マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

本実験の全体的な目的は、梗塞体積と血液脳関門の完全性を同時に測定することにより、反復性低酸素プレコンディショニング（RHP）後の神経保護作用を定量化することです。これは、マウスを、持続時間と強度が異なる9回の確率的低酸素曝露にさらすことで、脳卒中に対する神経血管保護を提供することによって達成されます。その後、マウスに脳卒中を誘発し、エバンスブルーを注入します。

エバンズブルーはアルブミンに選択的に結合するため、動物の犠牲後、注射による血液脳関門の破綻を定量することが可能です。脳を摘出し、TTCで染色して梗塞体積を定量します。結果から、反復的低酸素プレコンディショニングが、虚血性脳卒中後のマウスにおいて神経保護的に作用することが示されました。

単回曝露による低酸素プレコンディショニングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、RHPがマウスにおいて少なくとも8週間にわたり神経保護作用をもたらすことです。この二重定量法は、血液脳関門の破綻における梗塞体積をいかにして同時に測定するかといった、脳卒中研究における重要な課題への答えとなり得ます。本手法は虚血性脳卒中への知見を得るために使用できますが、RHPは他の中枢神経系（CNS）疾患や全身性の炎症性疾患状態にも適用可能です。まず、マウスを2つの群に分けます。

8%および11%の酸素に曝露させるRHP群と、同時に21%の酸素に曝露させる対照群について、各ケージの上部フィルター蓋を取り外し、餌と水ボトルを入れたままのケージをそれぞれの酸素タンクに接続されたチャンバーに設置します。チャンバーの蓋を閉じて固定します。タンクのメインガスバルブを開き、各誘導チャンバーの初期流量を2 L/min（LPM）に設定します。

5分間の曝露後、残りの曝露時間の間、流量を1 LPMに下げます。曝露終了時に、流量を0 LPMにしてガスバルブを閉じます。タンクについては以下の通りです。

チャンバーの蓋を開け、各ケージのフィルター付きトップリッドを付け直します。次回の低酸素曝露まで、ケージを標準的な飼育環境に置きます。使用後は、各誘導チャンバーを消毒剤および消臭剤でスプレー洗浄してください。

プロトコルの2週間にわたり、RHPマウスと対照マウスの両方を、一日のうち同じ時間に曝露させます。その後、本文に記載されている通り、一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）を行います。EB注入は再灌流の22時間後に行い、安楽死およびNTTC染色を行う2時間前まで血流中で循環させる必要があります。

注入に必要な量のEBを調製します。次に、室温に置いたものを必要な量だけ0.3 ccインスリン用注射器で吸引します。29ゲージの針を用い、底面が平らな保定器でマウスを固定します。

側静脈が上になるように尾を保持します。側静脈は尾の中心線の両側に位置しています。マウスを固定して注射を行うため、尾の先端を持って保持します。

針を静脈に約3〜5 mm挿入します。静脈を貫通させないように注意しながら、1分かけて染料をすべて注入してください。溶液が静脈に入っていれば、シリンジに圧力をかけた際に抵抗はほとんど感じられないはずです。

マウスの尾肢および眼の即時の色変化により、EBの全身静脈投与が成功したことを確認します。尾から針を抜き、出血を止めるために清潔なガーゼで軽く圧迫してください。タイマーを開始します。

マウスの皮膚が青くなった後、弱まった血液脳関門に浸透させるため、EBを2時間循環させます。灌流およびTTC染色は、T-M-C-A-Oから24時間後の再灌流24時間後、かつEB投与から2時間後に行います。小型誘導チャンバー内でイソフルランを過剰投与し、動物を安楽死させます。死後の酸素欠乏により開始される自己融解を最小限に抑えるため、安楽死後直ちに灌流を開始してください。

動物をスチロフォーム製プラットフォーム上に素早く固定し、前肢を前足からピンで留めます。肋骨の下の正中線から腹壁にかけて側方切開を行います。心臓を露出させるため、横隔膜を慎重に切開します。

氷冷した0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を満たした60 ccシリンジを27ゲージの翼状静脈留置針に接続し、灌流ポンプを流速5 mL/minで始動させます。針先を心臓の左心室に約0.5 cm挿入し、右心房を切開します。灌流中、右心房からは次第に希釈された静脈血が流出し、最終的に無色になります。0.01 M PBS 30 mLを心臓内に灌流させます。

次に、透明な20個のシンチレーションボトルにTTC溶液を5 mLずつ加えます。灌流後すぐに動物を断頭し、必要に応じて小型の鋏とスパチュラを用いて脳を摘出します。閉塞させた中大脳動脈の対側半球が、顕著なEB漏出や浮腫がなく、蒼白に見えることを確認してください。

次に、マウス脳の1.0 mm厚の冠状断面を作成するために設計されたアクリル製脳マトリックスにPBSを注ぎます。脳を背側が上になるようにマトリックスに配置し、直ちに脳の上にPBSを注ぎます。脳を湿った状態に保ってください。

マトリックスの吻側から2番目のスロットに厚さ 0.21 millimeter のステンレス製ブレードを挿入し、嗅球を除去します。次に、マトリックスの尾側から4番目のスロットにブレードを挿入し、小脳を除去します。マトリックスの残りのスロットの中央のスロットにブレードを挿入します。

次に、スライス時に組織が最も均等に分散するように、残りの組織を等分に二分するようにして、残りのブレードを挿入します。すべてのブレードを挿入したら、PBSを1〜2滴脳に滴下して湿らせます。その後、吻側領域から始めて、ブレードを1本ずつマトリックスから取り出します。

最初の7枚のスライスをTTC分析用に保存します。T-M-C-A-Oの後、小型のスパチュラを使用して、スライスをブレードからTTCを満たしたバイアルへ慎重に移動させます。すべての切片をバイアルに入れたら、蓋をして、切片がピンク色に染まるまで温水バスに浸します。

染色のムラにつながる切片の重なりを避けるため、必要に応じてバスの中のボトルを静かに回転させます。その後、TTCを廃棄し、脳切片が浸るように4%パラホルムアルデヒド溶液をバイアルに注ぎます。これにより、TTCの化学反応が停止します。

直ちに切片を清潔な1×3インチのガラススライド上に配置し、吻側から尾側に向かうように並べます。スライドをスキャンします。標準的なスキャナーを使用し、画像解析のために解像度を最低600 DPIに設定してください。

スキャン画像には、必ず動物の名前とメトリック定規を含めてください。最後に、スライドを裏返して背面をスキャンし、すべてのデータが収集されていることを確認します。RHPは、対照群のマウスと比較して梗塞体積を46%減少させますが、同一動物のTTCデータから得られた脳半球の腫脹には影響を与えません。

RHPは、対側半球で標準化したエバンズブルーの漏出量で定義される血液脳関門の破壊を抑制します。ここでは、RHP投与群および21%酸素曝露コントロール群の両方の代表的なTTC染色像を示します。マウスの画像の下に、それぞれの梗塞体積とエバンズブルー漏出量を記載しています。同側は脳の虚血半球を指し、対側は脳の非影響側を指します。

この手順を実施する際は、融合の22時間後にエバンズブルーを注入し、動物を犠牲にする前に2時間循環させることが重要です。この手法により、前臨床脳卒中研究分野の研究者が、マウスにおける脳卒中に対する内因性保護のメカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、血液脳関門の完全性と梗塞体積の二重定量化を通じて、RHPの神経保護効果を測定する方法を明確に理解できるはずです。