環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

このビデオでは、自動ゲルサイズ選択装置を使用して、次世代シーケンシングプラットフォームでのリードを改善する方法を紹介しています。まず、環境水のサンプルが収集され、一連のフィルターを通過して、真核生物の細菌とウイルスサイズの粒子を体系的に分離します。保持された細菌は、遠心分離によってさらに濃縮されます。

次に、細菌のDNAが抽出されます。抽出されたDNAは、アダプターとインデックスが断片化されたDNAに組み込まれるライブラリを調製するために使用されます。次に、DNAをPCRで増幅し、サンプルを電気泳動ワークステーションにロードします。

その後、特定の範囲内のDNA断片が自動的に選択されます。チップベースのキャピラリー電気泳動および追加のバイオインフォマティクスによる微量の分析により、この方法により、200塩基対未満の不要なフラグメントのクラスタリングが最小限に抑えられ、ダウンストリーム分析に適した量のDNAフラグメントが得られることが実証されています。自動電気泳動スクエアステーション、常磁性ビート、その他の商用システムの主な利点は、1回の実行で最大96個のサンプルを処理できる、より狭く、より狭く選択できることです。

この方法は、淡水サンプル中の微生物群集に関する洞察を得ることができますが、海水、廃水処理、植物サンプル、堆積物土壌、微生物マットなど、基本的にサイズを絞り込む必要があるあらゆるDNAサンプルに適用することができます。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、MySEQプラットフォームの配列に短いフラグメントを見たときでした。SIには、さまざまな種類のパラビーズやパラビーズ比、手動のゲルサイズ選択アプローチなど、いくつかのサイズ選択アプローチを試しました。

その後、ブリティッシュコロンビア州の民間企業であるCoastal Genomics社との協力を開始し、Ranger技術を提供して手順を実証しました。本日は、私の研究室の研究技術者であるMichael Chanさん、私の研究室のポスドク研究員であるMiguel Yiさん、Coastal GenomicsのエンジニアであるJared Sloanさんをお迎えします。このビデオでは、0.2ミクロンフィルターで回収された材料(主に自由生物細菌)の精製と分析についてのみ説明しますが、フィルターから回収された他の粒子にも同様のアプローチを使用できることに注意してください。

この手順は、消毒された20リットルのカーボイでいくつかの環境サイトから40リットルの淡水サンプルを収集することから始めます。105マイクロメートルのスペクトルメッシュポリプロピレンフィルターを使用して、サンプルをその場で事前にろ過します。ここでは、都市部や農業の影響を受けた流域からサンプルが収集されます。

採取後、サンプルをクーラーボックスに入れ、ラボに持ち帰ります。サンプルは摂氏4度で保存します。翌日。

蠕動ポンプを介してenviro check 1ミクロンのサンプリングカプセルに接続されたサンプル収集カーボーイからなるろ過システムを設定します。サンプリングカプセルを0.2ミクロンのディスクフィルターに接続し、それを30キロダルトンのタンジェンシャルフローフィルターに接続します 2番目の蠕動ポンプを介して。蠕動ポンプをオンにしてサンプルを一連のフィルターに通すと、真核細胞がサンプリングカプセルを通過するときに分離されます。

細菌画分はメンブレンディスクフィルターで分離され、ウイルス粒子は接線フローフィルターで分離されます。0.2マイクロメートルのメンブレンフィルターまたはフィルターを水ろ過システムから取り外します。次に、フィルターを半分に折り、50ミリリットルのチューブに入れます。

開いた面を上にして。チューブにトゥイーン付きのPBSを5ミリリットル加えます。ろ過中に複数のフィルターを使用した場合は、フィルターごとに異なるチューブを使用してください。

その後、フィルターは摂氏4度で保存することも、次のようにすぐに処理することもできます。次に、滅菌鉗子を使用して、50ミリリットルチューブからメンブレンフィルターを取り外し、滅菌鉗子と滅菌ハサミでペトリ皿に置きます。サンプル間でフィルターを1センチメートルずつ1

70%イソプロパノールに浸し、DNA表面除染剤で拭き取った後、1型超純水ですすいで消毒してください。フィルターピースを同じ50ミリリットルチューブに戻します。滅菌鉗子を使用して緩衝液の総量を15ミリリットルにするために、トゥイーンでPBSの10ミリリットルを追加します。

直径3ミリメートルのきれいなタングステンビーズを50ミリリットルのチューブごとに6個加えます。チューブをパラフォームとボルテックスで覆います。20分間勢い

ボルテックスプールの後、各サンプルについて単一のきれいな50ミリリットルチューブにすべての懸濁液をプールします。チューブを3, 300GSで4°Cで15分間遠心分離します。スピン後、上清を捨て、ペレットを再懸濁します。

PBSの解決の5ミリリットルで、10、000 GSのマイクロ遠心分離機で10分間回る1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離機の管に1ミリリットルのアリコートの細菌の細胞を配って下さい。スピン後、ピペットを使用して、200マイクロリットルを除くすべての上清を取り除きます。サンプルはマイナス80°Cで保存するか、市販のDNA単離キットを使用して細菌DNAの抽出に進みます。

細菌のDNA抽出中は、ネガティブ抽出コントロールとしてPBSまたは水を使用し、ポジティブ抽出コントロールとして大腸菌を使用します。DNA抽出手順に従って、同じサンプルのアリコートを10ミリモルトリスバッファーの1つの2ミリリットルチューブにプールします。次に、10%3モル酢酸ナトリウム、2容量の100%エタノール、および5マイクロリットルの線状アクリルアミドからなる溶液を追加して、一晩の沈殿を行います。サンプルは摂氏マイナス80度で保存します。

翌日、サンプルを17, 000GSで摂氏4度で30分間遠心分離します。スピン後、ペレットを1ミリリットルの氷冷で洗います。70%エタノールは、ペレットをバイオセーフティキャビネット内で5分以内に風乾させます。

次に、DNAペレットを10ミリモルトリスに再懸濁します。CLは、高感度の蛍光核酸定量アッセイとそれに続くマイクロボリューム分光法を実施することにより、最終的にDNAの量と品質を決定します。各サンプル中のDNAの量を決定した後、各チューブに適切な量の水を加えて、濃度をマイクロリットルあたり約0.2ナノグラムにします。

市販のキットを使用して、1ナノグラムの細菌DNAからインデックス付きフラグメントのDNAライブラリを調製します。ここでは、メンテーションとして知られるトランスポーズオンベースの方法を適用して、DNA上の企業アダプター配列に同時にフラグメント化します。次に、PCRを実行してEDサンプルの増幅とインデックス作成を同時に行うことで、各フラグメントとクラスター形成に必要な配列に特定のバーコードを提供し、シーケンシングプラットフォームで読み取ることができます。

PCRの完了後、標準のPCR後クリーンアップステップをスキップし、各サンプルに3.5マイクロリットルのローディングバッファーを追加すると、合計容量が28.5マイクロリットルになります。次に、サンプルを96ウェルプレートロードに移します。96ウェルプレートを電気泳動ワークステーションに取り付け、レンジャーソフトウェアのユーザーインターフェースにプレキャスト1.5%アガロースカセットを取り付けます。

サイズ選択ターゲットを 500 から 800 の塩基ペアに指定します。抽出量を300マイクロリットルに設定します。実行を開始します。

電気泳動ワークステーションは、サンプルをarosカセットに自動的にロードします。次に、カセットに電圧を印加し、ガントリーに取り付けられたイメージングシステムを使用して、アロ内のサンプルDNAの位置を特定します。ラン全体を通して。

Rangerソフトウェアは画像をキャプチャし、内部標準を使用して、各サンプルで選択されたサイズのターゲットの位置を推定します。ターゲットが特定された後、レンジャーソフトウェアは変化します。カセット抽出ウェルへのターゲットの到着を同期するために各サンプルに印加される電圧。

最後に、電気泳動ワークステーションは、抽出ウェルからTBEのターゲットを吸引し、新しい96ウェルプレートに分注して生の出力材料を濃縮し、酢酸ナトリウムとエタノールと線状アクリルアミドを使用して生のelucianボリュームをマイナス80°Cで一晩沈殿させます。サンプルを再び 17, 000 GS で 30 分間遠心分離します。スピン後、上清を捨て、1ミリリットルの氷冷70%エタノール遠心分離機でDNA口蓋を洗浄します。

17, 000 GSで30分間のサンプルを、スーパーナト空気を捨て、乾燥させ、最後にDNAペレットを10ミリモルトリスCLに再懸濁し、塩基上の転位ライブラリ調製キットに含まれているライブラリ正規化ビーズを使用してサンプルを標準化します。最後に、次世代シーケンシングプラットフォームを使用してDNAシーケンシングを進め、次世代シーケンシングプラットフォームでより有益なリードを得ることができます。シーケンシングライブラリの品質を向上させることによって。

水サンプルは8つの異なる流域サイトで採取され、インデックスDNAライブラリーは、PCR後に淡水サンプルから生成されたこのエレクトロフェログラムDNAライブラリーに示されているように、単離された細菌画分から調製されましたが、自動サイズ選択以前は、50塩基対から3000塩基対までのサイズの断片で構成されていました。ハイスループット自動化プラットフォームを使用してサイズを選択した後、500〜800塩基対のDNA断片をサンプリングします。したがって、この自動ゲルサイズ選択プラットフォームを利用することで、適切な収量が得られ、200塩基対未満の不要なフラグメントのクラスタリングが最小限に抑えられました。

このライブラリーをアルミニウムMiSeq上でDNAシーケンシングすると、1平方ミリメートルあたり1198 Kのクラスター密度が生成されました。クラスターがフィルターを通過する割合は 84.2% で、推定収量は 9.2 ギガバイトでした。さらに、読み取りの82.8%にあたる7.4ギガバイトの品質スコアは30以上でした。

これは、この変更されたプロトコルで配列決定され、環境水サンプルに適用された基礎の約83%が少なくとも99.9%のベースコール精度を持っていたことを意味しますこのビデオを見た後、シーケンシングライブラリからより有益なリーチを生成する方法についてよく理解する必要がありますこの手順を実行するときは、ライブラリ調製の選択を目指している微生物画分を覚えておくことが重要です。 ターゲットフラグメントの長さ、およびシーケンシングプラットフォーム。