三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

この手順の全体的な目標は、腫瘍細胞浸潤のin vitro、半自動、3次元マイクロプレートアッセイを提供することです。これは、まず、超低付着丸底96の懸濁液中に再現性のあるサイズの腫瘍ステロイドを生成することによって達成され、各ウェルで一度にステロイドをウェルプレートする。第2ステップは、培地の一部を取り除き、マトリックスまたはBMMのような基底膜を直接各ウェルに追加して、腫瘍細胞がステロイド体から侵入する半固体マトリックスを提供することです。

次に、腫瘍ステロイドの浸潤を72時間から96時間の間隔で監視し、その間に画像取得をサイトメーターで自動的に行うか、顕微鏡で手動で行います。最後のステップは、自動サイトメーターまたはイメージングソフトウェアを使用して腫瘍細胞の浸潤を分析することです。最終的に、3D腫瘍ステロイド浸潤アッセイは、生理学的に関連性が高く、ターゲット検証や薬物スクリーニング研究に適した形式でin vitroでがん浸潤をモデル化するために使用されます。

この技術は、がん研究における標的検証や薬物スクリーニングに通常使用される単純な二次元細胞増殖アッセイを補完するものであり、がんの進行の重要な側面である浸潤を生理学的に関連性のある3次元形式で調査することも可能になると考えています。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、マイクロプレート上の腫瘍増殖である3D腫瘍pheを最適化したときでした。同じセットアップを使用し、侵入部も見た目にすると良いと思いましたが、その結果、各ウェルから培地の一部を取り除き、基底膜のようなマトリックスに置き換えるだけで簡単になりました。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、BMMの伝統の後にステロイドを各井戸の中央位置に保つことが最初は困難になる可能性があるため、不可欠です。これにより、ステロイドが異なる焦点面にあるため、画像解析が最適ではない可能性があります。経験を積むことで。

このようなことはめったに起こりませんが、必要に応じて、プレートを穏やかに遠心分離することでプロセスを促進することができます。すべてのBMMをICEで一晩で開始するには、P 10 E 200およびP 1000ピペット用の滅菌フィルターチップのセットを保管し、滅菌チューブは摂氏マイナス20度です。また、4日齢のステロイドを含む超低アタッチメントの96ウェルプレートを氷上に置きます。

マルチチャンネルピペットを使用して、スズメプレートから成長培地のウェルあたり100マイクロリットルを静かに取り出します。このステップでは、先端をU底の内壁に向けて角度を付けます。井戸の底やスフェの位置との接触を避けます。

氷冷チップを使用してステロイドの乱れを最小限に抑えるために、BMMを氷冷チューブに移します。サイトカイン誘発性浸潤または薬物評価研究のために、氷冷チップを使用してBMMに試薬を添加します。例えば、上皮成長因子(EGF)を用いて、Cal S細胞やcal r扁平上皮がん細胞の浸潤を促します。

次に、100マイクロリットルのBMMをuboにそっと分注します。ウェルの内壁に向けて先端をよく向けます。この手順は最も重要です。

光学画像解析に関しては、ステロイドは、よく、中心にとどまらなければなりません。必要なすべてのウェルに対してこの手順を繰り返し、条件ごとに 5 〜 6 回の反復を許可します。必要に応じて、滅菌針を使用して冷やしたての先端に交換します。

気泡がある場合はそれを取り除きます。顕微鏡を使用して、ステロイドが中央の位置にあることを視覚的に確認します。ただし、プレートを300倍Gで4°Cの3分間遠心分離していない場合。これにより、ステロイドが各ウェルの中央に配置されるようになります。

次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに移し、BMMが1時間後に固化するのを待ちます。マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり100マイクロリットルを静かに追加し、完全に成長させます。中程度またはサイトカイン誘発性の浸潤または薬物評価研究。

サイトカインまたは阻害剤を培地に含めて、自動画像取得を行います。サイトメーターでプレートを間隔を置いてスキャンします。タイム 0 から開始して、Confluence アプリケーションを選択します。

次に、ステロイドに焦点が合っていることを確認します。必要に応じて、フォーカスを手動で調整し、フォーカスオフセットを固定します。サンプリング設定の下。

セレクターは、1つの中央視野をスキャンします。BMMの追加後、腫瘍ステロイドは中心位置に留まるべきでした。したがって、ソフトウェアでウェル全体をスキャンする必要はありません。

スキャンするウェルを定義するには、プレートマップ上でウェルを強調表示します。次に、[スキャンの開始]をクリックします。自動画像分析の場合は、confluence アプリケーションを選択します。

[解析]タブで、アプリケーション設定を調整して、細胞プロセスやBMMに広がるインベーダーポッドなど、ステロイドの周囲に正確なセグメンテーションを生成します。各腫瘍細胞株の設定を調整したり、さまざまな時点で調整したりします。分析設定がプレート内の他のステロイドに適していることを確認するには、いくつかの異なるウェルをクリックします。

セグメンテーションでステロイドの輪郭が正確に描かれない場合は、アプリケーション設定をさらに調整します。結果タブで「解析開始」をクリックします。複数のウェルをチェックして分析品質を確認してから、ウェルレベルのデータをスプレッドシートプログラムにエクスポートします。

すべての時点について解析を繰り返し、反復井戸の平均合流率と時間に対する侵入率をバー チャートで計算します。手動画像取得に最適な科学グラフ作成と統計ソフトウェアを使用して、10倍対物レンズを装備した倒立顕微鏡を使用して、各腫瘍ステロイドの画像を間隔を置いて記録します。T から開始すると、T が 72 時間から 96 時間の間に等しくなるため、0 に等しくなります。

問題の細胞ライニングへの侵入速度にもよりますが、侵入した領域が大きすぎて10倍の視野内で完全に捉えられない場合は、Forex対物レンズを使用します。取得した個々の画像を保存して、手動の画像解析を行います。ステージグラフ画像を開いてイメージング解析を行います。

キャリブレーションに最適なソフトウェアは、ステージグラフ撮影の画像です。10 x 対物レンズと 4 x 対物レンズの両方を使用します。グラフィック測定値、単位、および使用した対物レンズを入力し、キャリブレーションを実行します。

この手順は、その後の画像解析で 1 回だけ必要です。必要なキャリブレーション設定を再読み込みするだけです。次に、インベージョンアッセイ画像を開き、画像を取得するために使用した顕微鏡の目的に応じてキャリブレーション設定を選択します。

ここで使用するソフトウェアでステロイドがカバーする領域を測定します。測定に移動し、カウントサイズを選択します。while then load 設定を選択し、所定のアッセイ設定を選択します。

次に、[count] を選択します。ステロイドは、その後、正確にセグメント化する必要があります。エクスポート測定値は、スプレッドシートへのさまざまなパラメーターであり、関連する画像情報をスプレッドシートに記録します。

最後に、科学的なグラフ作成と統計ソフトウェアを使用して、複製ステロイドまたは浸潤の平均面積と時間の関係をプロットします。ここでは、U 87 MG膠芽腫細胞株で観察されたがん細胞浸潤の一例として示しています。これは、脳腫瘍の浸潤を例示するために使用できます。典型的なスターバースト侵入パターンで広がったBMM細胞に埋め込まれると、このプロセスは72時間にわたって追跡されます。

全自動画像解析。イメージサイトメーターを使用すると、細胞突起の周囲にセグメンテーションが作成され、腫瘍細胞の浸潤を正確に定量化できます。この細胞株では、ステロイド体は浸潤領域の測定から除外されることに注意してください。

完全に自動化された画像解析は簡単に実行でき、経時的な腫瘍細胞の浸潤を定量化できます。細胞浸潤の異なるパターンは、ヒトの扁平上皮、頭頸部の同質性によって示されます。がん細胞株Cal SはEG FFRチロシンキナーゼ阻害剤に感受性があり、CAL RはEG FFRチロシンキナーゼ阻害剤に耐性があります。

EGFが存在しない状態では、どちらの細胞株も、Cal arsステロイドの本体から押し出されたEGF指状の突起の存在下でBMMに侵入しませんでした。Calの細胞は72時間後には侵襲性が低かったが、この場合の画像は、イメージサイトメーターを使用して迅速に取得され、代替方法を例示するために、浸潤の程度は、スタンドアロンの画像解析ソフトウェアを使用して手動で定量化された。 この手順を試みている間、各細胞株はステロイドを形成する能力に対して最適化する必要があることを覚えておくことが重要です。 セルシーディング密度、マトリックス組成、および画像と分析の設定この手順に従います。例えば、胚体と共培養した腫瘍を複雑な組織に似せた胚体や、神経膠腫のアストロサイト、胃腸がんの陰窩培養、肝細胞がんや結腸がんの転移のための肝臓などの他のオルガノイドなどを用いて、3D組織浸潤を評価するためにも適応できる同じ方法です。