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本実験の全体的な目的は、このin vitro休眠モデルを適用して分子および細胞メカニズムを研究し、より生物学的に複雑なin vivoモデルで検証するための仮説を構築することです。これは、エストロゲン陽性乳がん細胞を、細胞同士ではなく主に基質との相互作用が支配的となる低密度で、フィブリンネックコード組織培養プレートを用いて培養することで達成されます。第2段階として、骨髄中の乳がん細胞を模したFGF twoおよびフィブロネクチンによって支持・維持されることで、一部のエストロゲン陽性細胞において休眠状態が誘導されます。

次に、休眠細胞のさまざまな表現型および分子的な側面を崩壊させ、休眠状態の維持におけるそれらの役割を明らかにするために、抗体、阻害剤、ペプチド、または核酸を添加して系を摂動させます。結果には、フィブロネクチンコーティングプレート上でFGF2を用いて培養した細胞に処理を施した結果得られた、増殖コロニーおよび休眠コロニーの数と外観が示されています。この手法は、骨髄微小環境に存在するエストロゲン依存性乳がん細胞において、どのシグナル伝達経路、接着分子、またはその他の特定の分子メカニズムが休眠の形成と維持に関与しているかを解明するのに役立ちます。

まず、CF7細胞株が約50%コンフルエントに達したプレートから培地を吸引し、あらかじめ加温したPBSで洗浄します。次に、胎児牛血清を含まないDMEM高グルコース培地で溶解した0.25%トリプシンEDTA溶液を1 mL添加します。細胞が剥離し始めるまで、プレートを37 °Cで1〜4分間インキュベートします。

細胞がプレートから剥離し、単一細胞懸濁液が形成され始めたら、2 mL ピペットを用いて数回ピペッティングし、残っている細胞塊を分散させます。トリプシン処理後4分が経過しても細胞塊が残っている場合は、それらの細胞を廃棄し、新しい培養細胞を準備してください。4分後も互いに凝集している細胞が含まれていると、コロニー数のカウント時に誤差が生じる可能性があります。トリプシン処理した細胞をプレートに分注し、培養液中で 1,500 cells/mL の濃度で再懸濁します。5 mL ピペットを用いて緩やかにピペッティングし、細胞懸濁液を混合します。その後、自動細胞計数装置を用いて細胞数をカウントし、懸濁液が主に単一細胞で構成されていることを確認してください。

これは、位相差顕微鏡下で計数器を用いて手動で行うことも可能です。次に、細胞懸濁液を3 mL分吸い取り、フィブロネクチンコーティングした24ウェルプレートの各ウェルに、1 mLずつ分散させます。細胞の空間的分布を最適化するため、懸濁液は必ずウェルの中央にピペッティングし、細胞が沈降して接着するまでプレートを動かさないようにしてください。

残りの細胞懸濁液をマスターセル混合液に戻し、再度細胞を混ぜてから、さらに3 mLを分取します。細胞はチューブ内で絶えず沈降するため、この手順により細胞数のばらつきを抑えることができます。また、細胞を室温およびCO2濃度条件下で懸濁させたままにすると、同系潜在能が変動するため、ピペット操作で迅速に大量の細胞を分配してください。細胞を37 °C、5% CO2でインキュベートします。これをマイナス1日目とします。

実験のタイムラインについて。アッセイの0日目に、培地を1 mLの新鮮な培地、または10 ng/mLのfibroblast growth factor 2を含む新鮮な培地へと交換します。6日後のウェル内の細胞数は少ないため、元の培地の栄養成分、サイトカイン組成、またはpHに大きな影響を与えることはありません。

3日目に、PI3キナーゼ阻害剤（LY 2 9 4 0 0 2）、ネガティブコントロール（LY 3 0 3 5 1 1）、または培地コントロールなどの攪乱剤を、最終予定濃度の10倍に調製した溶液100 µLを、ウェル内の既にある1 mLの培地に加え、拡散によって溶液を混合させます。プレートをインキュベーターに戻し、さらに3日間培養します。6日目に、0.1%クリスタルバイオレットを2%エタノールおよび10 mMホウ酸ナトリウム溶液に溶解させます。

pH 9に調整した後、ウェルから培地を吸引し、各ウェルに1 mLのクリスタルバイオレット溶液を加えて20分間置きます。シンクに氷バケツを置き、バケツに水を絶えず流して洗浄ステーションを準備します。プレートのウェル開口部を鋭角に下に向けて水に浸し、プレートを洗浄します。水中に浸かっている状態でプレートを水平に傾け、ウェル開口部が下を向くようにします。

その後、プレートを再び緩やかな角度に傾け、一度の緩やかな動作で取り出します。ウェルの底の水が青く見えなくなるまで、浸漬を2〜3回繰り返します。その後、プレートを逆さまにしてベンチ上のタオルの上に置き、一晩乾燥させます。

乾燥後、プレートを倒立位相差顕微鏡下に置き、各ウェル内の増殖コロニーと休眠コロニーの数を数えます。40倍の倍率で、30細胞を超えるコロニーを増殖コロニーとして数え、12細胞以下のコロニーを休眠コロニーとして数えます。図に、増殖コロニーと休眠コロニーの典型的な外観を示します。

増殖コロニーは30個以上の細胞を含み、休止コロニーは12個以下の細胞を含みます。休止コロニーは、FGF2を培地に添加しない場合、細胞質と核の比率が高く、増殖細胞よりもはるかに大きくなります。コロニーは主に増殖クローンによって構成されます。FGF2が存在する場合、大多数のクローンは休止状態となりますが、本システムを用いて他の薬剤の添加効果を評価することも可能です。ここでは、あらかじめ決定した濃度の2種類の撹乱剤を、Congenicアッセイの3日目にウェルへ添加しました。

この図は、PI3キナーゼ阻害剤LY 2 9 4 0 2による休眠クローンの選択的抑制と、ネガティブコントロールであるLY 3 0 3 511では効果が見られなかったことを示しています。これらの実験は、休眠と治療耐性を制御する因子の理解に役立てることができます。ここでは、PI3キナーゼ阻害剤で処理された生存休眠細胞が、広がった形態を失い、小さな樹状となり、ストレスを受けたような外見になったことが示されています。

このビデオを視聴することで、休眠細胞を育成するためのこのコンジェニックアッセイの確立方法、休眠状態を確立した後に特定の阻害剤や撹乱剤を添加して細胞を撹乱する方法、および撹乱剤の効果を定量化する方法について十分に理解できるはずです。このアッセイは、休眠コロニーのカウントや、休眠細胞および撹乱細胞における任意の超微細構造的、免疫表現型的な、あるいは分子的な事象を測定することで、定量的および定性的な結果の両方を評価するために使用できます。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。