簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

次の実験の全体的な目標は、容易に入手可能な試薬を使用して、ヒトの全血から好中球、細胞外トラップ、またはネットを単離するための簡単なプロトコルを実証することです。これは、まずヒトの全血から好中球を分離し、第2のステップとして示差遠心分離技術を用いることで達成されます。単離された好中球は、PMAで刺激されてネット形成(NETosisとも呼ばれる)を誘導します。

次に、無細胞ネットアイソレートでプレートを調製し、がん細胞を添加して、ネットが細胞の接着にどのように影響するかを示します。結果は、正味の単層の添加が5 49癌細胞の接着を改善し、この接着がネットが分解されると減少することを示しています。DNASを使用すると、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

この技術の新規性を考えると、好中球xor細胞トラップの取り扱いは、これらの構造が非常に壊れやすいため、非常に困難です。まず、テキストプロトコルに記載されているように、14本のヘパリン処理された緑色のトップチューブで80ミリリットルの新鮮なヒト全血を採取します。各チューブを開き、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのPBSを各チューブに追加します。

次に、室温で4本の50ミリリットルの円錐管のそれぞれに15ミリリットルのリンパ球分離培地またはLSMを追加します。次に、60ミリリットルのシリンジに取り付けられた18ゲージの針を使用して、希釈した血液をLSMに慎重に重ね合わせ、鋭いLSM血液界面を作成し、チューブを800倍Gで21°Cで30分間遠心分離し、遠心分離機を停止します上部の2つの液体層とそれらの間の界面を慎重に吸引して廃棄し、下部の赤い層のみを残します。このペレットには赤血球と好中球が含まれています。

各チューブに20ミリリットルのPBSと20ミリリットルの6%デキストラン溶液を追加します。.各チューブを静かに反転させ、室温で30分間放置します。赤血球はチューブの底に沈殿します。

次に、上清を新しいチューブに移し、パレットを廃棄します。上清をGの450倍、摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てて好中球に富んだペレットを残します。4.5ミリリットルの滅菌水に0.5ミリリットルの溶解緩衝液を含む溶解溶液を調製します。

各チューブに合計5ミリリットルの溶解液を加え、すべてのペレットを1つのフラスコにプールします。フラスコを室温で10分間暗闇に置き、残っている赤血球をシラミで除染します。好中球をGの450倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を捨て、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのPBSでペレットを洗います。次に、サンプルを摂氏4度でGの450倍で再度遠心分離し、残りの溶解溶液を含む上清を除去します。好中球ペレットを30ミリリットルの冷たいRPMI培地に3%ウシ胎児血清を補充して再懸濁し、チューブを氷の上に置いて好中球の細胞外トラップまたはネットの形成を刺激します。

150ミリメートル×25ミリメートルの平らな組織培養皿で、好中球懸濁液30リットルに500ナノモルのPMAを加えます。20ミリメートルメッシュで、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素の下で4時間インキュベートします。インキュベーション後、皿の底に付着するネットや好中球の層を破壊しないように注意しながら、培地を穏やかに吸引して廃棄します。

次に、ピペットを使用して、カルシウムとマグネシウムを含まない15ミリリットルの冷たいPBSで各皿の底を洗い、すべての付着物を底から取り除く必要があります。洗浄懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに集め、次いでGの450倍で10分間遠心分離する。摂氏4度では、好中球と残りの細胞は底部でペレット

細胞を含まない正味の豊富な上清を残して、次に上清を複数の1.5ミリリットルチューブにデカントし、摂氏4度で10分間Gの18,000倍で遠心分離します。DNAをペレット化するには、上清を廃棄し、濃度がPBSの100マイクロリットルあたり7番目の好中球の10の2倍に対応するように、ペレットをPBSに再懸濁します。この無細胞純ストックは、その後の実験に使用できます。

分光測光法を使用してサンプルのDNA濃度を測定します。適切な濃度は、96ウェルの平らな底板の各ウェルに正味ストックの100マイクロリットルでマイクロリットルあたり140〜180ナノグラムの範囲であり、暗闇の中でプレートを摂氏4度で一晩インキュベートしてウェルをコーティングし、12〜20時間後にウェルをコーティングし、顕微鏡を使用してウェルの底に無細胞ネットの均一な単層の形成を確認します。単分子膜が検証されたら、ウェルからすべての非接着性材料を穏やかに吸引します。

底部の単層を乱さないように注意してください。これが、この手順の最も難しい側面です。適切な正味の単分子膜を維持するためには、プレートを非常に慎重に取り扱う必要があります。

すべての試薬と細胞をウェルの側面にゆっくりと加え、非常に穏やかに吸引し、吸引チップでウェルの底に触れないようにします。非接着性材料を除去した状態で、100マイクロリットルの1%ウシ血清アルブミンブロッキング溶液を各ウェルに穏やかに加え、室温で1時間放置します。プレートを攪拌したり振ったりすると、ネットモノレイヤーが乱れる可能性があるため、揺さぶらないでください。

次に、5〜49個のがん細胞が70〜80%のコンフルエントなときにそれらを収穫することにより、がん細胞を調製します。標準的な技術を用いて、細胞を100マイクロリットル当たりの4番目の細胞の2倍10の濃度で培地に再懸濁する。培地1ミリリットルあたり1マイクロリットルのCFS eを添加して細胞を染色し、室温で10分間放置します。

次に、細胞をGの450倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、培地の初期容量に細胞を再懸濁して、培地100マイクロリットルあたり10〜4番目の癌細胞の2倍の濃度を維持します。ネットコーティングされたプレートを取り、ブロッキング溶液を静かに吸引します。

次に、100マイクロリットルの癌細胞懸濁液を各ウェルに加え、細胞を摂氏37度で90分間プレートに接着させ、5%二酸化炭素で液体を完全に吸引し、1000単位のDNAを一部のウェルに10分間追加して、他のウェルのネットを分解します。車両制御として、井戸ごとに100マイクロリットルの滅菌水を10分間追加します。次に、各ウェルから液体を穏やかに吸引し、100マイクロリットルのPBSで洗浄して、付着していないものを取り除きます。

A 5 49細胞は、ウェル内のすべての溶液を吸引して廃棄し、底部にネットと付着がん細胞のみを残します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの4%ホルムアルデヒド溶液を加えて細胞を固定し、すぐにプレートを蛍光顕微鏡に移してアッセイを読み取り、結果をプロットして分析します。データ分析ソフトウェアを使用します。

無細胞ネットは、5 49個のがん細胞を用いた静的接着アッセイで使用されました。光学顕微鏡では、がん細胞が正味の単層に強く付着していることが示されました。インビトロ。

この接着は、正味の単層がDNAによって分解された後に減少し、標識された5 49の癌細胞の蛍光顕微鏡検査でこれらの結果が確認されました。5 49セルの正味モノレイヤーへの結合は、ハイパワーフィールドあたりのセル数をカウントすることによって定量化した。ここに示すように、車両制御ではネットへのがん細胞の接着に変化はありませんでした。

しかし、DNAの存在下では、がん細胞のネットへの接着が有意に減少しました。このビデオを見れば、人間の全血液からネットを分離し、取り扱う方法についてよく理解できるはずです。これらの無細胞ネットアイソレートは、免疫蛍光法、共焦点顕微鏡法、電子顕微鏡法、ウェスタンブロッティングなど、さまざまな手法で使用できます。