エタノール鎮静感度との急速な寛容を測定するための安価な、スケーラブルな行動アッセイ

本実験の全体的な目的は、ショウジョウバエにおけるエタノール鎮静への感受性を評価することである。これは、ハエをバイアルに入れ、エタノール蒸気にさらすことで行われる。次に、すべてのハエが鎮静されるまで、一定の間隔で各バイアル内の鎮静されたハエの数を測定する。

次に、時点を補間します。各バイアルのハエの50%が麻酔状態になったとき、その結果はショウジョウバエをエタノールで麻酔するのに必要な時間の指標となります。本日のこの手順の実演は、私の研究室の学生であるSimran Sinduが行います。実験を開始するために、新鮮な餌の入ったバイアルに、単一の性のハエを11匹ずつのグループで、最大5分間のCO2を用いて回収し、環境制御された空間にある餌入りバイアルの中で、ハエを一晩回復させます。

純粋な100%エタノールを精製水で希釈し、最終濃度を85%にしたエタノール溶液を調製します。アッセイの前に、溶液を室温に戻して一晩静置します。試験用バイアルとして使用する、清潔な空のフードバイアルを準備します。また、試験対象となるショウジョウバエの各バイアルに対して、新しい酢酸セルロースプラグ、シリコンストッパー、および1 mLのエタノール溶液を用意します。室温を20～25℃に、相対湿度を55～65%に調整します。別の担当者を指定し、バイアルの各グループに固有のコードを割り当て、後で参照できるようにコードを記録します。コードが付与されたハエのバイアルを試験室に置き、数分間順化させます。次に、空の試験用バイアルに、ハエのバイアルのコードと一致するようにラベルを貼ります。

スプレッドシートにおいて、1つの列に1つのバイアルが対応するようにコードを入力し、ハードコピーの試験ログを作成します。この試験ログをガイドとして、コードが付与されたハエ入りの餌バイアルと空の試験用バイアルを、試験室に同じ配列で配置します。その後、餌バイアルからハエを、対応するラベル付きの試験用バイアルへ1匹ずつ移します。

その後、直ちにセルロースアセテートプラグを試験用バイアルに挿入し、プラグがバイアルの上端から2 cm下の位置になるまで押し込みます。タイムゼロの評価のため、各バイアルを親指と人差し指で個別に保持します。

バイアルの底にハエを落とすため、テーブルを軽く3回叩きます。30秒間待ち、不動または死んでいるハエの数を数えます。各時間におけるバイアルごとの不動または死亡したハエの数を記録します。

ハードコピーの試験ログにおける0分時点。タイマーを0秒で開始し、直ちにセルロースアセテートに1 mLのエタノールを添加します。最初の4本のバイアルに対し、順番に5秒間隔で円を描くように攪拌します。

セット内の4本すべての試験用バイアルにエタノールが添加された時点で、試験を行います。1分、2分、3分、4分、および5分の時点で、各バイアルにシリコン栓を挿入して密封します。2番目、3番目、4番目、5番目、および6番目の各4本組のセットに、それぞれ1 mLのエタノールを添加します。

6分後に、4本1組の各バイアルLSにエタノールを添加した後、引き続きシリコンストッパーを挿入します。最初の4本のバイアルについて、各バイアルを親指と人差し指で持ち、テーブルの上に3回軽く叩いて、ハエをバイアルの底に落とします。30秒間待ち、その後、麻酔状態にあるハエの総数を数えて記録します。

ショウジョウバエが、（1）バイアルの底に立っているが歩いていない、または（2）羽を動かしているか否かにかかわらず仰向けに倒れている場合、鎮静状態としてスコアを付けます。セット内の各バイアルを、7分、8分、9分、10分、11分というスケジュールに従い、5秒間隔で処理してください。

12分時に1セット目で行ったのと同様に、2、3、4、5、および6セット目のバイアルをそれぞれテストします。1セット目の4本のバイアルを再度テストし、続いて13、14、15、16、および17分時に、それぞれ2、3、4、5、および6セット目のバイアルのテストを継続します。すべてのハエが麻酔状態になるまで、テストを継続してください。

ハードコピー試験における各バイアル内のショウジョウバエの総数を入力します。時刻0において、センサーで不動または死亡と判定されたハエの数を総数から記録します。エタノール麻酔アッセイから得られた生データは、時間の関数として活動しているハエの割合（%）に変換されました。

一次データから得られたエタノール鎮静への感受性は、鎮静時間50またはST 50として定量化されました。これは、ハエの50%が鎮静状態になるまでにかかる時間、または曲線下面積（AUC）です。このアッセイにより、神経系におけるcalnexin 14 Dに対するRNAiの効果を検出したところ、対照群と比較してエタノール感受性が低下しました。また、scabおよびrouserの変異ではエタノール鎮静感受性が増強し、happy hourの変異では対照群と比較してエタノール鎮静感受性が低下することが確認されました。

この手法は、適切に実施すれば1時間半で完了できます。