の歩行速度に対するエタノールの効果を測定するためのアッセイ
2015年4月9日
C. elegansは、エタノールが行動に与える影響を研究するための有用なモデルです。このアッセイは、這うワームの移動速度に対するエタノールの影響を定量化します。このアッセイを用いて、初期の感受性とエタノールに対する急性の機能的耐性の発生の両方を測定することができます。
この手順の全体的な目的は、異なる遺伝子型のCL器官に対するアルコールの影響を一貫した方法で定量化することである。これはまず、動物を囲むために銅のリングを埋め込んだアルコールを含むアガープレートを作成することから始まります。次に、異なる遺伝子型をそれぞれ別々に囲み、アルコールに曝します。曝露中、設定された時間点でビデオデータが収集されます。
最終ステップは、オブジェクト認識ソフトウェアを使用して各遺伝子型の速度を測定することです。最終的には、初期と後期の時間点での速度の比較を使用して、アルコールに対する異常な感受性や耐性の発達を明らかにします。特定の遺伝子型。
既存の異なるプレートで遺伝子型を比較する既存の方法に比べて、この技術の主な利点は環境変動が減少することです。一般的に、この方法に不慣れな人々は、アッセイの前日に新しいピックを使用してワームを選ぶことに苦労します。L 4段階のワームを新鮮なNGMプレートに、OP 50 E coli培養物の芝生を伴って座席に座らせ、プレートを20度セルシウスで一晩中。アッセイには標準的な非着席の60×15ミリメートルが必要です。
NGMプレートは、使用するすべてのプレートを37度セルシウスで2時間乾燥させ、蓋を外します。各試行には4枚のプレートが必要です。ここでNGMプレートの使用が重要です。
プレートの組成の違い。特に、それらの浸透圧は、行動に対するエタノールの用量応答性に強く影響する可能性があります。これは少なくとも部分的には、動物によって蓄積されるエタノールの量の変化によるものです。乾燥後、着席していないNGMプレートの各重量を測定します。
この重量を使用して、プレート上の400ミリモル重量対体積濃度を得るために必要な100％エタノールの量を決定します。次に、フォースプスを使用して、内径1.6センチメートルの銅リング4個を各プレートに溶かし、カメラで同時に見ることができるようにします。
各リングを約3秒間炎の中に入れ、それを落とさずにプレートにすぐに置きます。次に、リングを数か所に優しく押して、周囲に沿って固定します。プレートに各リングに入る株でラベルを付けます。
次に、プレート上で400ミリモル重量対体積濃度を取得するために必要な100％エタノールの量を計算します。次に、ピペットからエタノールを滴下してプレートの半分をエタノールで満たします。実験を開始する前に、すべての準備されたプレートを2時間平衡させます。
開始するには、各実験グループからワームを10匹取り、順応プレートの銅リングの中央に移動させます。これはエタノールを含まないプレートです。ワームと一緒に餌を移動させないでください。ワームの動きを減少させます。
また、ワームが掘り起こす可能性があるため、アガー表面を傷つけないようにします。プレートにロードした時間を記録し、各プレートへのワームの移動を2分以上ずらすようにし、各プレートを適切な時間間隔で個別に撮影できるようにします。各順応プレートを室温で30分間インキュベートします。
次に、アッセイプレートにワームを移動させ、順応プレートにワームを配置するために使用した順序に従って、薄い端の平らなワームを使用してピックします。細菌なしでピックします。平らなピックの上にあるワームを集めます。
スクープの動きを使用して、プレートをラボフィルムで密閉して、エタノールの蒸発による損失を最小限に抑えます。このステップで動物が移動する速度は非常に重要です。なぜなら、動物はエタノールにさらされる時間が長くなるため、プレートに配置する株を回転させることをお勧めします。まず、実験のレプリケート間で。
ワームを撮影するには、高解像度のビデオカメラ付き顕微鏡が必要です。現在、分析のために、3インチ四方のバックライトなどの均一な照明が重要です。次に、コントラストを維持するためにプレートをメディア側を上に向け、120をキャプチャするように画像分析ソフトウェアを準備します。
1フレームごとの12ビットグレースケールのタイムラプスムービーを1秒ごとに記録します。出力ファイルのサイズを小さくしながら、十分な画像解像度を保持するには、2×2のベンドモードを使用します。次に、各プレートから2分間のムービーを記録します。
最後のワームがそのプレートに配置されてから10分後。次に、ワームがプレートに配置されてから2分後の2回目の録音を行います。このデモンストレーション画像のために、ワームをプレートに配置してから30分後。
Pro plusソフトウェアが使用されますが、他の多くのソフトウェアをこの技術に適応させることができます。ムービーを2分間のセグメントとして分析します。まず、背景を平らにし、ワームオブジェクトのコントラストを強調するフィルターを画像に適用します。
メニューのプロセスを選択します。次に、フィルター、強調、次に平らにします。暗い背景と20ピックの機能幅のパラメータを設定します。
次に、銅リングと重なる円形の関心領域を使用して、各リングの動物の運動を個別に分析します。測定サブメニューのトラックオブジェクトコマンドを使用してワームを特定し、追跡します。追跡データテーブルウィンドウで、追跡オプションボタンを使用して、特定のトラックを除外し、実験のアーティファクトを制限します。
自動追跡タブで、追跡パラメータをフレームあたり400ミクロンに設定します。加速度制限を自動に設定し、最小合計トラック長を400ミクロンに設定し、主要な動きの種類をカオスに設定します。次に、追跡パラメータで、オブジェクトを部分的なトラックが21フレームの最小長を持ち、1フレームの追跡予測深度を持つように設定します。
次に、追跡プロセスを開始するには、まず自動的にすべてのトラックを見つける機能ボタンをクリックします。これにより、カウントサイズオプションのダイアログボックスと追跡ダイアログボックスが表示されます。カウントサイズダイアログボックスで、強度の範囲選択に手動オプションを選択します。
これにより、重要なしきい値ステップが提供されます。次に、強度のしきい値スライダーを調整して、暗いオブジェクトを強調する包括的な範囲を作成します。スケールの良い出発点は、0から1,500の間です。
次に、単一のワームよりも大きいまたは小さいオブジェクトを除外するためにサイズフィルターを適用します。測定メニューに移動し、測定サブメニューを選択します。これにより、カウントサイズオプションのダイアログボックスが開きます。
面積範囲を28〜120,000平方ミクロンに設定し、周囲の範囲を6〜2,500ミクロンに設定します。異常なサイズのワームを使用する場合は、これらのパラメータを調整します。次に、クリックして追跡プロセスを完了します。
追跡ダイアログボックスで続行します。ムービー映像と出力トラックが一致することを確認します。誰もが表現されていることを確認します。除外する明確な理由がない限り。
次に、ワーム以外のオブジェクトによって生成されたトラックを手動で削除します。次に、各ワームの速度を、各フレームまたは1秒ごとに移動した距離を平均して計算し、各集団のトラックの平均速度を作成します。この最終的な平均を、実験の統計分析の1つのサンプルポイントと見なします。
説明されたプロトコルを使用して、対照を含むいくつかの遺伝子型が分析されました。エタノール
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概要
この研究では、C. elegansをモデル生物として利用し、エタノールが行動、特に運動速度に与える影響を調査します。初期感度とエタノールに対する急性機能的耐性の発達の両方を測定するための行動アッセイが開発されます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動生物学
- アルコール研究
背景
- C. elegansは物質の神経学的影響を研究するための広く使用されているモデルです。
- エタノールは様々な生物において運動と行動に影響を与えることが知られています。
- 耐性の発達を理解することで、依存メカニズムへの洞察が得られます。
- 行動アッセイはモデル生物におけるこれらの影響を定量化するのに不可欠です。
研究の目的
- アルコールが異なるC. elegansの遺伝子型の運動に与える影響を定量化する。
- エタノールに対する初期感度と耐性の発達を測定する。
- 運動速度の正確な測定のためにビデオ分析を利用する。
使用された方法
- 銅製のリングを埋め込んだアルコールを含むアガープレートの作成。
- アルコールへの曝露のために異なるC. elegansの遺伝子型を別々に囲い込む。
- アルコール曝露中の設定された時間点でのビデオデータの収集。
- 物体認識ソフトウェアを使用した運動速度の測定。
主な結果
- 早期および後期の時間点における運動速度の比較により、感度の違いが明らかになります。
- 特定の遺伝子型において急性機能的耐性の発達が観察されます。
- アッセイはエタノール曝露による行動変化を効果的に定量化します。
- 得られた洞察はアルコールの行動への影響の理解に貢献する可能性があります。
結論
- 開発されたアッセイはC. elegansにおけるエタノール効果を研究するための信頼できる方法です。
- 結果はアルコール感度と耐性のメカニズムの理解を深めます。
- この研究は依存症と物質使用障害に関するより広範な研究に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative behavioral assays in C. elegans enable mechanistic de-risking of ethanol’s effects on neural function, supporting early-stage target validation for neuroactive compounds. This approach provides predictive confidence in distinguishing genetic determinants of sensitivity and tolerance, informing portfolio triage for CNS drug discovery. The assay’s reproducibility and quantitative outputs position it as a reusable platform for evaluating genetic and environmental modulators of drug response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in ethanol-induced behavioral phenotypes.
- Supports biological de-risking by isolating genetic contributions to acute sensitivity and tolerance.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurobehavioral drug programs.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative assay for evaluating locomotor responses across genotypes.
- Reduces environmental variability by corraling multiple genotypes on a single plate.
- Generates reproducible, video-based locomotion data suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral outputs with genetic and environmental manipulations relevant to CNS drug targets.
- Enables continuity from discovery-stage genetic screens to preclinical validation of neuroactive compounds.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying acute functional tolerance development.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from early genetic target validation through lead identification for CNS-active agents.
- Discovery Biology: Quantifies behavioral phenotypes to test mechanistic hypotheses about ethanol response pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantitative locomotion metrics for cross-genotype comparisons.
- Analytics: Provides statistical outputs on velocity and tolerance indices for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges genetic findings to preclinical models of drug-induced behavioral plasticity.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for evaluating diverse neuroactive compounds and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for CNS drug discovery.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability across research teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by quantifying behavioral endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic targets and compound advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling and behavioral assay setup.
- Needs high-resolution video capture and object recognition software for quantitative analysis.
- Demands cross-team standardization of plate preparation and environmental conditions.
- Adaptable to different genotypes and environmental manipulations with protocol adjustments.
- Dependent on precise control of assay variables such as plate osmolarity and ethanol concentration.
