Name: 腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶ ニワトリ胚を用いたヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの構築法。GFP標識細胞と間葉系細胞を用いた3D培養とin vivo薬剤スクリーニングにより、腫瘍増殖・浸潤・血管新生を評価する前臨床研究手法を習得できます。

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著者は、免疫組織化学とニワトリ胚の準備における優れた技術支援を提供してくださったCornelia Heisさんに感謝したいと思います。この研究は、オーストリア科学基金(FWF Grant No. P19552)と欧州連合(EU FP7プロジェクトOptatio No:278570)の支援を受けました。

//：実験動物福祉のhatching.The NIH Officeは、この領域（HTTPで書かれたガイダンスを提供するまでオーストリアの法律、および米国公衆衛生サービスの実験動物福祉の事務所によると、鳥類の胚は生きた脊椎動物とは見なされませんwww.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htmおよびNIH公開番号：06から4515）。 1.細胞培養およびレンチウイルストランスフェクション<ol><li>培養MM細胞株OPM-2、RPMI-8226およびRPMI1640培地中の骨髄からヒト間葉系幹細胞、存在下で、10％ウシ胎児ウシ血清及び100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび2mMグルタミン37℃、5％CO 2。 </li><li>トランスフェクション5×10 30μlのリポソームトランスフェクション試薬とトランスフェクション培地（10ml）を利用してウイルスパッケージングミックス（9μgの）DNAおよび3μgのをpLenti6 / V5 DESTのeGFPベクターと6 HEK 293FT細胞。 12時間後にトランスフェクション培地を除去し、10％ウシ胎仔血清および1％非必須アミノ酸（NEAA）で10ml DMEM培地を加えます。 </li><li> 5日後、水泳細胞（千XG、5分）の遠心分離後HEK293FT細胞の上清を収集します。他の場所28記載されているように、リアルタイムPCRによりウイルス力価を決定します。 </li><li>完全増殖培地中で24ウェルプレート中のeGFPレンチウイルス粒子（1×10 5粒子）で1×10 6 MM細胞をトランスフェクション。 3日後、培地を2 / mlのブラストサイジンを添加することにより、選択プロセスを開始します。市販のeGFPレンチウイルスの場合は、500 / mlのネオマイシンを使用しています。 </li><li>選択の2週間後、MM細胞をeGFP発現のクラスターが表示されます。遠心分離（千XG、5分）によって細胞を収集し、実験のためにOPM-2 EGFPおよびRPMI-8226 のeGFPサブラインとしてそれらを展開する（セクション2および3）。 </li></ol> 2. 3D-多発性骨髄腫スフェロイドモデル<ol><li>チルI型コラーゲン溶液および10×DMEM On個の氷。 </li><li>コラーゲンマトリックスに10×DMEM培地の1/10量を混ぜます。 7.4のpH値に酸性コラーゲン溶液を中和するために水酸化ナトリウム（0.2 N）を加えます。氷上ストアコラーゲン/媒体液。 </li><li>ヒト間葉系細胞（50,000細胞/スフェロイド、 すなわち、30μlの低下）と、トランスジェニックMM細胞株（スフェロイド250,000、OPM-2 のeGFPまたはRPMI-8226 のeGFP）を混ぜます。 </li><li> 15ミリリットルチューブ（1,000×gで、5分間）で遠心細胞混合物は、細胞ペレットにコールド用意コラーゲン混合物（1mLの）を追加し、（千μlの先端で）よく混ぜます。 </li><li>直ちに滅菌パラフィンフィルム上に24ウェルプレート中で（100μLチップで）コラーゲン/細胞混合物を30μlのピペットと細胞/コラーゲン混合物は、37℃（ 図1Aを参照）で30分間重合を可能にします。 </li><li> 1,10および100nMのボルテゾミブを含む1mLの培養培地でオーバーレイMMスフェロイド（ 図1B参照 ）。 </li><li> 37℃でのインキュベーションの72時間後、文書スフェロイドによって蛍光実体顕微鏡（ 図1C参照 ）。 </li><li> GFPを測定するための反応管に広い平坦なジョーを有する鉗子を使用して、各スフェロイドを転送（ 図1Dを参照）。 </li></ol> CAM 3. 3D多発性骨髄腫異種移植モデル<ol><li> 3日間37°Cおよび70％の湿度で、鳥類の卵のための特別なインキュベーター中で鶏の卵をインキュベートします。 </li><li>その後、オープン卵と移植胚は、細胞培養プレートの蓋をエタノール、正方形、10 cmのプラスチック製計量ボートで滅菌し、CAMが（ 図2A参照 ）を開発することができるように、さらに6日間「EX OVO」をインキュベートします。 </li><li>氷の上にI型コラーゲン溶液および10×DMEMを冷やし、コラーゲンマトリックスに10×DMEM培地の1/10量を混ぜて、7.4のpH値に酸性コラーゲン溶液を中和するために水酸化ナトリウム（0.2 N）を追加します。氷上ストアコラーゲン/媒体液。 </li><li>トランスジェニックMM細胞株（OPM-2 のeGFPまたはミックスRPMI-8226 のeGFP;ヒト間葉系細胞とスフェロイド）250,000（50,000細胞/スフェロイド）。 </li><li> 15ミリリットルチューブ（千XG、5分、各​​試験化合物1バイアル用）で遠心細胞は、細胞ペレットに（望ましい稼動濃度で）薬物と1mLの冷たい準備コラーゲン混合物を追加し、（千μLチップで）よく混ぜます。 </li><li> 37℃での細胞外マトリックスの重合を可能にするために30分間よくパテ6にコラーゲンが低下パラフィルム上（30μlの各）を配置します。 </li><li> （2センチメートル離れた胚）から9日齢のニワトリ胚のCAMの未処理面に鉗子を用いて、ステップ3.6からの転送「オンプラント」（各ニワトリ胚のための4オンプラント、 図2Bを参照してください） </li><li>蛍光実体顕微鏡によるインビボでの 37℃での卵のインキュベーター中で成長し、70％湿度、文書異種移植の5日後（ 図2Cを参照）。 5時間冷蔵庫で4℃での低体温によってニワトリ胚を安楽死させます。 </li><li>広い平坦な顎を持つ眼科はさみや鉗子による直下のCAM組織との異種移植片を取り除きます。 GFPの測定のためにそれらを使用します（セクション4、 図2Dを参照）または血管および/ ​​または侵入腫瘍細胞（第5節）の免疫組織化学的分析のため。 </li></ol> 4. ELISAによるEGFPタンパク質の定量<ol><li> 200 / mlのプロテ​​アーゼ阻害剤を含有する0.5ミリリットルのRIPAバッファーに各MMスフェロイドまたは切除された異種移植片を転送します。 </li><li>氷上の組織ホモジナイザーでスフェロイド/異種移植片を均質化。 </li><li>液体窒素および37℃の水浴三の凍結/解凍サイクルを実行します。 </li><li> 20分（12000グラム）とストア上清4℃で遠心分離ホモジネート。 </li><li>サンプルをELISAキットのアッセイ緩​​衝液（200μL）で1:20に希釈します。製造業者のプロトコルに従って、ビオチン化抗GFP抗体を用いた商用GFP ELISAキットによりGFP-レベルを測定します。 </li></ol> 5. Immunohi血管や侵入腫瘍細胞のstoc​​hemical分析<ol><li> 4℃で4％パラホルムアルデヒドO / NでCAM領域で切り出し異種移植片を修正しました。 </li><li>包埋カセットに固定された異種移植片を配置し、段階的な増加アルコールシリーズ（50％、70％、80％、95％エタノール、キシロール、パラフィン、各ステップ60分間）を用いて組織の埋め込みステーションに移します。 </li><li>卓上型ロータリーミクロトームを使用することにより、セクションの異種移植片（5ミクロン）。 O / N 56°Cでのガラススライド上のパラフィン切片焼きます。 </li><li>二重蒸留水に減少段階的アルコール系によって脱パラフィン切片（キシロール、95％、80％、70％、50％エタノール、再蒸留水;各ステップ10分）。 </li><li>抗原回復溶液（; pHは7.0、体積100μlのクエン酸塩緩衝液）との水浴（95℃、20分）で抗原回復を実行します。 </li><li> 30分間、100μlの3％H 2 O 2 /メタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。 </li><li>を含むPBSでブロックセクション45分（体積100μl）を、10％ウシ胎児血清。 </li><li>一次抗体の100μlで1時間染色を（1μgの/ ml）を、室温で、1％ウシ胎児血清を含むPBSで希釈しました。 </li><li> PBSで3回洗浄した後、室温で1％ウシ胎児血清を含むPBS中のビオチン化二次抗体（0.1μgの/ ml）で1時間インキュベートします。 </li><li> PBSで3回洗浄した後、製造業者の説明書に従って、アビジン/ビオチン複合体（ABC）とジアミノベンジジン（DAB）基質溶液によって呈色反応を行います。 </li><li> 5.11。ヘマトキシリン​​で二重蒸留水、対比にセクションを転送することによって反応を停止し、合成封入剤とのセクションをマウントします。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、全く競合する金融利害関係はありません

難治性MMのための新たな治療薬の開発は、薬物に対するヒトMM細胞の感受性を評価するために少ない時間がかかり、高価な生体内のシステムを必要とします。これまで、わずか数の生体内のシステムは、新しい抗骨髄腫治療の前臨床評価のために利用可能です。それらのすべては、化合物ライブラリー29の大規模スクリーニングのためにそれらの限界があります。 ヒトMM細胞のための最高の現行モデルは、高度免疫不全マウス7,13,30と七面 ​​鳥の胚29です。 SCIDマウスおよび鳥類胚異種移植モデルの両方は、MMの生物学を研究し、新規の治療化合物を試験するために使用することができます。しかし、マウス系は、近交系の遺伝子型を含む、技術的に要求の厳しい手順、長い観察期間と高いコストを、いくつかの制限があります。 本研究では、新規な3Dスフェロイドおよびトリ異種移植モデルは、ヒトのMESの存在を伴うヒトMM細胞の生物学を研究するために提示されています支持部品としてenchymal幹細胞及び細胞外マトリックス。 MM細胞が強く、それぞれの...

多発性骨髄腫(MM)は、骨髄における悪性形質細胞の増殖、骨病変、免疫不全1を特徴としています。プロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブ)や免疫調節薬(ポマリドマイド、レナリドマイド)などの新たな治療選択肢はあるものの、MMは依然として不治の悪性腫瘍であり、予後は厳しいままです2。予後不良は、MM細胞クローンの異常な不均一性によって説明され、特に長時間の治療とMMクローンの選択圧下で、治療に対する反応が変動する原因となる可能性があります3。
新薬とその組み合わせの前臨床試験は、将来の医薬品開発にとって重要で時間のかかるステップです。したがって、MMの生物学的理解を深め、新薬の発見を可能にするためには、MMの有用なinvivoモデルが必要です。実際、血液悪性腫瘍および治療薬に最適な異種移植モデルは、重症複合免疫不全(SCID)マウス4-7、非肥満糖尿病/SCID(NOD/SCID)マウス8,9、またはβ-ミクログロブリンノックアウトNOD/SCIDマウス10,11などの免疫不全マウスである。
ヒトMMのマウスモデルは、いくつかの側面でヒトの疾患の表現型に似ていることがありますが、免疫不全マウスは近交系されているため、薬物に対する個々の反応を一つしかシミュレートせず、コストは非常に高くなります。免疫抑制のために、動物は特別な維持条件を必要とし、マウスでのヒトMMの生着には6週間から2ヶ月が必要です9,12、ただし、細胞が技術的に要求の厳しい手順を使用して骨髄に直接移植され、動物の生存率が低くなっています7,13。そのため、幹細胞ベースのオルガノイドモデル14、組織工学15、または洗練された3D細胞培養モデル16を用いた新しい方法が確立されている。近い将来、前臨床薬物試験のための古典的な動物実験と競合するでしょうが、生体の全身毒性試験に取って代わることはできません。
ニワトリの胚は、17-19歳になるまでの適応免疫応答の欠如により、ヒトの細胞や組織の異種移植に適した生物であることが以前に実証されています。さらに、各ニワトリ胚は、ニワトリ集団内の遺伝的多様性により、適用された薬剤または腫瘍細胞に対する個々の反応を反映しています。絨毛膜(CAM)は、腫瘍依存性血管新生を研究するための確立されたシステムです20-22。固形腫瘍をCAMに移植すると、増殖、浸潤、血管新生、転移など、in vivoでがんの多くの特徴を示します23-27。
私たちのグループの以前の経験に基づいて、CAM異種移植モデル20,26,27を使用して、ヒト3D培養システムの利点とex ovo発達ニワトリ胚のモデルを組み合わせたヒトMMモデルが確立されました。このMMモデルシステムにより、MM増殖の進行のリアルタイムモニタリング、細胞量の定量化、および前臨床薬物試験が可能になります。

<table><tbody><tr><td>RPMI-8226細胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STRプロファイル</td></tr><tr><td>OPM-2細胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STRプロファイルヒト</td></tr><tr><td>間葉系幹細胞&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FTセル&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- Pen- Strep solution</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfection Medium/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP レンチウイルス粒子</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>すぐに使用できるウイルス粒子</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP ベクター</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>著者から</td></tr><tr><td>ViralpowerTM 包装ミックス&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬/ リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>ブラストシジン</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>ネオマイシン</td><td>バイオクロム</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン-タイプ1&nbsp;ラットテール</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM粉末</td>ライフ<td>テクノロジー</td><td>ズ Art.Nr 10338582</td><td></td></tr><tr><td>プリチデプシン</td><td>ファーママーボル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テゾミブ</td><td>LKT研究所</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-white hen eggs</td><td>Charles River</td><td></td><td>Fertilized&nbsp; white Leghorn&nbsp; ニワトリの卵</td></tr><tr><td>プラスチック計量ボート</td><td></td><td>neoLab Art.Nr. 1-1125</td><td>for ex-ovo culture</td></tr><tr><td>Petridish square (Lids)</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>for ex-ovo culture</td></tr><tr><td>RIPA Buffer (10x)</td><td>Cell Signaling</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Protease阻害剤錠剤</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini EDTA-free</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost顕微鏡スライド</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>アート-NR。</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation ウォッシュバッファー 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Code-NR.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ターゲット回収液 (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>DAKO</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu ASMA clone 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 clone MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Vimentin clone V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Desmin clone D33</td><td>DAKO</td><td>&nbsp;M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; クローンMIB-1&nbsp;&nbsp;</td><td>ダコ</td><td>&nbsp;M7240</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ - 抗マウスIgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>ベクタステインエリートABCキット</td><td>ベクターラボラトリーズ株式会社</td><td>#PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>FAST DAB錠セット。</td><td>シグマバイオケミカル</td><td>ズ#D4293</td><td></td></tr><tr><td>メイヤー'S haemalaun solution</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップロータリーミクロトーム</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding station</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Egg-Incubator</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ(オリンパスE410)とフレキシブルな冷光を連結した実体蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス、SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&nbsp;</td><td>IKA T10</td><td></td><td>ホモジナイザー</td></tr></tbody></table>

腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

多発性骨髄腫（MM）、悪性形質細胞疾患は、不治のままであり、新規の薬剤は、患者の予後を改善するために必要とされます。これにより、骨の微小環境と自動/パラクリン成長因子の欠如により、ヒトMM細胞を育成することは困難です。したがって、ヒトMM細胞に対する新規治療薬の作用を研究するために、in vitroおよびin vivo培養系において適切な確立が急務となっています。ここでは、in vitroおよびin vivoで 、複雑な3D環境内でヒト多発性骨髄腫細胞を増殖するためのモデルを提示します。 MM細胞株OPM-2及びRPMI-8226は、GFP導入遺伝子を発現するようにトランスフェクトされた三次元スフェロイド、ヒト間葉系細胞とコラーゲンI型基質の存在下で培養しました。加えて、スフェロイドは、ニワトリ胚の漿尿膜（CAM）に移植した腫瘍の成長は、ステレオ蛍光顕微鏡法によってモニターしました。どちらのモデルも、新たな治療DRUの研究を可能にします複雑な3D環境と導入遺伝子に特異的なGFP-ELISAにおける移植片の均質化後の腫瘍細胞塊の定量化でGS。また、下にある宿主組織へのホストおよび腫瘍細胞の浸潤の血管新生応答は、実体顕微鏡により毎日モニターし、ヒト腫瘍細胞（KI-67、CD138、ビメンチン）、または宿主壁細胞被覆血管に対する免疫組織化学染色によって分析することができます（デスミン/ ASMA）。 結論として、onplantシステムは、複雑な3D環境でのMM細胞の増殖と血管新生を研究することができますし、MM細胞の生存および増殖を標的とする新規治療化合物のスクリーニングを可能にします。

3D多発性骨髄腫スフェロイドアッセイにおける標的化合物のインビトロでの分析で これにより、in vitroで初代ヒトMM細胞を培養する制限に、我々は、細胞外成長マトリックスおよび骨髄（ 図1A、B）から支持初代ヒト間葉系細胞を利用したヒトMM細胞株のためのインビトロ培養モデルにおける新しい3Dを確立しました。 EGFPトランスジェニックMM細胞株は、スフェロイド内の3D成長後に視覚化し、MM腫瘍塊の定量化を可能にします。両方のMM細胞株OPM-2 EGFPおよびRPMI-8226 のeGFPステレオ蛍光顕微鏡でGFPの発現によって可視化したボルテゾミブ腫瘍の漸増濃度（1〜100nMの）の存在下で3日間培養した（ 図1C） 。腫瘍細胞塊は、スフェロイドの均質化後に定量化し、GFP-ELISA（ 図1でのeGFPの内容...

ヒト多発性骨髄腫（MM）細胞は、間葉系細胞と生存および増殖のための細胞外マトリックス成分の支援微小環境が必要です。我々は、腫瘍の増殖、浸潤および血管形成に対する抗がん剤の効果を研究するために移植されたヒト骨髄腫および間葉細胞とin vivoでニワトリ胚モデルを確立しました。

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

本実験の全般的な目的は、ヒト骨髄腫細胞および間葉系細胞を移植した鶏胚in vivoモデルを構築し、抗がん剤が腫瘍の増殖、浸潤および血管新生に及ぼす影響を調べることです。これは、3D in vitroモデルおよびin vivoモデルでの解析に向けて、遺伝子組換えヒト多発性骨髄腫細胞を作製することで達成されます。これらの細胞には、可視化のためのGFPと、導入細胞を選別するためのブラスチン耐性を付与するレンチウイルスを導入します。第2ステップとして、3Dバイロイドを構築します。形質導入された細胞を用いて、間葉系細胞と細胞外マトリックスを生成させることで、複雑な3D in vitro環境における抗がん剤の大規模スクリーニングが可能になります。次に、3D腫瘍を構築します。PHEを鶏胚内でin vivoで培養することで、新規薬剤が腫瘍の増殖、浸潤、および血管新生に及ぼす影響を検証することができます。最終的に、腫瘍のサイズと血管新生応答を、日次および安楽死後に記録することが可能です。腫瘍は、GFP、ELISA、および免疫組織化学によって解析できます。この手法の既存の手法（キセノグラフトモデルなど）に対する主な利点は、ヒト腫瘍の取り扱いとイメージングにおいてECXが優れている点にあります。適応免疫応答がまだ備わっていない鶏胚において、ヒトの支持細胞および細胞外マトリックス成分を伴うヒト腫瘍細胞をin vivoで増殖させることが可能です。この手法は、新規治療法の開発に寄与し、多発性骨髄腫患者の治療に向けた迅速な前臨床スクリーニングを可能にします。ヒト多発性骨髄腫細胞はストレスによって容易にアポトーシスを起こし、また頬胚は不適切な外胚葉培養条件による不手際で死滅する可能性があるため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。手順およびすべての重要なステップの実演は、当研究室の熟練技術者であるCornelia. Hesが行います。本プロトコルのために、多発性骨髄腫細胞株OPM2、RPMI 822 6、および骨髄由来ヒト間葉系幹細胞の培養液を準備してください。テキストのプロトコルに従い、添加剤入り培地で細胞を通常通りインキュベートします。100万個の多発性骨髄腫細胞に100,000個のレンチウイルス粒子をトランスフェクションしてください。完全増殖培地を用いた24ウェルプレートにおいて、3日後に、培養液1 mLあたり2 µgのブラスチンを添加してトランスフェクション細胞の選別を開始します。市販のEGFPレンチウイルスの場合は、1 mLあたり500 µLのネオマイシンを使用してください。2週間の選別後、EGFPを発現している細胞クラスターを確認します。浮遊または接着している細胞クラスターを慎重に回収し、遠心管内で再懸濁させ、1000 ×gで5分間遠心してEGFP陽性細胞をペレット化し、サブラインとして拡大培養します。GFP発現多発性骨髄腫細胞の選別および増殖後、さらなる実験に使用する前に、必ずその能力を確認してください。まず、I型コラーゲン溶液と10 X DMEMを氷上で冷却します。冷却後、10 X DMEM培地をコラーゲン溶液に対し1/10の容量で混合します。次に、0.2 N 水酸化ナトリウムを滴下し、溶液のpHを7.4に中和します。溶液を氷上に保持し、試験紙でpHを確認します。次に、形質転換多発性骨髄腫細胞株をヒト間葉系細胞と混合します。続いて、細胞混合液を15 mLチューブに入れ、1000 Gsで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、P 1000ピペットを用いて、ペレットを1 mLの冷却コラーゲン混合液に再懸濁します。P 100チップを用いて、混合液を30 µLずつ滅菌パラフィン上に速やかに分注します。24ウェル培養プレート内で、混合液を37 °Cで30分間重合させ、ステロイドを形成させます。次に、形成されたステロイドに、異なる処理を施した調製済み培地を1 mLずつ重層します。例えば、薬剤を異なる濃度で投与します。37°Cで72時間インキュベートした後、蛍光実体顕微鏡を用いてPHEを記録します。次に、幅広の平鉗子を使用して、各ステロイドを反応チューブに移し、GFP発現量を測定します。本手順の準備として、鶏卵を卵インキュベーターで37 °C、湿度70%で3日間培養します。その後、卵を開き、胚を滅菌済みの10 cm正方形プラスチック製ウェーイングボート（細胞培養用プレート付き）に移します。これは、ex ovo培養における鶏胚の生存率を高めるためです。10 cmの組織培養皿の代わりに、プラスチック製ウェーイングボートを使用してください。さらに、使用前に滅菌し、PBSを満たしたボートで長時間前処理を行います。卵をさらに6日間in ovoでインキュベートし続け、その間に脈絡膜（CAM）を発達させます。次に、前述の手順に従って多発性骨髄腫および間葉系細胞のPHEを準備しますが、今回は6ウェルプレートで作成します。その後、ピンセットを用いて、ステロイド処理した植物を、生後9日の鶏胚の胚から約2 cm離れたCAMの未処理表面に移植します。各ニワトリ胚に4つの植物を配置します。植物を載せたex ovo胚を卵孵化器内で5日間静置します。その後、蛍光実体顕微鏡を用いて移植片を記録します。記録後、眼科用剪刀とピンセットを使用して、隣接する組織の一部と共にゼノグラフトを摘出します。GFP発現の測定または免疫組織化学的解析を行うには、まず各多発性骨髄腫ステロイドまたは摘出ゼノグラフトを、プロテアーゼ阻害剤を含む0.5 millilitersのRIPAバッファーに転移させます。次に、氷上でホモジナイザーを使用して組織を混合します。均質化後、液体窒素および37 degrees Celsiusのウォーターバスを用いて、ホモジネートの凍結融解を行います。この操作を3回繰り返し、その後、ホモジネートを4°Cで12,000 G、20分間遠心分離し、上清を回収して保存します。次に、上清の一部をELISAキットのアッセイバッファーで1:20に希釈します。その後、キットを用いて、ビオチン化抗GFP抗体によりGFPレベルを測定します。摘出したゼノグラフトをパラホルムアルデヒドで一晩固定することから始めます。翌日、固定したゼノグラフトを脱水し、包埋します。まず、カセットに試料を入れます。その後、カセットを段階的なアルコール系列に移行させます。各浴に1時間浸し、最後にパラフィン包埋を行います。次に、卓上回転式ミクロトームを用いて5 µmのゼノグラフト切片を作成し、収集したパラフィン切片をガラススライド上で56 °Cで一晩加熱します。翌日、段階的に濃度を下げたアルコール系列から2回蒸留水へと移行させ、切片を脱パラフィン処理します。各液への浸漬時間は10分間としてください。その後、テキストプロトコルに従い、対応する一次抗体および二次抗体でインキュベートし、酵素と基質を用いて比色検出を行います。抗体染色の後、ヘマチンで対比染色を行い、合成封入剤を用いて切片を封入します。EGFPを発現する2種類の多発性骨髄腫細胞株を用いて、薬剤存在下で3日間培養しました。その後、ボルテゾミブおよびステロイドを投与した腫瘍細胞を、ステレオ蛍光顕微鏡下でGFPの発現により可視化しました。薬物投与後の腫瘍細胞塊を定量するため、PHEをホモジナイズし、GFP ELISAを用いてEGFP含有量を測定しました。別の実験では、3日齢のニワトリ胚を6日間、in ovoで培養しました。9日目に、多発性骨髄腫細胞のPHEを移植しました。各胚に4つの植物グラフトを接合した。標的物質であるボルテゾミブを1 molで局所投与したところ、5日後にコントロールと比較して植物に腫瘍が形成された。蛍光腫瘍塊の可視化に基づき、ボルテゾミブがグラフトにおける多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制したことが示された。3匹の異なる動物から1つずつグラフトを摘出し、ホモジナイズした後、GFP Elizaで測定しました。対照群と比較して、ボルテゾミブ投与組織ではマイエローマ細胞量が有意に減少していました。このビデオを視聴することで、目的の癌細胞を鶏胚に移植し、腫瘍の増殖と発生、およびその後の宿主組織への浸潤を解析するための実験方法を十分に理解できるはずです。この手法により、多発性骨髄腫分野の研究者が、前臨床薬剤試験に不可欠な、扱いやすいモデル生物を用いて新規化合物や薬剤を探索する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

定量的PCRを用いて、我々は十分に確立されたニワトリCAMモデルは定量的に遠隔臓器へのヒト腫瘍細胞の転移を分析するために使用できる方法を示します。...

鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析

このビデオは、がん細胞をニワトリ絨毛尿膜血管系に静脈内注射してCAMがん転移モデルを生成する手順を示しています。注入された細胞は、最終的に散在する単一がん細胞コロニーを形成し、がんの浸潤と転移の研究を可能にします。...

ニワトリ絨毛尿膜血管系への癌細胞の静脈内注射:癌の浸潤と転移を研究するための絨毛膜膜癌モデルを確立する手順

免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植は、癌の生物学を研究するための貴重なツールです。ヒト肝細胞癌細胞または腫瘍断片の皮下および肝臓内異種移植片を生成するための特定のプロトコルが記載されている。レシピエントマウスにおいて、部分肝切除により誘発される肝臓再生は、肝移植を容易にするための戦略として提示される。...

免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成

主な侵襲的同所性膀胱癌異種移植片を接種するために確立された技術は、開腹手術と膀胱の動員を必要とします。この手順では、マウスに有意な病的状態を負わせる技術的に困難であり、時間がかかる。したがって、我々は、経皮的アプローチは、超音波誘導を利用して、高精度を開発した。...

マウス同所性膀胱異種移植片の最小侵襲性の確立

ニワトリ絨毛尿膜(CAM)は免疫不全で高度に血管新生されているため、腫瘍の成長と血管新生の自然なin...

ザ・<em&gt;卵内</em肝細胞癌の効率的な異種移植モデルとして&gt;ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイ

前立腺癌は、米国で癌関連の死亡原因として2番目に多いものです。同所性がんモデルは、前立腺がんの生物学を理解し、治療レジメンの有効性を評価するための有用なアプローチを提供します。このプロトコルでは、同所性前立腺がんマウスモデルを確立するために必要な詳細な手順について説明します。...

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

転移性透明細胞腎細胞癌は、徹底的な前臨床調査のための包括的な動物モデルのない疾患である。このプロトコルは、この疾患の2つの新しい動物モデルを示している:異所的に移植されたマウスモデルと鶏絨毛アラント膜モデルは、いずれも臨床症例に似た肺転移を示す。...

マウス腎臓と鶏絨毛性膜に確立された転移性透明細胞腎細胞癌モデルの比較

我々は、婦人科および泌尿器科癌細胞株および患者由来腫瘍の生着のための代替、移植可能なインビボモデルとして鶏絨毛アラント膜モデルを提示する。...

生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する

本プロトコールは、ヒト骨肉腫組織を用いて患者由来異種移植片(PDX)マウスモデルを確立する方法を記載している。...

ヒト骨肉腫組織を用いた患者由来異種移植マウスモデルの樹立

このプロトコルは、注射の 4 日後に行われる患者由来の B および T 急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の卵子異種移植...

Ovoに位置 患者由来急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の異種移植 (PDX-ALL)

学ぶ ニワトリ胚を用いたヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの構築法。GFP標識細胞と間葉系細胞を用いた3D培養とin vivo薬剤スクリーニングにより、腫瘍増殖・浸潤・血管新生を評価する前臨床研究手法を習得できます。

腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立

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