環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

このビデオでは、次世代シーケンシングプラットフォームにおけるリードの改善を実現するため、自動ゲルサイズ選択装置の使用方法を実演します。まず、環境水サンプルを採取し、一連のフィルターに通すことで、真核生物、細菌、およびウイルスサイズの粒子を系統的に分離します。回収された細菌は、さらに遠心分離によって濃縮されます。

次に、細菌DNAを抽出します。抽出したDNAを用いて、断片化したDNAにアダプターとインデックスを組み込んだライブラリを調製します。その後、PCRによってDNAを増幅させ、サンプルを電気泳動ワークステーションにロードします。

その後、特定の範囲内のDNA断片が自動的に選択されます。チップベースのキャピラリー電気泳動によるトレース解析および追加のバイオインフォマティクス解析から、この方法により、200 base pairs未満の不要な断片のクラスター化を最小限に抑えつつ、下流解析に適した量のDNA断片が得られることが示されています。自動電気泳動スクエアステーションや常磁性ビーズ、およびその他の市販システムの主な利点は、より厳密で狭い範囲の選択が可能であり、1回のランで最大96サンプルまで処理できることです。

この手法は淡水サンプルの微生物コミュニティに関する知見を提供できますが、海水、廃水処理、植物サンプル、堆積土壌、微生物マットなど、特定のサイズ範囲を狭く選択したいあらゆるDNAサンプルに適用可能です。私たちがこの手法を考案したのは、MySEQプラットフォームのシーケンスにおいて短いフラグメントを確認したことがきっかけでした。私たちは、異なる種類のパラマグネティックビーズとその比率の検討や、手動でのゲルサイズセレクションなど、いくつかのサイズ選択アプローチを試行しました。

その後、Rangerテクノロジーを提供しているブリティッシュコロンビア州の民間企業、Coastal Genomics社との共同研究を開始し、本手順の実演を行うこととなりました。本日の実演者は、私の研究室の研究技術員であるMichael Chan、私の研究室の博士研究員であるMiguel Yi、そしてCoastal Genomics社のエンジニアであるJared Sloanです。このビデオでは、主に遊離細菌である、0.2 micronフィルターで回収された物質の精製と分析についてのみ説明しますが、フィルターから回収された他の粒子に対しても同様のアプローチが適用可能であることに留意してください。

まず、滅菌済みの20リットルのカーボイを用いて、複数の環境地点から計40リットルの淡水サンプルを採取します。105 µmのスペクトラムメッシュポリプロピレンフィルターを使用し、現場でサンプルのプレフィルターを行います。ここでは、都市部および農業の影響を受けている流域からサンプルを採取しています。

採取後、サンプルをクーラーに入れ、ラボまで搬送します。サンプルを4°Cで保存します。翌日、

サンプル回収用カーボーイをペリスタルティックポンプでEnviroCheck 1 µmサンプリングカプセルに接続し、ろ過システムを構築します。サンプリングカプセルを0.2 µmディスクフィルターに接続し、さらに2台目のペリスタルティックポンプを用いて30 kDaタンジェンシャルフローフィルターに接続します。ペリスタルティックポンプを作動させてサンプルを一連のフィルターに通すと、サンプリングカプセルを通過する際に真核細胞が分離されます。

細菌画分はメンブレンディスクフィルターで、ウイルス粒子はタンジェンシャルフローフィルターで単離されます。水ろ過システムから0.2 µmメンブレンフィルター（または複数のフィルター）を取り出します。その後、フィルターを半分に折り、50 mLチューブに入れます。

開口部を上に向けます。チューブにTween配合PBSを5 mL加えます。ろ過時に複数のフィルターを使用した場合は、フィルターごとに別のチューブを使用してください。

フィルターは4 °Cで保存するか、あるいは直ちに以下の手順で処理します。次に、滅菌済みピンセットを用いて50 mLチューブからメンブレンフィルターを取り出し、滅菌済みピンセットと滅菌済みハサミを用いてペトリ皿の上に置きます。サンプル間でフィルターを1 cm × 1 cmの大きさに切り分けます。

器具を70%イソプロパノールに浸し、DNA表面除染剤で拭き取った後、タイプ1超純水で洗浄して消毒します。フィルター片を元の50 mLチューブに戻します。滅菌ピンセットを使用して、Tween入りPBSを10 mL加え、バッファーの全量を15 mLにします。

各50 mLチューブに、直径3 mmの清潔なタングステンビーズを6個ずつ加えます。チューブをパラフィルムで密閉し、20分間激しくボルテックスします。

ボルテックス後、各サンプルのすべての懸濁液を1本の清潔な50 mLチューブにまとめます。チューブを4°C、3,300 ×gで15分間遠心分離します。遠心後、上清を捨て、ペレットを再懸濁します。

5 mLのPBS溶液に入れられた細菌細胞を、1.7 mLマイクロ遠心チューブに1 mLずつ分注し、マイクロ遠心機を用いて10,000 ×gで10分間遠心分離します。遠心後、ピペットを使用して、上清を200 µL除いたすべて除去します。サンプルを-80 °Cで保存するか、市販のDNA分離キットを用いて細菌DNAの抽出に進みます。

細菌のDNA抽出において、陰性抽出コントロールとしてPBSまたは水を用い、陽性抽出コントロールとしてE. coliを用います。DNA抽出手順の後、同一サンプルからの分注量を10mM Tris緩衝液を含む2mLチューブにまとめます。次に、10% 3M酢酸ナトリウム溶液、2体積の100%エタノール、および5µLの線状アクリルアミドを添加し、一晩沈殿させます。サンプルは-80°Cで保存してください。

翌日、サンプルを17,000 GSで30分間、4 °Cで遠心分離します。遠心後、ペレットを1 mLの氷冷70% ethanolで洗浄し、バイオセーフティーキャビネット内で5分以内にペレットを風乾させます。

その後、DNAペレットを10 millimolar Tris-CLに再懸濁します。次に、高感度蛍光核酸定量アッセイを行い、続いてマイクロボリューム分光光度計を用いてDNAの量と質を決定します。各サンプルのDNA量を決定した後、各チューブに適切な量の水を加え、濃度を約0.2 nanograms per microliterに調整します。

市販のキットを用いて、1 ngの細菌DNAからインデックス付きフラグメントのDNAライブラリを調製します。ここでは、メンテーション（mentation）として知られるトランスポゼースベースの手法を適用し、DNAの断片化とアダプター配列の組み込みを同時に行います。その後、PCRを実施して各サンプルを増幅およびインデックス化し、各フラグメントに特定のバーコードを付与するとともに、シーケンシングプラットフォームで読み取り可能なクラスター形成に必要な配列を導入します。

PCR完了後、標準的なPCR後のクリーンアップステップは省略し、各サンプルに3.5 µLのローディングバッファーを加えて、合計容量を28.5 µLにします。その後、サンプルを96ウェルプレートに移します。Rangerソフトウェアのユーザーインターフェースを使用して、プリキャストの1.5% agaroseカセットが入った電気泳動ワークステーションに96ウェルプレートをロードします。

サイズ選択ターゲットを500から800 bpに指定します。抽出量を300 µLに設定します。ランを開始します。

電気泳動ワークステーションにより、サンプルがarosカセットに自動的にロードされます。次に、カセットに電圧が印加され、ガントリー搭載のイメージングシステムを用いてaros内でのサンプルDNAの位置を特定します。ランの間ずっとこの操作が行われます。

Rangerソフトウェアで画像をキャプチャし、内部標準を用いて各サンプル中のサイズ選択されたターゲットの位置を推定します。ターゲットが特定された後、Rangerソフトウェアは各サンプルに印加する電圧を変化させ、カセット抽出ウェルへのターゲットの到達タイミングを同期させます。

最後に、電気泳動ワークステーションを用いて、抽出ウェルからTBE中のターゲットを吸引し、新しい96ウェルプレートに分注して未精製抽出物を濃縮します。その後、酢酸ナトリウム、エタノール、およびリニアアクリルアミドを用いて未精製溶出液を沈殿させ、-80 °Cで一晩静置します。サンプルを再び17,000 ×gで30分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、1 mLの氷冷70%エタノールを用いてDNAプレートを洗浄し、さらに遠心分離を行います。

サンプルを17,000 ×gで30分間遠心分離し、上清を捨てて乾燥させた後、最終的にDNAペレットを10 mM Tris-CLに再懸濁します。次に、Transpose On-Baseライブラリー調製キットに含まれているライブラリーノーマライゼーションビーズを用いて、サンプルの濃度を揃えます。最後に、次世代シーケンシングプラットフォームを用いてDNAシーケンシングを行い、シーケンシングライブラリーの品質を向上させることで、より情報量の多いリードを得ます。

8か所の異なる流域地点で採水を行い、分離した細菌画分からインデックスDNAライブラリを調製した。このエレクトロフェログラムに示すように、PCR後かつ自動サイズセレクション前の淡水サンプルから生成されたDNAライブラリは、50 base pairsから3000 base pairsまでのサイズの断片で構成されていた。ハイスループット自動プラットフォームを用いてサイズセレクションを行った後、サンプルは500から800 base pairsの狭い範囲のDNA断片となった。したがって、この自動ゲルサイズセレクションプラットフォームを利用することで、適切な収量が得られ、200 base pairs未満の不要な断片のクラスター化が最小限に抑えられた。

アルミニウムMiSeqを用いたこのライブラリーのDNAシーケンシングでは、1平方ミリメートルあたり1198 Kのクラスター密度が得られました。フィルターを通過したクラスターの割合は84.2%で、推定収量は9.2 gigabytesでした。さらに、リードの82.8%にあたる7.4 gigabytesが、30以上のクオリティスコアを有していました。

これは、この改変プロトコルを用いて環境水サンプルからシーケンスされた塩基の約83%において、少なくとも99.9%のベースコール精度が得られたことを意味します。このビデオを視聴することで、シーケンスライブラリからより情報量の多いリードを生成する方法について十分に理解できたはずです。この手順を実施する際は、目的とする微生物画分、ライブラリ調製法の選択、ターゲットのフラグメント長、およびシーケンスプラットフォームを考慮することが重要です。