Name: 三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶ 3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイを用いたがん細胞の浸潤動態解析法。超低接着プレートでスフェロイドを作製し、基底膜様マトリックス中への浸潤を72〜96時間自動撮影で定量化する技術です。

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この作業は、国立研究動物交換・改良・削減センター（G1000121 ID no.94513)およびOracle Cancer Trustによって資金提供されました。SEは、The Institute of Cancer ResearchおよびCancer Research UK(助成金番号C309/A8274)の支援を受けています。私たちは、NIHR生物医学研究センターへのNHSの資金提供を認めています。

再現性サイズの腫瘍球の1世代<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS; 25 cm 2以上8用の5ミリリットル- 75cm 2のフラスコを10 ml）で洗浄する腫瘍細胞の単層を、（74 CMの25cm 2のまたは2ミリリットル1 mlで細胞解離酵素を追加フラスコ2）2、37℃で細胞をインキュベートする- 5分。 </li><li>顕微鏡下で細胞の剥離を確認し、完全増殖培地（75cm 2のフラスコ25 cm 2以上8ミリリットルのための5ml）で細胞解離酵素を中和します。 </li><li> 5分間500×gで遠心分離し細胞懸濁液。 </li><li> 、上清を除去し、チューブをタップし、P1000ピペットを用いて完全増殖培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁します。これは、細胞クラスターことなく、単一細胞懸濁液を得るべきです。 </li><li> （最適な細胞密度がOで各細胞株について決定する必要が2×10 4細胞/ ml -血球計数器を用いて細胞を計数し、0.5を得るために、細胞懸濁液を希釈300の腫瘍スフェロイド取得するRDER - 4日間の細胞播種12,13の後に直径500μm）を。 </li><li>無菌の容器に細胞懸濁液を移し、マルチチャンネルピ ​​ペットを使用して、よく超低付着（ULA）を96ウェル丸底プレート12に200μL/を分注します。 </li><li>インキュベーター（37℃、5％CO 2、湿度95％）でプレートを移します。 4日後、視覚的に腫瘍スフェロイドの形成を確認し、3次元浸潤アッセイを進めます。 </li></ol> 2. 3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ<ol><li>氷上でBMMを解凍します。 </li><li> -20℃でP10、P200およびP1000ピペットと滅菌チューブのために（必要な総容量に応じて、1.5ミリリットル容量以上）を滅菌フィルターチップのセットを保管してください。 </li><li>氷の上で4日目のスフェロイドを含むULA 96ウェルプレートを置きます。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに回転楕円体プレートからの増殖培地100μl/ウェルを削除します。私に向かって、このステップ角のためのヒントウェルとスフェロイドの場所の底部との接触を回避U底ウェルのnside壁;スフェロイドの乱れを最小限に抑えることができます。 </li><li>氷のように冷たいのヒントを使用して、氷のように冷たいチューブにBMMを転送します。サイトカイン誘導侵攻や薬物評価研究のため、氷のように冷たいのヒントを使用してBMMに（2×最終濃度で）試薬を加えます。例えば、S CALおよびCAL R扁平上皮癌細胞の浸潤を刺激する上皮成長因子（EGF）を使用します。 、静かに渦巻く泡の形成を回避することによって十分に混合します。 </li><li>ゆっくりウェルの内壁に向かって先端を目指し、U底ウェルにBMMの100μLを分注します。最適な画像解析のために、スフェロイドは、ウェル12の中心部に残っている必要があり 、この工程が最も重要です。 </li><li> 6複製/条件 - 5を許可する必要なすべてのウェルについて繰り返し手順2.6。必要に応じて、新たにチルド先端に変更します。 注：経験のある、ディスペンマルチチャンネルピペットを使用してそれ自体BMM。 </li><li>存在する場合、滅菌針を使用して、気泡を除去。 <ol><li>顕微鏡を用いて、視覚的にスフェロイドが中央位置にあることを確認してください。ない場合は、4℃で3分間、300×gでプレートを遠心します。これは、スフェロイドを中心に、各ウェル内に配置されていることを確認します。 </li></ol></li><li> 37℃のインキュベーターにプレートを転送し、BMMを固化することができます。 </li><li> 1時間後、マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに完全成長培地100μl/ウェルを追加します。サイトカイン誘導浸潤または薬物評価研究のために、培地（1×最終濃度）中のサイトカインまたは阻害剤が含まれます。試薬は、ステップ2.5でBMMに追加されなかった場合あるいは、（所望の最終濃度を3倍）、この時点で培地に追加します。 </li></ol> 3.自動画像取得<ol><li>サイトメーター上でのスキャンプレート間隔の駅で（仕様については、 装置材料の表を参照してください）すぐに72時間、またはより遅い侵入腫瘍細胞株のための96時間までのステップ2.10の後にゼロ（T0 =セットアップ浸潤アッセイの日は、時間からrting。 </li><li> 「Confluenceの「アプリケーションを選択します。 </li><li>回転楕円体にフォーカスがあることを確認し、必要に応じて、手動で調整し、「 設定オフフォーカス」修正。 </li><li> 「 サンプリングの設定 」の下では、ビュー（FOV）の中央のフィールドをスキャンする]を選択します。 BMMの添加に続いて、腫瘍スフェロイドは、このようにウェル全体をスキャンする必要はありません、中央の位置に残っている必要があります。 </li><li>ソフトウェアでは、プレートマップ上に強調表示することによってスキャンする井戸を定義します。 「 スキャン開始 」をクリックします。 注：スキャンは自動的に保存され、後でオフラインで確認することができます。 </li></ol> 4.自動画像解析<ol><li> 「Confluenceの「アプリケーションを選択します。 </li><li> 「分析」タブでは、APPLICを調整エーションの設定が（ 例えば 、「精度」：低、通常、高、「強度閾値」：1 - 15）はBMM（ 図1参照）内に延びる細胞プロセスおよび浸潤突起を含む回転楕円体の周りに正確なセグメンテーションを生成します。および/または種々の時点で、各腫瘍細胞株のための設定を調整します。 「Confluenceの&#39;アプリケーション措置選択FOVで、浸潤細胞で覆われたウェル領域の％。 </li><li>解析設定が適切であることを確認し、いくつかの異なるウェルをクリックすることで、プレートの他のスフェロイドのために（ すなわち、セグメント化は正確です）。分割は正確に回転楕円体の概要を示していない場合は、さらにアプリケーションの設定を調整します。 </li><li> 「 分析の開始 」をクリックします。 </li><li> 「 結果」タブで、分析の品質を確認するために、複数のウェルを確認してください。スプレッドシートプログラムにエクスポート」まあレベルデータ」。 </li><li> Repea全ての時点のt分析。科学的なグラフと選択肢の統計ソフトウェアを使用して、棒グラフの時間に対する複製ウェルおよびプロット侵入の平均％のコンフルエンス（％コンフルエンス）を計算します。 </li></ol> 5.マニュアル画像取得<ol><li>倒立顕微鏡を用いて、当該細胞株の浸潤の速度に応じて、96時間（96ウェルプレートのために、これは、約20を取る - 72まではt = 0から始まる時間間隔で各腫瘍スフェロイドのための画像を記録します - 30分）。 10X対物レンズを使用してください。浸潤領域が完全にビューの10Xフィールド内に捕捉するには大きすぎるとき4Xの目的に使用します。 </li><li>取得した各個々の画像を保存します。 </li><li>キャリブレーションのために、両方の10倍と4倍の目標を使用して、ステージの目盛り（1ミリメートル）の画像を撮影（および画像を保存）。 </li></ol> 6.手動画像解析<ol><li>選択した画像解析ソフトにステージ目盛画像を開きます。 </li><li> GRATを入力してくださいicule測定、単位（μm）と、（10Xまたは4X）使用目的やキャリブレーションを行います。この手順は、一度だけ必要です。後続の画像分析のために、単純に必要なキャリブレーション設定を再ロードします。 </li><li>浸潤アッセイの画像を開き、画像を得るために使用される顕微鏡対物レンズ（10倍または4倍）に応じて、キャリブレーション設定を選択します。 <ol><li>また、インポート画像は、撮像サイトメーター（ステップ3）で得られた倒立顕微鏡を用いて得られた画像について説明したように、手動で分析する（ 図3及び図4に示した結果を参照）。 </li></ol></li><li>スフェロイドがカバーするエリアを測定します。 <ol><li>代表的な結果（仕様は装置材料の表を参照のこと）のために、ここで使用されるソフトウェアでは、「メジャー」に移動し、「カウント/サイズ」を選択します。 「ファイル」、次に「設定ロード」を選択し、予め定めASSAを選択Y設定。そして、「カウント」を選択します。回転楕円体は、その後、正確にセグメント化されるべきです。 </li><li>代わりに「魔法の杖/トレース]ウィンドウを開くには、「オブジェクトをマージ/描画&#39;を「編集」に移動します。回転楕円体画像をクリックするとセグメンテーションを得るために、ワンドのカーソルを使用してください。手動でマウスを使用して、回転楕円体の輪郭を描くために（「 魔法の杖」ウィンドウで）「トレース」を選択します。 </li></ol></li><li>スプレッドシートに異なるパラメータ（面積、直径、周囲など ）のエクスポート測定。スプレッドシート上のレコードの関連画像情報（ 例えば 、ウェル数、相対時点）。 </li><li>科学的なグラフや統計ソフトウェアを使用して、時間に対する複製スフェロイド（侵略）の平均面積をプロットします。あるいは、線形GRAとして対時間領域に対するT = 0そしてプロット浸潤（％のT0）において、各時点でスフェロイド面積の変化を計算しますペーハー。 </li></ol>

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</ol>

すべての著者は、利害の競合する競合を宣言しません。

（神経膠芽腫とSCCHN）ここで説明する2つの腫瘍モデルは、具体的には、それらが効果的な治療法12に対する満たされていない必要性と臨床的に関連する局所浸潤癌であるように私たちの3Dアッセイを例示するために選択しました。薬物治療、 インビトロ薬力学（PD）バイオマーカーの変化の評価BMMおよび/ ​​または全体によって腫瘍球の侵入の免疫蛍光分析からの細胞回復を可能にする具体的な市販の試薬 ​​を使用し、次のウェスタンブロットまたは溶解物の免疫アッセイによって容易に行うことができ、次の染色をマウントします。 この浸潤アッセイは、in vitro薬物スクリーニングでの将来のための半固形培地ので、特に適切なへの腫瘍細胞の浸潤の迅速かつ再現性の評価に有用な技術です。癌細胞は、それらが腫瘍スフェロイドで示される「マイクロ腫瘍」から広がるように、3Dのようにマトリックスに侵入し、extracellul内に延びますARマトリックスのような環境。アッセイの真の三次元性が平坦とは異なる細胞形態に明らかである固体基板上に移動させるとき、付着形態の細胞が前提としています。侵入の程度は容易に、または画像化ソフトウェアと組み合わせて、標準的な顕微鏡を用いて、自動読み出しを可能にする、イメージングサイトメーターのいずれかを使用して定量します。さらに、この方法は、（細胞株は、蛍光タンパク質を発現するか、蛍光色素で予め標識付き例えば）13蛍光イメージングに適しています。 U字型のウェル内に回転楕円体の中心位置を乱す恐れがある場合の方法は、BMMの添加によって表されるだけの重要なステップで実行するのは簡単です。これは、異なる焦点面におけるスフェロイドと、次善の画像解析をもたらすことができます。これは、各ウェルに慎重にゆっくりとBMMを追加することが重要です。 BMMの添加後に、プレートをチェックすることをお勧めします顕微鏡下およびローカリゼーションが許容できないとみなされた場合、これは穏やかな遠心分離によって改善することができます。経験では、これはほとんど必要ありません。この方法は、堅牢かつ非常に再現性であるが、実験間の変動は、BMMの異なるバッチで発生する可能性があります。これを回避するために、一連の研究を完了するために、単一バッチから十分BMMを購入することが望ましいです。 （そのようなアッセイのためのような）方法の限界は、腫瘍細胞は、おそらく、アッセイの時間枠の間に受ける浸潤および増​​殖を区別するのが困難です。細胞の倍加時間を考慮し、またはそのようなサイトカラシンDなどの細胞周期阻害剤を導入することができるが、制御または明らかに、特に急速に成長する腫瘍細胞を、それらのために、腫瘍進行のこれらの二つの異なる側面を区別することは容易ではないことより「広大」のではなく、浸潤、侵入パターンを持っています。このためにそれは並列3D増殖アッセイは、任意の阻害または刺激剤の具体的な効果を評価するために実行されることが示唆されます。注意深い用量応答研究が行われている場合、それは、増殖に対する影響を最小限の濃度を選択することも可能です。例えば、我々はHSP90は17-AAGは、24時間で、50％（GI 50）12によって3Dの成長を阻害する濃度以下の濃度ですでにU-87 MG 3D腫瘍スフェロイドの浸潤を阻害する阻害することを示しました。 一方、このアッセイの重要性は、他の標準的な浸潤アッセイ（ 例えば 、フィルタに基づくアッセイまたは3Dマトリックス1中に単一の細胞の浸潤）と比較して、腫瘍細胞が似ている、回転楕円体から周囲のマトリックスに侵入することです&quot;したがって、マイクロ腫瘍」または「マイクロ転移」、とは、アカウントに腫瘤の病態生理学の重要な側面を取ります。我々は、本発明の方法は、情報を提供します最初にスフェロイドを残し、また、個々に、単一細胞をBMMにより遠い領域に達すると、腫瘍細胞の集団行動。さらに、腫瘍球内の細胞は、遺伝子発現の変化を介して、移動および浸潤を促進することができ、低酸素および栄養枯渇が発生する可能性があり、このような特徴は、2Dのアッセイには存在しません。また、これのすべては、より複雑な3D分析が容易に標的検証および創薬に使用することができるように、具体的な96ウェルプレートを使用することにより、高スループットフォーマットと最新の画像技術で利用可能です。 我々は、本発明の方法は、腫瘍細胞の浸潤のさらなる側面に対処するためのさらなるアプリケーションを収容することができます。具体的には、余分な複雑さは、回転楕円体自体または周囲のマトリックスの中に、例えば、線維芽細胞および/または内皮細胞のような宿主細胞の添加によって想定され得ます。これはまた、異なる同時の使用により（剛性の観点からだけではなく、変更することができますBMMのncentrations）だけでなく、組成の点で（採用腫瘍モデルの特定の組織/器官に依存して、他の成分を添加することにより：乳癌17）のための脳の癌16とコラーゲン例えば、テネイシン。 同様のセットアップ（スフェロイド及びイメージングの発生）は、腫瘍スフェロイドは、複雑な組織12または他の細胞特異的オルガノイド（ 例えばためのアストロサイトとに似た胚様体と共培養され、3D、組織浸潤を評価するために適合させることができます神経膠腫消化管癌の18または陰窩の文化）が、さらなる作業が自動化された画像解析を有効にする必要があります。

古典的な抗癌剤の開発は、腫瘍細胞の増殖を阻害し、かつ/またはプログラムされた細胞死（アポトーシス）を促進する細胞毒性薬をスクリーニングするためのインビトロ細胞ベースアッセイの使用に大きく集中しています。より最近では、努力は、悪性細胞増殖の基礎となる分子原因の阻害剤の開発と標的療法に向かって移動しています。いくつかの見事な結果にもかかわらず、そのような薬剤は、多くの場合、薬剤耐性の急速な発達と関連しています。これは、癌死亡の大部分の原因である腫瘍細胞の浸潤性および転移能であり、その再発性疾患はしばしばより攻撃的な表現型を示すことを考えると、それは、新規に同定するために、インビトロ実験モデルにおいて 1,2相補考慮することも論理的です癌のこれらの追加キー「顕著な特徴」を阻害する薬剤。 悪性進行の間に、腫瘍細胞は、取得します周囲の組織に侵入および/または遠隔臓器（転移）に拡散する能力。癌細胞は浸潤突起3,4を形成することにより基底膜を貫通します。これらの構造は、アクチンフィラメント、特定の接着タンパク質およびプロテイナーゼで富化一括腫瘍細胞の運動性及び細胞外マトリックス（ECM）5の分解に関与しているされています。浸潤突起は、ECMに延び、腫瘍細胞の浸潤のために重要であり、また、血行性（またはリンパ）播種および転移を促進する、脈管に溢出すると考えられています。 インビトロでの腫瘍細胞の浸潤を評価するための現在の標準的な方法は、以下のものが挙げられます。トランスウェルベースまたはボイデンチャンバーアッセイ単一細胞懸濁液は、ECM由来タンパク質の厚い層で被覆されたフィルタの上に播種した2,6。次いで、細胞を侵入し、化学誘引物質に反応して、下部チャンバーに移動します。一般的に使用されるECMタンパク質は、I型コラーゲン、または基底膜の天然の組成を模倣する基底膜様マトリックス（EHS腫瘍7から派生BMM、 例えば 、マトリゲル、）です。 フィルタベースのボイデンチャンバー型アッセイ8の代わりに、細胞は、それらがゲルに侵入個別にまたは集合的に、次に単層を形成し、（線維芽細胞を添加してもよいた）ECMゲルの上に播種することができます。浸潤は、ゲル表面9から走行浸潤細胞および/ ​​または距離の数の点で測定することができます。通常、細胞は、周囲のマトリックス2,6,10,11に腫瘍塊から侵入することを可能にするECMのゲル状の2つの層の間に配置された-腫瘍細胞はまた、完全にマトリックス中にいずれかの単一細胞懸濁液として、またはスフェロイドとして埋め込 ​​むことができます。 ここで説明した3次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイはhighlを使用して迅速、自動化侵入システムを提供しますウェルあたり1スフェロイドと、96ウェルプレートフォーマットでY再現性、標準化された方法12。 BMMは、腫瘍細胞が、スフェロイド本体から侵入先の半固体マトリックスを提供するために、各ウェルに直接添加されます。 96時間 - 腫瘍細胞浸潤の程度は、72の期間にわたって間隔でモニターされます。この方法は、上記のインビトロ浸潤アッセイで過電流、次のような利点を提供します：腫瘍細胞は、腫瘍の微小領域またはミクロ転移を模倣3D構造に編成されています。腫瘍スフェロイドのサイズは非常に再現性があります。浸潤アッセイは、二次プレートに移動する必要なく、腫瘍スフェロイド開発同じプレート中でその場で行われます。自動画像解析の最新技術と組み合わせる方法は、高含有量と腫瘍細胞の浸潤のハイスループット分析の両方を可能にします。 画像分析は、96ウェルをスキャンイメージングサイトメーターを用いて行われます10分以内にプレート。合流アプリケーションを使用することにより、浸潤の程度および速度は、単一の細胞によって、または細胞クラスターは、腫瘍スフェロイドから拡散及びマトリックスに侵入するのいずれかによって達成動的に測定することができます。低いスループットのために、画像解析のための別の方法は、倒立顕微鏡と標準画像化ソフトウェアの使用に基づいて、提示されます。

<table><tbody><tr><td>Corning Matrigel basement membrane matrix</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>凝固を防ぐため 4 &amp;deg;C で保存し、冷却したピペットチップを使用して分注すること</td></tr><tr><td>Cultrex basement membrane extract, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>凝固を防ぐため 4 &amp;deg;C で保存し、冷却したピペットチップを使用して分注すること</td></tr><tr><td>超低接着 96-ウェルプレート</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>100 &amp;mu;l の 1% BSA (w/v) 水溶液を 100 &amp;mu;g の EGF に加える。この溶液 25 &amp;mu;l に 4,975 &amp;mu;l の RHB-A Medium を加え、5 &amp;mu;g/ml のワーキングストックを作成する。分注して -20 &amp;deg;C で保存すること</td></tr><tr><td>RHB-A medium</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>EGF の希釈用</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>使用前に 37 &amp;deg;C のウォーターバスで温めること</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>使用前に 56 &amp;deg;C で加熱し、補体を不活化させること</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>細胞解離溶液</td></tr><tr><td>Celigo サイトメーター</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>画像キャプチャおよび解析用の専門機器。顕微鏡による手動の画像キャプチャおよび独立した画像解析ソフトウェアでの代用も可能</td></tr><tr><td>IX70 倒立顕微鏡</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>手動画像キャプチャ用にカメラと共に使用</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394 デジタルカメラ</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>手動画像キャプチャ用に顕微鏡に取り付け</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>手動画像キャプチャのためにカメラと顕微鏡を制御するソフトウェア</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>スフェロイドサイズの手動測定用スタンドアロン画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>科学的グラフ作成および統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>科学的グラフ作成および統計ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

三次元（3d）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

周囲の正常組織の浸潤は、一般に、腫瘍（良性とは対照的に）、悪性の主要な特徴であると考えられています。特に、いくつかの癌（ 例えば 、 多形性膠芽腫および頭頸部の扁平上皮癌などの脳腫瘍- SCCHN）のためには、深刻な罹患率の原因であり、生命を脅かすでも遠隔転移の不存在下であることができます。また、再発した癌は、残念ながら、多くの場合、現在より攻撃的な表現型での処理を以下に示します。したがって、標準的な抗増殖剤に対して相補的であり得る新規治療法を提供するために、侵入のプロセスを標的とする機会があります。今まで、この戦略は、侵入の詳細な分析および薬物スクリーニングに適した強固な、再現可能なアッセイの欠如によって妨げられてきました。ここでは、単純なマイクロプレート法を提供する（均一に基づいて、自己組織化3D腫瘍スフェロイド）のようなSTUのための大きな可能性を秘めています死にます。我々はまた、ヒト神経膠芽腫細胞株とターゲットと上皮成長因子受容体（EGFR）阻害剤に対する耐性の発達を強化マトリックス浸潤能と関連しているSCCHNモデルを使用してアッセイプラットフォームを例示します。単にデジタル画像解析を標準顕微鏡および画像キャプチャを必要とするイメージングサイトメーターおよび秒を使用して、1：我々はまた、半自動定量の二つの代替方法を提供します。

3Dスフェロイド腫瘍の浸潤が図1に概略的に示した単純な、再現可能な、自動化された方法を用いて評価する：再現可能なサイズの腫瘍スフェロイドをULA 96ウェル丸底プレートに細胞をプレーティングすることによって得られます。 4日後に開始スフェロイドはBMMに埋め込まれています。これは、腫瘍細胞が侵入し、回転楕円体の外に広がっているに半固体の構造を提供します。スフェロイドは、各ウェルの底に、中央に配置され、BMMへの侵入を容易に72まではt = 0から開始した間隔で監視されている - イメージングサイトメーターを用いて96時間。これは完全に自動化された画像解析を提供することができます。 癌細胞の浸潤の異なるタイプの例は、 図2に示されている- 。4極めて悪性のヒト多形性膠芽腫 （GBM）細胞株U-87 MGは、タイト、球状三次元構造を形成し、その中のローカル脳腫瘍を例示するためにここで使用されます侵略は、キー生命を脅かすです特徴。一度BMMに埋め込 ​​まれた、典型的な「スターバースト」侵入パターン12で拡散U-87 MGスフェロイドからの細胞。腫瘍細胞は、半径方向にそれらが3次元の形状を維持したマトリックス内に延びます。 BMM中に延びる細胞プロセスの詳細および浸潤突起による腫瘍細胞浸潤の程度は、明らかであるとき、U-87 MGスフェロイドについては、図2に示すように、プロセスは、72時間の期間にわたって続きます。画像を使用して完全に自動化された画像解析は、フローサイトメーター、経時的腫瘍細胞の浸潤の正確な定量を可能にします。自動分析がU-87 MG回転楕円体からBMMに伸びる細胞突起の周りにセグメンテーションを生成し、図1に示すように、図2の定量化が得られます。この細胞株について、腫瘍スフェロイド体が侵入面積の測定から除外されることに注意してください。 invasの異なるパターンイオンは、人間の頭頸部扁平上皮癌細胞株によって表示されました。 CAL SおよびCAL Rは同質であるが、CAL Sに対しては敏感であり、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤に耐性の14 CAL R。 EGF、EGFの濃度（2.5 ngの/ mlまで）増加させたとして、しかしBMM（ 図3）に侵入も細胞株の非存在下では、スフェロイドは「芽」に見えます。 EGFのより高い濃度（40及び80 ngの/ mlで）での浸潤の程度が低下しました。これは、以前15を報告された侵入の点でEGFに対する古典ベル型用量応答と一致しています。 20 ngの/ mlのEGFで、CAL S細胞ながらCAL Rスフェロイドの本体から押し出され、指状突起は、72時間（ 図3）の後に、低侵襲性でした。スフェロイドは、細胞株との間の最大の違いのために20ng / mlのEGFを含む（BMMに入れた後に、この差動侵入は48時間明らかでした）および72時間後に最大（ 図4）。これらの画像は、U-87 MGに関しては、イメージングサイトメーターを使用して迅速に取得しました。しかし、この場合には、別の方法を例示するために、侵入の程度は、スタンドアローンの画像解析ソフトウェアを用いて手作業で定量し、グラフィカルに提示されている（ 図3及び4）。これらの結果は、具体的には、薬剤耐性、浸潤性の表現型に拮抗します化合物をスクリーニングするために利用することができる薬剤感受性と耐性細胞間の表現型の違いを示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> 3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイの1概観図 。ワークフローはちょうどBMMへの埋め込み後の方法は、U-87 MG神経膠芽腫スフェロイドの代表画像を含むことを含むステップを示している（上のパネルを、T = 0）および浸潤した後<html> BMMへ（下のパネル; tは72時間を=）浸潤細胞によって覆われた面積を測定し、セグメンテーションとありません。バー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> 図BMMへのU-87 MG神経膠芽腫の回転楕円体の侵入の2時間コース。U-87 MGはBMMに3Dの侵入を監視し、イメージングサイトメーターを用いて72時間まで定量した回転楕円体。（A）代表的な画像との（B）定量腫瘍細胞浸潤を示しています。バー=500μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 3再 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; 図3. CAL R（抵抗性）とCAL S（敏感）腫瘍スフェロイド侵入。（A）代表的な画像とEGFの用量依存的なCALのRおよびCAL S腫瘍スフェロイド侵入の（B）手動定量化が示されています。バー=500μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> 図4。Bに配置された場合、CAL R（耐性）スフェロイドからの細胞は、CAL S（敏感）腫瘍スフェロイドより侵襲的ですEGF刺激CAL R腫瘍スフェロイドがCAL Sより顕著侵攻。（A）代表的な画像と、（B）浸潤を手動で定量化を示す時には、MM。示されています。バー=500μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

本手法の全体的な目的は、腫瘍細胞浸潤のin vitroでの半自動化3次元マイクロプレートアッセイを提供することです。これは、まず超低接着ラウンドボトム96ウェルプレートを用い、各ウェルに1つずつ、再現性のあるサイズの腫瘍スフェロイドを懸濁状態で形成させることで達成されます。次のステップでは、培地の一部を除去し、基底膜様マトリックス（BMM）を各ウェルに直接添加して半固体マトリックスを形成させ、腫瘍細胞がスフェロイド本体からこのマトリックス内へと浸潤するようにします。次に、72から96時間の間、一定の間隔で腫瘍スフェロイドの浸潤をモニタリングし、その間にサイトメーターによる自動取得または顕微鏡による手動取得で画像を取得します。最終ステップとして、自動サイトメーターまたはイメージングソフトウェアを用いて腫瘍細胞の浸潤を解析します。最終的に、この3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイは、より生理学的関連性が高く、ターゲットバリデーションや薬剤スクリーニング研究に適した形式で、in vitroにおけるがん浸潤をモデル化するために使用されます。この手法は、がん研究におけるターゲットバリデーションや薬剤スクリーニングで通常用いられる単純な二次元細胞増殖アッセイを補完するものと考えています。なぜなら、がんの進行における重要な側面である浸潤を、生理学的に適切な三次元形式で調査することが可能になるからです。私がこの手法を考案したのは、マイクロプレート上での3D tumor pheの増殖を最適化した時でした。同じセットアップを使用して浸潤についても検証できれば有用だと考え、各ウェルから培地の一部を除去し、それを基底膜様のマトリックスに置き換えるという簡便な方法で結果を得ることができました。BMMの播種後、各ウェルの中心にステロイドを保持させることは、慣れるまで難しい場合があります。そのため、この手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。ステロイドが異なる焦点面に位置すると、画像解析の結果が不十分になる可能性があります。経験を積むことで、このようなケースは稀ですが、必要であれば、プレートを緩やかに遠心分離することでプロセスを促進させることができます。BMMの全工程をオーバーナイトで氷上で行うため、P 10、P 200、P 1000ピペット用の滅菌フィルターチップおよび滅菌チューブを-20°Cで保管しておきます。また、4日間培養したステロイドを含む超低接着96ウェルプレートを氷上に置きます。マルチチャンネルピペットを使用し、スパロウプレートの各ウェルから増殖培地を100 µLずつ静かに除去します。この操作では、チップの先端をU字型底面のの内壁に向か줍니다。ウェルの底面およびスフェロイドの存在する箇所に接触しないように十分注意してください。ステロイドへの影響を最小限に抑えるため、氷冷したチップを用いてBMMを氷冷チューブに移します。サイトカイン誘発性浸潤または薬剤評価試験を行う場合は、氷冷したチップを使用してBMMに試薬を添加します。例えば、Cal Sおよびcal r扁平上皮癌細胞の浸潤を刺激するために、上皮成長因子（EGF）を使用します。次に、BMM 100 µLをウェル内にゆっくりと分注します。この際、チップの先端をウェルの内壁に向けてください。このステップが最も重要です。光学画像解析のため、ステロイドはウェルの中心に留まるようにしてください。この手順を必要なすべてのウェルで繰り返し、条件ごとに5〜6回の繰り返し（リプリケート）を設けます。必要に応じて、滅菌針を用いて冷やした新しいチップに交換してください。気泡がある場合は除去します。顕微鏡を用いて、ステロイドが中心に位置しているかを目視で確認してください。中心にない場合は、プレートを4°Cで300 ×g、3分間遠心分離します。これにより、各ウェルの中心にステロイドが配置されます。次に、プレートを37 °Cのインキュベーターに移し、1時間後にBMMを凝固させます。マルチチャンネルピペットを使用して、完全増殖培地、またはサイトカイン誘発浸潤や薬剤評価研究用の溶液を、1ウェルあたり100 µLずつ静かに加えます。自動画像取得のため、培地にサイトカインまたは阻害剤を添加します。サイトメーターを用いて、一定の間隔でプレートをスキャンします。時刻0から、コンフルエンスアプリケーションを選択してください。次に、ステレオ顕微鏡の焦点が合っているか確認します。必要に応じて手動で焦点を調整し、サンプリング設定にてフォーカスオフセットを固定してください。セレクターで中央の視野を1箇所スキャンします。BMMの添加後、腫瘍ステロイドは中央位置に保持されているはずです。したがって、ソフトウェアでウェル全体をスキャンする必要はありません。プレートマップ上でハイライトして、スキャンするウェルを指定します。次に、「start scan」をクリックします。自動画像解析を行う場合は、「confluence application」を選択してください。解析タブでアプリケーション設定を調整し、細胞突起やBMM内に伸展するインベーダー・ポディア（invader podia）を含む、ステロイド周囲の精密なセグメンテーションを行ってください。各腫瘍細胞株または各タイムポイントに応じて設定を調整します。プレート内の他のステロイドについても解析設定が適切であるか、いくつかの異なるウェルをクリックして確認してください。セグメンテーションでステロイドの外形が正確に抽出されない場合は、アプリケーション設定をさらに調整してください。「results」タブにある「start analysis」をクリックします。ウェルレベルのデータをスプレッドシートプログラムにエクスポートする前に、複数のウェルを確認して解析品質を検証してください。すべてのタイムポイントで分析を繰り返し、その後、繰り返しウェルの平均コンフルエンス率および浸潤率を算出し、時間の経過に伴う変化を棒グラフで作成します。手動の画像取得には、任意の科学的グラフ作成および統計ソフトを使用し、10x対物レンズを装着した倒立顕微鏡を用いて、各腫瘍ステロイドの画像を一定の間隔で記録します。T = 0から開始し、T = 72〜96時間まで記録します。対象となる細胞ライニングの浸潤速度に応じて、浸潤領域が広すぎて10倍の視野に完全に入りきらない場合は、Forex対物レンズを使用してください。手動画像解析のために、取得した個々の画像をそれぞれ保存します。ステージグラフ画像を画像解析ソフトで開きます。校正に使用するソフトウェアは、ステージマイクロメーターの画像を用いて選択します。10xおよび4xの両方の対物レンズを使用してください。グラフィック測定値、単位、および使用した対物レンズを入力し、校正を実行します。このステップは、その後の画像解析のために一度だけ必要です。必要なキャリブレーション設定を再度読み込んでください。次に、浸潤アッセイの画像を開き、画像の取得に使用した顕微鏡対物レンズに応じたキャリブレーション設定を選択します。本手法で使用するソフトウェアを用いて、ステロイドが被覆している面積を測定します。[Measure]に移動し、[Count Size]を選択します。[While]を選択してから[Load Settings]に進み、あらかじめ設定されたアッセイ設定を選択してください。次に「count」を選択します。これにより、ステロイドが正確にセグメント化されます。測定値は異なるパラメータとしてスプレッドシートにエクスポートし、該当する画像情報をスプレッドシートに記録します。最後に、科学用グラフ作成および統計ソフトを用いて、反復試行したステロイドまたは浸潤の平均面積を時間に対してプロットします。ここでは、脳腫瘍の浸潤の例として、U 87 MG グリオブラストーマ細胞株で観察されたがん細胞の浸潤を例に示します。BMM細胞に埋め込まれると、細胞は典型的なスターバースト状の浸潤パターンで広がり、この過程を72時間にわたって追跡します。完全自動化された画像解析。イメージサイトメーターを使用することで、細胞突起のセグメンテーションを行い、腫瘍細胞浸潤の精密な定量化が可能になります。なお、本細胞株において、ステロイドボディは浸潤領域の測定から除外されることに注意してください。完全自動化された画像解析を容易に実施でき、腫瘍細胞浸潤の経時的な定量化が可能です。ヒト扁平上皮頭頸部同遺伝的ながん細胞株において、異なる細胞浸潤パターンが示されます。Cal S細胞株はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に感受性を持ち、CAL R細胞株は耐性を持っています。EGF不在下では、どちらの細胞株もBMMへの浸潤を示しませんでした。EGF存在下では、Cal arsステロイドの主細胞体から指状の突起が押し出されました。Cal s細胞は72時間後の浸潤性が低い方でしたが、このケースの画像はイメージサイトメーターを用いて迅速に取得されており、代替手法の例として、浸潤度はスタンドアロンの画像解析ソフトウェアを用いて手動で定量化されました。この手順を行う際は、各細胞株において、ステロイド形成能、細胞播種密度、マトリックス組成、および画像・解析設定を最適化する必要があることに留意することが重要です。本手順に続き、同様の手法を応用して3D組織浸潤を評価することも可能です。例えば、複雑な組織を模倣するために胚体と共培養した腫瘍や、あるいは神経膠腫に対するアストロサイト、胃腸がんに対するクリプト培養、または肝細胞癌や大腸がん転移に対する肝臓などの他のオルガノイドを用いることが考えられます。

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

このビデオでは、腫瘍スフェロイドとT細胞の三次元共培養を確立する方法を示します。腫瘍スフェロイドを含むマイクロウェルを有するアガロースキャストを調製し、続いてT細胞を添加する。インキュベーション後、このセットアップにより、制御された3次元環境でT細胞と腫瘍スフェロイドとの相互作用を研究することができます。...

腫瘍スフェロイドにおける浸潤T細胞の三次元共培養モデル

出典:Guyon, J., et al.膠芽腫の3Dスフェロイドモデル. J. Vis. Exp.

腫瘍細胞浸潤の3次元スフェロイドモデルの生成

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の...

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro...

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。...

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。...

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

浸潤は、がんの発生と進行における主要な生物学的現象です。このプロセスは、腫瘍微小環境の非腫瘍性細胞および成分の影響を受けます。この研究の目的は、三次元(3D)培養を使用して in vitro...

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

学ぶ 3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイを用いたがん細胞の浸潤動態解析法。超低接着プレートでスフェロイドを作製し、基底膜様マトリックス中への浸潤を72〜96時間自動撮影で定量化する技術です。

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

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