三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

本手法の全体的な目的は、腫瘍細胞浸潤のin vitroでの半自動化3次元マイクロプレートアッセイを提供することです。これは、まず超低接着ラウンドボトム96ウェルプレートを用い、各ウェルに1つずつ、再現性のあるサイズの腫瘍スフェロイドを懸濁状態で形成させることで達成されます。次のステップでは、培地の一部を除去し、基底膜様マトリックス（BMM）を各ウェルに直接添加して半固体マトリックスを形成させ、腫瘍細胞がスフェロイド本体からこのマトリックス内へと浸潤するようにします。

次に、72から96時間の間、一定の間隔で腫瘍スフェロイドの浸潤をモニタリングし、その間にサイトメーターによる自動取得または顕微鏡による手動取得で画像を取得します。最終ステップとして、自動サイトメーターまたはイメージングソフトウェアを用いて腫瘍細胞の浸潤を解析します。最終的に、この3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイは、より生理学的関連性が高く、ターゲットバリデーションや薬剤スクリーニング研究に適した形式で、in vitroにおけるがん浸潤をモデル化するために使用されます。

この手法は、がん研究におけるターゲットバリデーションや薬剤スクリーニングで通常用いられる単純な二次元細胞増殖アッセイを補完するものと考えています。なぜなら、がんの進行における重要な側面である浸潤を、生理学的に適切な三次元形式で調査することが可能になるからです。私がこの手法を考案したのは、マイクロプレート上での3D tumor pheの増殖を最適化した時でした。同じセットアップを使用して浸潤についても検証できれば有用だと考え、各ウェルから培地の一部を除去し、それを基底膜様のマトリックスに置き換えるという簡便な方法で結果を得ることができました。

BMMの播種後、各ウェルの中心にステロイドを保持させることは、慣れるまで難しい場合があります。そのため、この手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。ステロイドが異なる焦点面に位置すると、画像解析の結果が不十分になる可能性があります。経験を積むことで、

このようなケースは稀ですが、必要であれば、プレートを緩やかに遠心分離することでプロセスを促進させることができます。BMMの全工程をオーバーナイトで氷上で行うため、P 10、P 200、P 1000ピペット用の滅菌フィルターチップおよび滅菌チューブを-20°Cで保管しておきます。また、4日間培養したステロイドを含む超低接着96ウェルプレートを氷上に置きます。

マルチチャンネルピペットを使用し、スパロウプレートの各ウェルから増殖培地を100 µLずつ静かに除去します。この操作では、チップの先端をU字型底面のの内壁に向か줍니다。ウェルの底面およびスフェロイドの存在する箇所に接触しないように十分注意してください。

ステロイドへの影響を最小限に抑えるため、氷冷したチップを用いてBMMを氷冷チューブに移します。サイトカイン誘発性浸潤または薬剤評価試験を行う場合は、氷冷したチップを使用してBMMに試薬を添加します。例えば、Cal Sおよびcal r扁平上皮癌細胞の浸潤を刺激するために、上皮成長因子（EGF）を使用します。

次に、BMM 100 µLをウェル内にゆっくりと分注します。この際、チップの先端をウェルの内壁に向けてください。このステップが最も重要です。

光学画像解析のため、ステロイドはウェルの中心に留まるようにしてください。この手順を必要なすべてのウェルで繰り返し、条件ごとに5〜6回の繰り返し（リプリケート）を設けます。必要に応じて、滅菌針を用いて冷やした新しいチップに交換してください。

気泡がある場合は除去します。顕微鏡を用いて、ステロイドが中心に位置しているかを目視で確認してください。中心にない場合は、プレートを4°Cで300 ×g、3分間遠心分離します。これにより、各ウェルの中心にステロイドが配置されます。

次に、プレートを37 °Cのインキュベーターに移し、1時間後にBMMを凝固させます。マルチチャンネルピペットを使用して、完全増殖培地、またはサイトカイン誘発浸潤や薬剤評価研究用の溶液を、1ウェルあたり100 µLずつ静かに加えます。

自動画像取得のため、培地にサイトカインまたは阻害剤を添加します。サイトメーターを用いて、一定の間隔でプレートをスキャンします。時刻0から、コンフルエンスアプリケーションを選択してください。

次に、ステレオ顕微鏡の焦点が合っているか確認します。必要に応じて手動で焦点を調整し、サンプリング設定にてフォーカスオフセットを固定してください。

セレクターで中央の視野を1箇所スキャンします。BMMの添加後、腫瘍ステロイドは中央位置に保持されているはずです。したがって、ソフトウェアでウェル全体をスキャンする必要はありません。

プレートマップ上でハイライトして、スキャンするウェルを指定します。次に、「start scan」をクリックします。自動画像解析を行う場合は、「confluence application」を選択してください。

解析タブでアプリケーション設定を調整し、細胞突起やBMM内に伸展するインベーダー・ポディア（invader podia）を含む、ステロイド周囲の精密なセグメンテーションを行ってください。各腫瘍細胞株または各タイムポイントに応じて設定を調整します。プレート内の他のステロイドについても解析設定が適切であるか、いくつかの異なるウェルをクリックして確認してください。

セグメンテーションでステロイドの外形が正確に抽出されない場合は、アプリケーション設定をさらに調整してください。「results」タブにある「start analysis」をクリックします。ウェルレベルのデータをスプレッドシートプログラムにエクスポートする前に、複数のウェルを確認して解析品質を検証してください。

すべてのタイムポイントで分析を繰り返し、その後、繰り返しウェルの平均コンフルエンス率および浸潤率を算出し、時間の経過に伴う変化を棒グラフで作成します。手動の画像取得には、任意の科学的グラフ作成および統計ソフトを使用し、10x対物レンズを装着した倒立顕微鏡を用いて、各腫瘍ステロイドの画像を一定の間隔で記録します。T = 0から開始し、T = 72〜96時間まで記録します。

対象となる細胞ライニングの浸潤速度に応じて、浸潤領域が広すぎて10倍の視野に完全に入りきらない場合は、Forex対物レンズを使用してください。手動画像解析のために、取得した個々の画像をそれぞれ保存します。ステージグラフ画像を画像解析ソフトで開きます。

校正に使用するソフトウェアは、ステージマイクロメーターの画像を用いて選択します。10xおよび4xの両方の対物レンズを使用してください。グラフィック測定値、単位、および使用した対物レンズを入力し、校正を実行します。

このステップは、その後の画像解析のために一度だけ必要です。必要なキャリブレーション設定を再度読み込んでください。次に、浸潤アッセイの画像を開き、画像の取得に使用した顕微鏡対物レンズに応じたキャリブレーション設定を選択します。

本手法で使用するソフトウェアを用いて、ステロイドが被覆している面積を測定します。[Measure]に移動し、[Count Size]を選択します。[While]を選択してから[Load Settings]に進み、あらかじめ設定されたアッセイ設定を選択してください。

次に「count」を選択します。これにより、ステロイドが正確にセグメント化されます。測定値は異なるパラメータとしてスプレッドシートにエクスポートし、該当する画像情報をスプレッドシートに記録します。

最後に、科学用グラフ作成および統計ソフトを用いて、反復試行したステロイドまたは浸潤の平均面積を時間に対してプロットします。ここでは、脳腫瘍の浸潤の例として、U 87 MG グリオブラストーマ細胞株で観察されたがん細胞の浸潤を例に示します。BMM細胞に埋め込まれると、細胞は典型的なスターバースト状の浸潤パターンで広がり、この過程を72時間にわたって追跡します。

完全自動化された画像解析。イメージサイトメーターを使用することで、細胞突起のセグメンテーションを行い、腫瘍細胞浸潤の精密な定量化が可能になります。なお、本細胞株において、ステロイドボディは浸潤領域の測定から除外されることに注意してください。

完全自動化された画像解析を容易に実施でき、腫瘍細胞浸潤の経時的な定量化が可能です。ヒト扁平上皮頭頸部同遺伝的ながん細胞株において、異なる細胞浸潤パターンが示されます。Cal S細胞株はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に感受性を持ち、CAL R細胞株は耐性を持っています。

EGF不在下では、どちらの細胞株もBMMへの浸潤を示しませんでした。EGF存在下では、Cal arsステロイドの主細胞体から指状の突起が押し出されました。Cal s細胞は72時間後の浸潤性が低い方でしたが、このケースの画像はイメージサイトメーターを用いて迅速に取得されており、代替手法の例として、浸潤度はスタンドアロンの画像解析ソフトウェアを用いて手動で定量化されました。この手順を行う際は、各細胞株において、ステロイド形成能、細胞播種密度、マトリックス組成、および画像・解析設定を最適化する必要があることに留意することが重要です。本手順に続き、同様の手法を応用して3D組織浸潤を評価することも可能です。例えば、複雑な組織を模倣するために胚体と共培養した腫瘍や、あるいは神経膠腫に対するアストロサイト、胃腸がんに対するクリプト培養、または肝細胞癌や大腸がん転移に対する肝臓などの他のオルガノイドを用いることが考えられます。