーを1.5×1.0ミリメートル2（内径によって外径）を使用して行われる。 （融解温度は、821°C）。 2.バッファの準備<ol><li>微小電極のキャピラリーでろ過し、酸素金魚リンゲルバッファ19を使用して、幼虫が実験のために置かれ、その上にポリビニルアルコール（PVA）スポンジを飽和させる。また、E3を使用<html>胚メディアまたはハンクス液。 </li><li>表2に記載したようにpHを7.8に調整し、0.22μmのフィルターを用いて滅菌し、4℃で10倍株式を保管10倍金魚リンゲル液を準備します。 </li><li>脱イオン、蒸留水で1倍する10倍のリンゲル液を希釈することによって、実験の日に作業溶液を作成します。 0.22μmのフィルターシステムを使用してフィルタリングします。 10分間、95％O 2/5％CO 2ガスでバブリングすることによって酸素化物。キャップはしっかりとその後ソリューションが含酸素のままであることを確認します。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaClを</td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 26 mMの</td></tr><tr><td>のCaCl 2 </td><td> 25 mMの</td></tr><tr><td>のMgCl 2 </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 100 mMの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mMの</td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; 表2：10倍金魚のリンゲル液の調製。 3.電図プラットフォーム<ol><li>信号対雑音比を改善するためにファラデーケージ内部の除振台上のERG実験を行う。六角ナットを使用して、防振テーブルにカスタムスチールプラットフォームを取り付けます。光源下でテーブルの上に粘弾性ウレタンポリマーの衝撃吸収底の可動プラスチックプラットフォームを置きます。 </li><li>可動プラスチックプラットフォームでダウンを目的とした、磁化スタンド付きカメラを、配置します。可動プラスチックプラットフォームの右側にある2番目の磁化されたスタンド付（記録微小電極を保持する）マイク​​ロマニピュレーターを配置します。カメラとマイクロマニピュレーターが他の機器の動きによって妨害されないことを、彼らは、光源からの照明をブロックしないことを確認してください。 </li><li>ビデオモニターにカメラを接続し、の目を見ることそれを配置適切な位置に電極を配置するための幼虫。 </li><li>セットアップが正常に銅線で接地されていることを確認してください。ノイズを確認するには、リンゲル液で満たされた35ミリメートルペトリ皿に記録微小電極の参照電極チップを配置します。オシロスコープまたはERG装置の内蔵の機能でセットアップの電気的なノイズレベルを確認してください。ノイズレベルは、ベースラインからせいぜい±10μVでなければなりません。 </li></ol> 4.スポンジ準備<ol><li> 35ミリメートルペトリ皿にぴったりとフィットしますドライPVAスポンジの小さな長方形をカット。スポンジの厚さは、皿の深さよりも大きくするべきではありません。切断のためのきれいなカミソリの刃でカッターナイフを使用してください。 </li><li>参照電極（スポンジの底部または小さい方の端部の一方を垂直にカット蝶上の長さ方向の浅いカットのいずれか）に対応するためにスポンジに追加のカットを行います。 </li><li>化学的に耐性マーカーを使用してくださいカメラを位置決めするために使用することができるスポンジ（幼虫が配置される場所）に小さなドットをマークする。 </li><li>飽和するまでリンゲル液中のPVAスポンジを浸す。 2-3回を削除し、ペーパータオル上ですぐにブロット。きれいな35ミリメートルペトリ皿にスポンジを置きます。 </li><li>マークがカメラによって視覚化することができるようにプラスチック製のプラットフォーム上にスポンジを含むペトリ皿を置きます。 </li></ol> 5.電極の準備 NOTE：ゼブラフィッシュセットアップはリンガー溶液、飽和PVAスポンジと角膜と接触して記録電極と接触する基準電極から成る。参照電極は銀/塩化銀ペレットで構成されている。記録電極は、プルガラスマイクロピペットリンゲル液を充填し、Ag線を含む微小電極ホルダに保持されている。 <ol><li> 5分（記録MICR 6-9％の次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）でそれらを浸漬することによって電極を塩化物oelectrode線）または15分（参照電極）。 5分間キムワイプ上の空気乾燥。 <ol><li>ステップ4.2で行われたカットのスタイルに応じて、スポンジ（底部の長さ方向の浅いカット用）（垂直蝶カットの場合）または下に参照電極の銀/塩化銀ペレットを配置。記録システムに基準電極リードを取り付けます。 </li><li> ERGセットアップはスペースの制約があり、またはAg / AgCl電極から特に強い太陽光発電アーティファクトが存在する場合に代替的に、光路の外に電極を移動させるために、寒天、塩橋を介してスポンジを参照電極に接続する。 </li></ol></li><li> 5ミリリットル非ルアーロックシリンジに適切なサイズのチューブの約40センチ取り付けます。リンゲル液で注射器を埋める。圧力ポートを有する微小電極ホルダーは、通常、「3/32」を1/16の内径とチューブを収容するためのアダプターで1/8 &quot;または5/32」を出荷する。 </li><li>で1ml非ルアーロックシリンジに充填リンゲル液および、マイクロフィルを用いて、慎重に微小電極ホルダーを埋める。気泡の形成を防ぐ。 </li><li>チューブを微小電極ホルダーの圧力ポートに5ミリリットルの注射器を取り付け、微小電極ホルダーはリンゲル液の完全であることを確実にするためにそれを使用。マイクロFILとリンゲル液で満たされた1-mlの注射器を使用して、先端からマイクロピペットガラスを記入し、気泡が存在しないことを確認してください。 </li><li>電極線をまっすぐに保つように注意して、微小電極ホルダーにガラスマイクロピペットを取り付けます。いったん確保し、ソリューションの小さな量は先端に表示されるまで慎重に微小電極を通じてリンゲル液を強制的に5ミリリットル注射器を使用しています。マイクロピペットチップで、塵や塩類集積による気泡、ならびに閉塞の形成を防止する（角膜に適用されていない）注射器に圧力を時折アプリケーション。 <ol><li>ソリューションはストリームとして出てくる場合は、Gを交換小娘マイクロピペット、先端開口が大きすぎる、または破損しているよう。 </li></ol></li><li>慎重にマイクロマニピュレータにおける記録微小電極を配置し、記録システムのリードを取り付ける。 </li></ol> 6.電図解析注：記録の準備が間接白色光の低レベルの下で実行されるときにより幼虫の網膜の錐優勢に、高品質のERG結果を得ることができる（&lt;1ルクス）または短い周期を有する（&lt;1分）より高い強度の（ ≤250ルクス）作業灯。暗順応の短い期間がまだ記録の前に必要とされる（ステップ6.7参照）。しかし、実験は、赤外線感応カメラを使用して暗赤色または赤外光で行うことができる。全ての実験は、UNCゼブラ水産養殖施設から濾過滅菌（0.22μmの）システム水中で実施したが、代替胚培地を使用することができる。 <ol><li>約1を測定するカット紙タオルの正方形cm 2である 。 </li><li>単離された円錐質量受容器電位を測定する場合は、5分間500μM（±）-2-アミノ-4-ホスホノ酢酸（APB）を使用してシステムの水に3-5幼虫をインキュベートする。 NOTE：APBがアクティブ（L）のラセミ混合物とAP4の不活性な（R）形態であるが、L-AP4と同様に有効であり、安価である。 </li><li>応答しない、約1〜2分まで、0.02％とトリカイン（w / v）のシステム水に3-5の幼虫を麻酔。 </li><li>慎重に最小限の照明（&lt;1分間≤250ルクス）を使用して、解剖ステレオスコープの下にペーパータオルの正方形の上に個々の幼虫を転送するためにパスツールピペットとピペットポンプを使用してください。各幼虫の位置を確認し、遮蔽されていない目で、背側を上にある候補者を選択します。 <ol><li>拡張された録音（&gt; 30分）、に身体を窓ガラスが、細かいラクダ毛のブラシを使用して、3％メチルセルロースで頭を含めないことによって湿った幼虫を保つ。 </li></ol></li><li>鉗子を使用して、ペーパータオルsquarを転送する湿ったPVAスポンジに幼虫とE。 <ol><li>長時間録画（&gt; 30分）、蒸留水を含有するサイドアームフラスコ中AIRSTONEを通してガスをバブリングすることにより幼虫にわたって水飽和、100％O 2ガスの連続流を適用する。幼虫の頭の近くに加湿酸素を運ぶフラスコサイドアームを出て、チューブを置きます。 注：ステップ6.4.1とステップ6.5.1は、魚16の寿命を延ばすます。 </li></ol></li><li>最小限の照明の下で、鼻および眼の尾側端部の間の中間点での微小電極の先端を位置決めするためにマイクロマニピュレータとカメラを使用して、角膜の背側限界に押し穏やか。 注：角膜の遠い遠位領域への電極先端の誤配置が逆極性のERG波形になることができます。 </li><li> 5〜10分間暗適応させるために幼虫を許可する。 </li><li>のAvaIを用いたLED光源や光学刺激装置から提供される光にレコードのテストフラッシュ応答可能な標識刺激と記録装置。実験に合わせて、フラッシュの強度、フラッシュの長さ、フラッシュカラー、背景輝度や色などのプロトコルパラメータ及びフィルタ設定を調整する。 </li><li>実験が終了したら、AVMA / IACUCガイドラインに従って幼虫を安楽死させる。 </li></ol>

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</ol>

利害の衝突が宣言されていない。

このプロトコルでは、幼虫のゼブラフィッシュのERG記録のための簡単​​な手順が詳しく説明されている。この手順は、心に留めておくべきである手順を通じて、いくつかの重要なステップである視覚的function.Thereを迅速かつ総合的な分析を可能にします。ゼブラフィッシュの幼虫は、潜在的な薬物治療の間、死を防止し、ERG記録中に長期の生活を確保するために、実験の前に健康でなければなりません。また、実験に利用幼虫は密接に年齢をマッチさせたことが重要である。これは、網膜（ すなわち 、コーンサブタイプの差動開発）とも幼虫の全体的な形態と生理学の急速な発展によるものです。例えば、上皮蒸散効率のdpf 7後より困難生きている魚を維持すること減少する。もう一つの重要な要因は、記録電極と基準電極の品質である。ラフなエッジトンを防ぐために、ガラスキャピラリーを引っ張ったときには注意が必要IPS。マイクロフォージは火ポリッシュするために利用することができるマイクロピペットは、電極を引っ張られ、信号取得を改善するのに役立つ。さらに、銀/塩化銀電極の品質を維持することが非常に重要である。使用後は、彼らはすぐに乾燥させ、蒸留水と空気でリンスする...

電図（ERG）は、ヒトにおける網膜の機能を決定するための臨床で広く用いられている非侵襲的電気生理学的方法である。光刺激に応答した電気的活動は、角膜の外面に記録電極を配置することによって測定される。刺激パラダイムと応答波形の特性が応答に貢献する網膜神経細胞を定義する。この方法は、マウスおよびゼブラフィッシュを含む多くの動物モデルの使用に適合されている。典型的な脊椎動物ERG応答は、4つの主要コンポーネントがあります。光受容体細胞の活性に由来し、角膜陰性電位であるA波を、。 b波、ON双極細胞由来の角膜陽性の可能性。 d波、OFF双極細胞の活性と解釈角膜陽性の可能性。とb波の後に数秒を発生し、C波は、ミュラーグリアとRETの活動を反映しているノミナル色素上皮1-4。ヒトとモデル動物で歴史とERG分析の原理を理解するための追加の参照は、ユタ大学とそのようなビジョン4、5の臨床電気生理学の原則と実践などのテキストから、オンライン教科書、Webvisionです。 ゼブラのフィッシュ（ゼブラフィッシュ）は、長いによる臓器系の非侵襲的な形態学的分析を可能にし、その急速な成熟と透明性、に、脊椎動物の発生のモデルとして好まれた行動アッセイおよび順方向および遺伝子スクリーニングを逆転されている（レビューのために、Fadoolを参照してくださいダウリング6）。ゼブラフィッシュの幼虫は、その高い繁殖力と組み合わせると、それらのハイスループット生物学的分析のための優れた動物モデルにする遺伝的および薬理学的操作、に非常に適している。幼虫のゼブラフィッシュでロッドに錐体の比率が高い - およそ1：マウスと比較して1（〜3％のコーンS） -コーン機能7-9の研究のために特に有用なものにする。 脊椎動物の網膜では、コーンは、ロッド10の前に開発する。興味深いことに、ゼブラフィッシュコーンは、そのステージ6、11、12でコーンの選択的な電気生理学的解析を可能にし、早ければ4 DPFとして動作可能である。対照的に、ロッドにおけるERG応答は、11と13のdpf 21との間に現れる。したがって、4-7でのゼブラフィッシュの幼虫は、DPFすべてのコーン網膜として機能を発揮する。しかし、4-7 DPFの幼虫のネイティブ明所視ERG応答は、b波によって支配されている。 （+） - - などLなどの薬理学的薬剤の適用2-アミノ-4-ホスホノ酪酸（L-AP4）、ON双極細胞によって発現される代謝調節型グルタミン酸（mGluR6）受容体アゴニスト、効果的にブロック生成b波および孤立コーン質量受容器電位（「波」）14-17を明らかにする。 ここでは、シンプルでreliablを記述するゼブラフィッシュの幼生との使用に適合されたマウスを使用するために設計された市販のERG装置を用いてERG分析のための電子方法。このシステムは、視覚感度及び明順応16に寄与するシグナル伝達経路の同定を研究者を助けるために、遺伝的背景を変化させること、ならびに薬理学的薬剤で処理されたものなどのゼブラフィッシュの幼生に利用することができる。このプロトコルで概説実験手順はビジョンに係る生体さまざまな質問に答えるためのERG分析の使用に研究者を導く、そして柔軟なERGセットアップの建設のデモンストレーションを行います。

<table><tbody><tr><td>ファラデーケージ</td><td>80/20 Inc</td><td>カスタム</td><td>デザインアルミニウム「工業用エレクターセット」 ケージフレームワーク</td></tr><tr><td>用 PVAスポンジ</td><td>アマゾン</td><td>B000ZOWG1C</td><td>ゼブラフィッシュの幼虫を配置するための柔らかく湿ったプラットフォームを提供します</td></tr><tr><td>150 ml 滅菌フィルターシステム</td><td>コーニング</td><td>431154</td><td>小さな関節がマイクロピペットをブロックするのを防ぐためのろ過ソリューション</td></tr><tr><td>エスピオンE2</td><td>Diagnosys、LLC</td><td>の連絡先</td><td>任意の刺激装置のための視覚刺激を生成することができ、独自のソフトウェアを使用して応答のデジタル記録と分析を行うことができるモジュラー電気生理学システム、http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys、LLC</td><td>の連絡先</td><td>RGB LEDとGanzfeld ERGのキセノン光源を備えた光刺激装置、http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータの詳細</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>記録用微小電極の保持と位置決め</td></tr><tr><td>磁気リングスタンド</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>カメラと参照電極の保持と位置決め</td></tr><tr><td>リードエクステンション</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>電極接続用スペアメス-オス 1.5 mm リードケーブル</td></tr><tr><td>オスピン - メス SAFELEAD</td><td>Adaptor Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>2mmピンと1.5ヘッドボードピンの接続</td></tr><tr><td>ウィンドウスクリーンフレーム(金属製)とスプライン</td><td>ロウズまたはホームデポ</td><td>各種</td><td>ファラデーケージフレームワークへの銅メッシュの取り付け用</td></tr><tr><td>ステリフリップ50mlフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SCGP00525</td><td>小さな関節がマイクロピペットを塞ぐのを防ぐフィルタリングソリューション</td></tr><tr><td>BNCアダプター</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>カメラとBNCケーブルの接続</td></tr><tr><td>BNCケーブル</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>カメラをビデオアダプターに接続する</td></tr><tr><td>カメラレンズ</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>幼虫の角膜への記録微小電極の位置を視覚化</td></tr><tr><td>カメラカプラー</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>幼虫の角膜への記録微小電極の位置を視覚化</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMIコンバーター</td><td>シーウェル</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC to VGAアダプター カメラ画像をコンピューターモニターに投影可能</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6アゴニスト、b波をブロックし、単離されたコーン質量受容体電位の分析を可能にする</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>ファイヤーポリッシュホウケイ酸ガラス (metling temperature = 821&deg;C)フィラメントで寸法が1.5mm x 0.86mm(外径×内径)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 フレーミング/ブラウンプーラー</td><td>サッター</td><td>P97</td><td>ガラスマイクロピペットを引っ張るため</td></tr><tr><td>ソルボスタンシート</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>合成粘弾性ウレタンポリマーは、衝撃を吸収し、滑りを防ぐためにパッシブアイソレーションマウントとERGプラットフォームの下に置かれ、サイズにカットすることができます</td></tr><tr><td>ブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>ERG刺激装置とゼブラフィッシュ試料</td></tr><tr><td>用の防振プラットパッシブアイソレーションマウント</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>ブレッドボードに防振を提供</td></tr><tr><td>銅メッシュ</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>ファラデーケージ</td></tr><tr><td>ピペットポンプ</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>パスツールピペットと一緒に使用してゼブラフィッシュの幼虫を慎重に移すために</td></tr>パス<tr><td>ツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>ゼブラフィッシュの幼生を慎重に移すためにピペットポンプと一緒に使用</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>ワテック</td><td>WAT-902B</td><td>幼虫角膜への記録微小電極の位置を可視化</td></tr><tr><td>トリカイン (MS-222)</td><td>ウエスタンケミカル</td><td>トリカイン-S</td><td>医薬品グレード麻酔薬、</td></tr><tr><td>マイクロフィル</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>充填用微小電極ホルダー・微小電極</td></tr><tr><td>ガラス マイクロ電極ホルダー</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>ガラス微小電極を保持し、ERG機器に接続します</td></tr><tr><td>参照電極</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>電解液を排出し、焼結したAg/AgClペレット電極を露出させるために、ケーシングの最後のセンチメートルを慎重に切り離</td></tr>します <tr><td>参照電極(代替)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>DRIREF-5SHの代替品。接続リード線に配線/はんだ付けが必要なAg/AgCl電極</td></tr><tr>マイクロ<td>電極ホルダー用低ノイズケーブル</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>アダプター/ヘッドボードへの記録用マイクロ電極ホルダーの接続</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

電図（ERG）は、網膜機能を決定するための非侵襲的な電気生理学的手法である。角膜の表面上の電極の配置を介して、光に応答して生成された電気的活動を測定し、 インビボでの網膜細胞の活性を評価するために使用することができる。この原稿は、ゼブラフィッシュで視覚機能を測定するためのERGの使用が記載されている。ゼブラフィッシュは、長いによるモルホリノオリゴヌクレオチド、および薬理学的操作による遺伝子抑制を容易に脊椎動物の開発のためのモデルとして利用されてきた。 5-10 DPFでは、唯一のコーンは、幼虫の網膜で機能的である。したがって、ゼブラフィッシュは、他の動物とは異なり、 インビボでの錐視覚機能の研究に有用なモデル系である。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの研究を行う研究室で一般的な標準麻酔、マイクロマニピュレーションと実体顕微鏡のプロトコルを使用しています。概説された方法は、標準的な電気生理学EQを利用する幼虫の角膜に記録微小電極の配置をガイドするuipmentと低光カメラ。最後に、本来のマウス用に設計市販のERG刺激/記録を容易にゼブラフィッシュでの使用に適合させることができる方法を示す。幼生ゼブラフィッシュのERGは、モルホリノオリゴヌクレオチドの注入により修飾された動物において、円錐視覚機能をアッセイするのに優れた方法ならびにそのようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNが）などの新しいゲノム工学技術を提供し、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、及びInterspacedショート回文反復（CRISPR）/ Cas9、大幅にゼブラフィッシュで遺伝子ターゲッティングの効率性と有効性を増加しているそのすべてが定期的にクラスタ化された。さらに、我々は光応答に寄与する分子成分を評価するためにゼブラフィッシュの幼虫を貫通する薬理学的薬剤の能力を利用する。このプロトコルは、研究者によって変更して使用することができるセットアップを概説様々な実験目標に。

多くの研究がこのステージ9、16,20でERG記録を掲載しておりますので、一般的に、ERGをは、5 DPFでゼブラフィッシュ幼生から記録されている。幼虫の応答は、白色LEDの光の20ミリ秒の刺激を使用しない背景照明と暗順応条件下で測定した。私たちは、全体野の光刺激とコンピュータ·コントローラ/レコーダーからなる市販のERGシステムを利用した。刺激装置は、背景とフラッシュ刺激の両方の輝度を制御するために厳密に制御された独自のパルス幅変調（PWM）方式を使用する。応答は、デジタル変換器（ADC）16ビットアナログ駆動ハードウェアアンチエイリアシングフィルタに独自の完全差動増幅器を用いて記録した。刺激と反応の記録は、製造業者のプロトコルに従って、機器に付属の専用ソフトウェアにより制御した。我々の機器は、1kHzのサンプリングレートを使用するようにプログラムされた、デジタルベッセルCASCADEのフィルタは、過剰なノイズを除去するために0.312 Hzから300 Hzの、および60Hzのノッチフィルタとの間の帯域に設定する。暗順応幼虫における光強度の増加に伴う振幅のb波が増加する（ 図1）。</strong...

私たちは、マイクロマニピュレーションと網膜電図技術を利用したゼブラフィッシュの幼生の網膜電図(ERG)分析の方法を提示します。これは、ゼブラフィッシュの幼生の視覚機能をin vivoでアッセイするためのシンプルでわかりやすい方法です。

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

本手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュの幼魚に対して電気生理学的解析を行うために必要な手順を説明することです。まず、適切に形状とサイズを調整したガラスマイクロピペットを作製します。次に、参照電極や記録電極など、実験に不可欠な装置を慎重にセットアップします。次に、ゼブラフィッシュの稚魚を麻酔し、刺激および記録装置に対して適切に配置します。最後のステップは、ガラスマイクロ電極をゼブラフィッシュ稚魚の角膜上に正しく配置することです。最終的に、ゼブラフィッシュの稚魚が準備されます。ERG解析は、すべての錐体を持つ脊椎動物の網膜において、in vivoで錐体の視覚機能を調査するのに有用です。この手法は、錐体の視覚感度や光適応に寄与するシグナル伝達経路の特定など、視覚科学分野における重要な疑問を解決するために非常に役立ちます。ゼブラフィッシュ幼魚の眼は非常に小さいため、記録用マイクロ電極を検体に適切に配置することを習得するのは困難であり、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。本手順を開始するにあたり、フィラメントを用いて火炎研磨したホウケイ酸ガラスキャピラリーから、マイクロピペットを数本作成します。顕微鏡下で適切な目盛り定規を用いて各マイクロピペットを確認し、先端の直径が10から15 µmであり、外観が均一であることを確認してください。実験当日に、10x Ringer溶液を1xに希釈して作業溶液を調製します。脱イオン蒸留水フィルターを用いて溶液をろ過滅菌し、微量ピペットのチップが粒子によって詰まらないようにします。次に、95%酸素、5%二酸化炭素を用いて10分間酸素供給を行います。その後、溶液の酸素状態を維持するため、キャップをしっかりと閉めてください。次に、粘弾性ウレタンポリマーの衝撃吸収材を底面に備えた可動式プラスチックプラットフォームを、光源の下にある防振台の上に設置します。続いて、磁石付きスタンドでカメラを固定し、可動式プラスチックプラットフォームに向けます。その後、記録用微小電極のマイクロマニピュレーターを2つ目の磁石付きスタンドに設置します。カメラとマイクロマニピュレーターが他の機器の動作によって妨げられないようにし、光源からの照明を遮らないようにしてください。その後、カメラをビデオモニターに接続し、プラットフォームに向けて配置します。セットアップが銅線で適切に接地されていることを確認してください。このステップでは、きれいなカミソリの刃を使用して、35 millimeterのペトリ皿にぴったり収まるサイズの乾燥したPVAスポンジを小さな長方形に切り出します。さらに、参照電極を設置するための切り込みをスポンジに入れます。その後、耐化学薬品マーカーを使用して、幼虫を配置する位置にスポンジ上の小さな点をマークします。その後、PVAスポンジをリンガー液に浸し、飽和するまで吸い込ませます。スポンジを取り出し、ペーパータオルで2〜3回素早く水分を拭き取ってから、清潔な35 mmのペトリ皿に入れます。続いて、スポンジが入ったペトリ皿をプラスチック製プラットフォーム上に配置し、マークがカメラで視認できるようにします。次に、電極を6～9%の塩化ナトリウム溶液に浸して塩化物処理を行います。その後、キムワイプの上で5分間自然乾燥させます。カットした部位のスタイルに応じて、参照電極の塩化銀ペレットをスポンジの中または下に配置し、参照電極のリード線を記録システムに接続します。次に、約40 cmのチューブを5 mLのノンルアーロックシリンジに取り付け、シリンジにリンゲル液を満たします。その後、1 mLのノンルアーロックシリンジにリンゲル液を満たします。マイクロフィルを用いて、気泡が入らないように注意しながらマイクロ電極ホルダーを満たします。次に、マイクロフィルを用いて、5 mLシリンジをチューブ経由でマイクロ電極ホルダーの圧力ポートに接続し、1 mLシリンジにリンガー液を満たします。ガラスマイクロピペットを先端から満たし、気泡が入っていないことを確認します。続いて、ガラスマイクロピペットをマイクロ電極ホルダーに取り付けます。この際、電極線が直線に保たれているよう注意してください。固定後、5 mLシリンジを用いて、微小量の溶液が先端に見えるまで、リンガー液をマイクロ電極内に慎重に押し出します。次に、記録用マイクロ電極をマイクロマニピュレーターに慎重にセットし、リード線を記録システムに接続して、システムノイズを確認します。参照電極と記録用マイクロ電極の先端を、リンガー液を満たした35 mmペトリ皿に入れます。オシロスコープまたはERG装置の内蔵機能を用いて、セットアップの電気ノイズレベルを確認します。ノイズレベルは、ベースラインから±10 µV以内である必要があります。本手順では、1 cm²のペーパータオルを数枚切り出し、35 mmのペトリ皿にtricaを最終濃度0.02%になるように加えて1〜2分間待ち、幼虫3〜5匹を麻酔します。その後、解剖用実体顕微鏡下で照明を最小限に抑え、個々の幼虫をペーパータオルの正方形の上に慎重に移します。30分以上の記録セッションを行う場合は、眼が遮蔽され、背面が上を向いている個体を選択し、幼虫の向きを確認してください。細いキャメルヘアブラシを用いて、体に3% methylcelluloseを塗布し、幼虫に水分を保持させます。次に、幼虫がのったペーパータオルの正方形を、湿らせたPVAスポンジへと移します。続いて、蒸留水を含むサイドアームフラスコ内のエアストーンからガスをバブリングさせ、100%酸素で飽和させた水を幼虫に絶えず流し込みます。最小限の照明条件下で、フラスコのサイドアームから加湿された酸素をチューブを用いて幼虫の頭部付近に配置します。マイクロマニピュレーターとカメラを使用して、マイクロ電極の先端を眼の鼻側端と耳側端の中点に配置し、角膜の背側限界に軽く押し当てます。その後、幼魚を5〜10分間暗所に慣らします。次に、LED光源または光学刺激装置から照射した光に対するテストフラッシュ応答を記録します。この図は、5 DPFのゼブラフィッシュ幼魚における典型的なERG記録を示しています。暗順応させた魚に、0秒の時点で光刺激を開始し、1から5,000 canula per square meterの範囲の強度で、20ミリ秒間白色LED光を照射しました。陰性電位のa波は判別が困難である一方、陽性電位のb波が波形の主要なピークとなっています。この挿入図は、Naka-Rushton式を用いてフィッティングされたB波応答の平均振幅を示しています。この図は、PB処理を施した暗適応状態の5 DPFゼブラフィッシュ幼魚における典型的なERG記録を示しています。魚を1から5,000 candela per square meterの強度のLED白色光に20 millisecondsの間照射しており、波形の主要な要素は単離された錐体受容体電位となっています。この挿入図は、Naka-Rushton式を用いてフィッティングされた、PB処理済みゼブラフィッシュ幼魚の平均応答振幅を示しています。この図は、5 D-P-F-A-P-B処理を施したゼブラフィッシュ稚魚における典型的なERG記録を示しています。デュアルフラッシュパラダイムを用い、暗適応させた魚に20ミリ秒の白色光を連続して照射しました。LEDを1000 candela per square meterの強度でフラッシュさせ、フラッシュ間のISI（刺激間隔）を2秒に設定しています。ここでは各光刺激の開始点を示しています。この図は、ISIを長くしたときの、初回刺激に対する2回目刺激の最大単独錐体質量受容体電位応答の比率を示しており、光受容体感度の漸進的な回復を表しています。この手順を試みる際は、記録の品質は電極と角膜の接続の完全性と幼魚の健康状態によって決定されることを覚えておくことが重要です。この技術の開発により、視覚科学の研究者が脊椎動物の網膜における錐体細胞の適応と回復をin vivoで探索する能力が大幅に向上しました。

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は光をインクリメントおよびデクリメントに対応して幼虫のゼブラフィッシュのモータ出力を定量化するために視覚運動応答を開発した。我々はまた別のビジョンアッセイ、視覚性運動反射によってテストするときに完全に盲目であると思われた視運動性応答（NRC）変異体、何を含めていないゼブラフィッシュのビジョンの変異を調べた。...

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

視運動性応答は、広く幼虫ゼブラフィッシュの視覚機能を評価するために使用されています。それにもかかわらず、仔魚のための標準プロトコルは、まだ大人に容易に​​適用されていません...

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

VisioTrackerは、眼球運動の記録に基づいて、幼虫や小さな成魚の視覚性能を定量的に分析するための自​​動化されたシステムです。それはそのような視覚系の発達と機能、薬理学、神経回路の研究や感覚統合などの分野で高スループットの研究を可能にし、視覚刺激のプロパティおよびリアルタイム分析を完全に制御しています。...

VisioTracker、眼球運動解析への革新的な自動化されたアプローチ

このビデオでは、自動追跡ソフトウェアを使用したゼブラフィッシュとファットヘッドミノーの幼生の光運動応答アッセイについて説明しています。このプロトコルは、照明条件の突然の変化に続く幼魚の行動反応を測定します。...

Photomotor Response Assay:照明条件の急激な変化に対するゼブラフィッシュ仔魚の行動反応を測定する方法

このビデオでは、ゼブラフィッシュのオプトキネティックレスポンスアッセイについて説明しています。このビデオでは、視覚運動刺激に基づいて反射的な眼球運動を測定し、ゼブラフィッシュの視力を決定します。...

Optokinetic Response Assay:ゼブラフィッシュの視力を測定する方法

このビデオでは、蛍光カルシウム指示複合体を発現するニューロンを用いたカルシウム指示薬ベースの蛍光イメージングを使用して、トランスジェニックゼブラフィッシュの幼生における視覚的な獲物検出を研究する方法を示します。...

トランスジェニックゼブラフィッシュ幼生における獲物誘発神経活動の解析

ゼブラフィッシュは、多くの研究分野のための貴重なツールとなっている。ここでは、視覚的な応答を誘発し、大人のゼブラフィッシュにおける機能視力を計算する方法を示しています。...

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

私たちは、成体のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞(RGC)を逆行させる効率的な方法を紹介します。...

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

ここでは、ゼブラフィッシュ稚魚から光誘発網膜電図反応の測定を簡素化するプロトコルを提案する.新規円錐状のスポンジ チップ電極は、ビジュアル開発の研究は、ゼブラフィッシュ稚魚網膜電図 ERG...

A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。...

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

学ぶゼブラフィッシュ幼虫の電位図解析法。ガラスマイクロ電極を用いて角膜に電極を配置し、視覚機能を生体内で評価する神経生理学的手法です。視覚科学の研究に応用可能です。

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

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