Name: Ex Situドナー肝臓のNormothermicマシン灌流 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶヒトドナー肝臓の常温マシン灌流法。灌流液調製、デバイス準備、血流動態モニタリングの手順を詳しく解説し、移植前の生体活性評価に役立つ技術を示します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、オランダのInnovatief Actieprogramma Groningen（IAG-3、Jan Kornelis de Cock Stichting、Tekke Huizingafondsからの助成金によって財政的に支援されました。私たちは、廃棄される可能性のある肝臓を特定し、インフォームドコンセントを取得してくれたすべてのオランダの移植コーディネーターに感謝しています。

本プロトコールは、オランダのフローニンゲン大学医療センターの医学倫理委員会（Medisch Ethische Toetsingscommissie）によって承認されています。
1. 灌流液の調製
注：本プロトコルに従って常温機械灌流用に調製される灌流液の総量は2,233 mlであり、灌流液の目標浸透圧は302 mOsmol/Lである。
<ol>
	<li>表1に記載されている灌流液の成分のうち、ヒト濃厚赤血球、新鮮凍結血漿、およびヒトアルブミンは分けておく。残りの成分を無菌的に混合し、溶液を滅菌バッグに保存して手術室（OR）へ搬送する。この操作は、無菌環境（理想的にはGMP施設）または培養室の層流キャビネット内で行う。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>構成要素</td>
			<td fo:width="2in" style="width:80px">数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>濃縮赤血球（ヘマトクリット値 60%）</td>
			<td style="text-align:right">840 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>新鮮凍結血漿</td>
			<td style="text-align:right">930 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヒトアルブミン 200 g/L (Albuman, Sanquin)</td>
			<td style="text-align:right">100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>修正静脈栄養剤（Clinimix N17G35E、Baxter International Inc.）</td>
			<td style="text-align:right">7.35 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>点滴注入用マルチビタミン剤（Cernevit, Baxter International Inc.）</td>
			<td style="text-align:right">7 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>点滴静注用濃縮微量元素製剤（Nutritrace, B. Braun Melsungen AG）</td>
			<td style="text-align:right">7.35 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>静脈内投与用メトロニダゾール (5 mg/ml) (Flagyl, Sanofi-Aventis)</td>
			<td style="text-align:right">40 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>セファゾリン 1,000 mg 5 ml バイアル 静脈内投与用粉末 (Servazolin, Sandoz)</td>
			<td style="text-align:right">2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>速効性インスリン (100 IU/ml) (Actrapid®, Novo Nordisk)</td>
			<td style="text-align:right">20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>グルコン酸カルシウム、静脈内注射液10%、137.5 mg/ml (Sandoz)</td>
			<td style="text-align:right">40 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>滅菌済みH2O</td>
			<td style="text-align:right">51.3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl溶液</td>
			<td style="text-align:right">160 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.4%炭酸水素ナトリウム溶液</td>
			<td style="text-align:right">31 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>静脈内投与用ヘパリン 5,000 IE/ml</td>
			<td style="text-align:right">4 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>合計</td>
			<td style="text-align:right">2,233 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>


表1：灌流液の組成16.
<ol start="2">
	<li>ヒト濃厚赤血球 (840 ml)、新鮮凍結血漿 (930 ml)、ヒトアルブミン 200 g/L (100 ml)、およびステップ1.1で調製した溶液を、灌流装置に投与するため手術室へ運搬する。</li>
</ol>


2. 灌流装置のプライミング
<ol>
	<li>ヒト濃厚赤血球、新鮮凍結血漿、ヒトアルブミン、およびステップ1.1で調製した溶液を含む灌流液の構成成分を、オキシゲネーター上部のコネクターを介して装置に加え、チューブ内の気泡をすべて除去する。</li>
	<li>静脈ポンプのスイッチを入れ、画面上のメーカーの指示に従う。次に動脈ポンプを起動し、同様に画面上のメーカーの指示に従う。</li>
	<li>画面上の指示に従い、圧力計を大気圧に対してゼロ点調整（ヌリング）する。これにより、灌流中に測定される圧力が、門脈および肝動脈レベルでの実際の圧力となることが保証される。</li>
	<li>カルボゲン（95% O2 + 5% CO2）を用い、流量 4 L/min で酸素供給を開始する。空気の流れは2台のオキシゲネーターに分配され（1台あたり 2 L/min）、これにより灌流液中のpO2は約 60 kPa（または 450 mmHg）になる。長時間の灌流を行う場合は、酸素と二酸化炭素の供給源を分けることが推奨される。これにより O2/CO2 比の微調整が可能となり、灌流液の pH および pCO2 を調整することができる。</li>
	<li>装置のプライミングから 15-20 分後に、血液ガス測定用の灌流サンプルを採取し、pH と電解質をモニタリングする。 
	注意：サンプルを採取する前に、約 3 ml の灌流液を必ず廃棄すること。この液体は末梢チューブ内にあり、システム内の灌流液を代表していないためである。緩衝能を確保するために 8.4% 重曹液（炭酸水素ナトリウム溶液）を添加し、生理的 pH（7.35-7.45）を目指す。例えば、8.4% 重曹液を 25-35 ml 添加し、定期的に血液ガス測定用のサンプルを採取して、灌流液中の pH と重曹レベルを確認する。</li>
</ol>
3. ドナー肝臓の調達と調製
注：in situ冷却の標準的な手法を用いて臓器を採取し、冷保存液（0-4 °C）で洗浄してください19。動脈のカニュレーションを容易にするため、肝動脈に上胸大動脈の一部を付着させたままにしておきます（図 2A）。
<ol>
	<li>保存液（すなわち University of Wisconsin solution）で胆管をフラッシュする。外科用縫合糸で胆嚢管を結紮する。</li>
	<li>臓器を標準的な滅菌ドナー臓器用バッグおよびボックスに詰め、砕氷とともに保管して、その後MPセンターへ輸送する。</li>
	<li>ドナー肝臓が手術室に到着後、直ちにバックテーブル処置を開始する。
	<ol>
		<li>微生物学的検査のため、保存液を少なくとも 10 ml サンプリングする。</li>
		<li>外科用ハサミを用いて、肝臓の裸野への横隔膜付着部および大静脈上端に残っている心筋を除去する。</li>
		<li>解剖用ハサミを使用して動脈および門脈を剥離し、側枝を外科用縫合糸またはヘモクリップで結紮する。</li>
		<li>非吸収性モノフィラメント縫合糸（例： 3-0 Prolene）を用いて、上胸部大動脈セグメントの遠位端を閉鎖する。上胸部大動脈の近位端に動脈カニューレを挿入し、縫合糸で固定する（図 2A）。灌流装置のメーカーが提供する使い捨てパッケージに同梱されているカニューレを使用する。</li>
		<li>門脈に静脈カニューレを挿入し、縫合糸で固定する。使い捨てパッケージに同梱されているカニューレを使用する。肝静脈にはカニューレを挿入しない。</li>
		<li>保存液で胆管をフラッシュする。シリコンカテーテルを胆管に挿入し、縫合糸で固定する。 
		注：カテーテルを胆管に深く挿入しすぎないこと。胆管上皮を損傷させる可能性がある。</li>
		<li>門脈カニューレを介して、以下の通り 0.9% NaCl 溶液で肝臓をフラッシュする：
		<ol>
			<li>移植片が保存液として University of Wisconsin solution で保存されていた場合は、2,000 ml の冷 (0-4 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュした後、500 ml の温 (37 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュする。</li>
			<li>移植片が保存液として Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution で保存されていた場合は、1,000 ml の冷 (0-4 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュした後、500 ml の温 (37 °C) 0.9% NaCl 溶液でフラッシュする。温フラッシュの目的は、灌流液の温度が大幅に低下するのを防ぐことである。</li>
			<li>肝臓を灌流装置に接続する直前に温フラッシュを行う。 
			注：温フラッシュから NMP 開始までの時間は、常に 1-2 min 未満に保つこと。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ドナーの特性 (N = 12)</td>
			<td>件数 (%) または中央値 (IQR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>年齢（歳）</td>
			<td>61 (50-64)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>性別（男性）</td>
			<td>8 (67%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ドナーの種類 
			DCD、マーストリヒトタイプIII 
			DBD</td>
			<td>  
			10 (83%) 
			2 (17%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ボディマス指数 (BMI)</td>
			<td>27 (25-35)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>却下理由 
			DCD+ 年齢 &gt;60年 
			DCD+ 高BMI 
			DCD（循環停止後ドナー）＋さまざまな理由* 
			重度脂肪肝</td>
			<td>  
			5 (41%) 
			3 (25%) 
			2 (17%) 
			2 (17%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存液 
			  UW溶液 
			  HTK溶液</td>
			<td>  
			6 (50%) 
			6 (50%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCDにおけるドナー温虚血時間（分）</td>
			<td>14 (17 - 20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冷虚血時間（分）</td>
			<td>389 (458-585)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ドナーリスクインデックス (DRI)</td>
			<td>2.35 (2.01-2.54)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：ドナーの特性。 * 1つの移植片についてはドナーに静脈内薬物乱用の既往があり、別の移植片については生命維持装置の停止後にドナーのsO2 &lt;30%の状態が持続した。 略語： DCD：循環停止後ドネーション、DBD：脳死後ドネーション、UW：ウィスコンシン大学液、HTK：ヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸液
<img alt="門脈、胆管、および上行大動脈を示す肝移植の手順シーケンス。" src="/files/ftp_upload/52688/52688fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2: (A) バックテーブルで準備されたヒトドナーグラフトの写真、および(B-D) その後、常温灌流が行われた様子。(A) 動脈カニューレを上行大動脈に、静脈カニューレを門脈に挿入している。胆管にはシリコン製胆管カテーテルが留置されている。(B) 肝臓を前面が下になるように臓器チャンバー内に配置し、カニューレを灌流装置のチューブに接続している。(C) 常温機械灌流開始から30分後。(D) 常温機械灌流開始から6時間後。操作中、肝臓の無菌的で湿潤な環境を維持するため、臓器チャンバーは透明なカバーで覆われている（これらの写真では示されていない）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52688/52688fig2large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
4. 常温機械灌流
<ol>
	<li>肝臓の前面を下にして臓器チャンバーに配置する。すぐに、門脈カニューレを灌流装置の門脈流入チューブに、動脈カニューレを装置の動脈流入チューブに接続し、プライミング済みの灌流装置に肝臓を接続する。</li>
	<li>画面上の製造元の指示に従い、門脈側と動脈側の両方で灌流を開始する。平均動脈圧を 70 mmHg、平均門脈圧を 11 mmHg に設定する。</li>
	<li>30分ごとに灌流液サンプルを採取し、一般的な血液ガス分析装置を用いて、血液ガスパラメータ（pO2、pCO2、sO2、HCO2-、pH）および生化学的パラメータ（グルコース、カルシウム、乳酸、カリウム、ナトリウム）を直ちに分析する。サンプリング前に灌流液を約 3 ml 廃棄すること。この液は末梢チューブ内にあり、システム内の灌流液を代表していないためである。
	<ol>
		<li>これらのサンプルを採取するには、灌流装置の使い捨てチューブセットの一部であるサンプリングコネクタから、1 ml シリンジを用いて灌流液を吸引する。サンプルごとに新しいシリンジを使用し、灌流液の吸引後は直ちにシリンジ内の気泡を取り除く。その後、シリンジを血液ガス分析装置に挿入し、分析装置のマニュアルに記載されている製造元の指示に従う。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>アルカリホスファターゼ (AlkP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ (gamma-GT)、アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT)、尿素、および総ビリルビンの測定のため、灌流液から血漿を回収し、-80 °C で凍結保存する。灌流液を 1,500 x g、4 °C で 5 分間遠心分離した後、血漿を回収する。</li>
</ol>

<ol><li>Plaats, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+in+liver+transplantation+revisited%3A+Concepts+and+criteria+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation in liver transplantation revisited: Concepts and criteria in the new millennium.</a> Ann. Biomed. Eng. 32 (4), 623-631 (2004).</li>
<li>op den Dries, S., Sutton, M. E., Lisman, Y., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+bile+ducts+in+liver+transplantation%3A+Looking+beyond+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protection of bile ducts in liver transplantation: Looking beyond ischemia.</a> Transplantation. 92 (4), 373-379 (2011).</li>
<li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+complications+after+liver+transplantation%3A+Old+problems+and+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Biliary complications after liver transplantation: Old problems and new challenges.</a> Am. J. Transplant. 13 (2), 253-265 (2013).</li>
<li>Buis, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonanastomotic+biliary+strictures+after+liver+transplantation%2C+part+1%3A+Radiological+features+and+risk+factors+for+early+vs.+late+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver.+Transpl%22%5BJournal%5D)">Nonanastomotic biliary strictures after liver transplantation, part 1: Radiological features and risk factors for early vs. late presentation.</a> Liver. Transpl. 13 (5), 708-718 (2007).</li>
<li>Karimian, N., op den Dries, S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+biliary+strictures+after+liver+transplantation%3A+Is+it+the+amount+of+epithelial+injury+or+insufficient+regeneration+that+counts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The origin of biliary strictures after liver transplantation: Is it the amount of epithelial injury or insufficient regeneration that counts.</a> J. Hepatol. 58 (6), 1065-1067 (2013).</li>
<li>Gastaca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+complications+after+orthotopic+liver+transplantation%3A+A+review+of+incidence+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Biliary complications after orthotopic liver transplantation: A review of incidence and risk factors.</a> Transplant. Proc. 44 (6), 1545-1549 (2012).</li>
<li>Sanchez-Urdazpal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic-type+biliary+complications+after+orthotopic+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Ischemic-type biliary complications after orthotopic liver transplantation.</a> Hepatology. 16 (1), 49-53 (1992).</li>
<li>Dubbeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+liver+transplantation+survival+with+selected+cardiac+death+donors+and+brain+death+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Similar liver transplantation survival with selected cardiac death donors and brain death donors.</a> Br. J. Surg. 97 (5), 744-753 (2010).</li>
<li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+in+human+liver+transplantation%3A+The+first+clinical+series%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation in human liver transplantation: The first clinical series.</a> Am. J. Transplant. 10 (2), 372-381 (2010).</li>
<li>Henry, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+reduces+molecular+markers+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+human+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation reduces molecular markers of ischemia/reperfusion injury in human liver transplantation.</a> Am. J. Transplant. 12 (9), 2477-2486 (2012).</li>
<li>Schlegel, A., Rougemont, O., Graf, R., Clavien, P. A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mechanisms+of+end-ischemic+cold+machine+perfusion+in+DCD+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Protective mechanisms of end-ischemic cold machine perfusion in DCD liver grafts.</a> J. Hepatol. 58 (2), 278-286 (2013).</li>
<li>op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+oxygenated+machine+perfusion+prevents+arteriolonecrosis+of+the+peribiliary+plexus+in+pig+livers+donated+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Hypothermic oxygenated machine perfusion prevents arteriolonecrosis of the peribiliary plexus in pig livers donated after circulatory death.</a> PLoS. One. 9 (2), e88521(2014).</li>
<li>Tolboom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+machine+perfusion+at+both+20+degrees+C+and+30+degrees+C+recovers+ischemic+rat+livers+for+successful+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic machine perfusion at both 20 degrees C and 30 degrees C recovers ischemic rat livers for successful transplantation.</a> J. Surg. Res. 175 (1), 149-156 (2012).</li>
<li>Gringeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+machine+perfusion+for+non-heart-beating+donor+liver+grafts+preservation+in+a+swine+model%3A+A+new+strategy+to+increase+the+donor+pool%3F+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic machine perfusion for non-heart-beating donor liver grafts preservation in a swine model: A new strategy to increase the donor pool? Transplant.</a> Proc. 44 (7), 2026-2028 (2012).</li>
<li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+machine+perfusion+for+ex+vivo+preservation+and+recovery+of+the+human+liver+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic machine perfusion for ex vivo preservation and recovery of the human liver for transplantation.</a> Am. J. Transplant. 14 (6), 1400-1409 (2014).</li>
<li>op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am. J. Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS. One. 9 (11), (2014).</li>
<li>Minor, T., Efferz, P., Fox, M., Wohlschlaeger, J., Luer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+oxygenated+rewarming+of+cold+stored+liver+grafts+by+thermally+graduated+machine+perfusion+prior+to+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Controlled oxygenated rewarming of cold stored liver grafts by thermally graduated machine perfusion prior to reperfusion.</a> Am. J. Transplant. 13 (6), 1450-1460 (2013).</li>
<li>Makowka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+technique+of+orthotopic+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol.+Clin.+North.+Am%22%5BJournal%5D)">Surgical technique of orthotopic liver transplantation.</a> Gastroenterol. Clin. North. Am. 17 (1), 33-51 (1988).</li>
<li>Hansen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+examination+and+evaluation+of+donor+bile+ducts+received+during+orthotopic+liver+transplantation--a+morphological+clue+to+ischemic-type+biliary+lesion%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Histological examination and evaluation of donor bile ducts received during orthotopic liver transplantation--a morphological clue to ischemic-type biliary lesion?</a> Virchows Arch. 461 (1), 41-48 (2012).</li>
<li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+of+the+liver%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Organ.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion of the liver: Past, present and future.</a> Curr. Opin. Organ. Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li>
<li>Oldani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-retrieval+reperfusion+decreases+cancer+recurrence+after+rat+ischemic+liver+graft+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Pre-retrieval reperfusion decreases cancer recurrence after rat ischemic liver graft transplantation.</a> J. Hepatol. 61 (2), 278-285 (2014).</li>
<li>Tromans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+pressure+dependent+solubility+of+oxygen+in+water%3A+A+thermodynamic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrometallurgy%22%5BJournal%5D)">Temperature and pressure dependent solubility of oxygen in water: A thermodynamic analysis.</a> Hydrometallurgy. 48 (3), 327-342 (1998).</li>
</ol>

この原稿の著者には、開示すべき利益相反はありません。

このビデオでは、肝動脈と門脈を介した圧力制御された二重灌流を可能にするデバイスを使用して、ヒトドナー肝臓の常温機械灌流のための段階的なプロトコルを提供します。このプロトコルに従っている間、灌流装置の技術的な故障は発生せず、すべての移植片は十分に灌流され、十分に酸素化されました。 その場外 灌流肝臓は、胆汁の産生によって定義されるように、安定した血行動態を持ち、代謝的に活発でした16,17。
これは、ヒトドナー肝臓の機械灌流のための確立されたプロトコルです。この技術には、SCS21 の従来の方法に比べていくつかの潜在的な利点があります。機械灌流は、臓器保存の意図されたエンドポイントに応じて、ドナー肝移植片をさまざまな温度で保存する機会を提供します。低体温酸素化機械灌流は、微小血管培養の灌流と洗い流しを改善し、アデノシン三リン酸 (ATP) の再生を刺激することにより細胞内エネルギー量の回復に役立つ可能性があります。ただし、移植片の生存率を完全に評価するには、より生理学的な温度 (常温下または常温) での灌流が必要です。灌流...

現在の肝移植における臓器保存法は、ドナー肝を冷温（0-4 °C）の保存液（ウィスコンシン大学溶液やヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液など）で灌流し、その後保存する方法である。この手法は静的冷保存（SCS）と呼ばれる。0-4 °Cにおける肝臓の代謝率は非常に低いが、それでも0.27 µmol oxygen/min/gの肝組織への酸素需要があり、SCSではこれを供給することができない1。したがって、従来のSCS法は、ドナー肝にある程度の（追加的な）損傷をもたらす。高品質なドナー肝では、この程度の保存損傷は問題とならないが、ドナーですでに一定の損傷を受けているサブオプティマルな（最適ではない）肝臓では、これが重大な制限要因となる可能性がある。このため、品質がサブオプティマルな肝臓や、いわゆる拡張判定ドナー（ECD）肝は、早期のグラフト不全のリスクが高すぎると考えられ、移植に不適として拒否されることが多い。循環停止後ドナー（DCD）からの肝臓、高齢ドナー、または脂肪肝グラフトのレシピエントでは、遅延性グラフト機能不全、原発性不機能、および非吻合部胆管狭窄（NAS）の高い発生率が報告されている2。NASは肝移植後の罹患率および死亡率の主要な原因である。NASはドナーの肝外および肝内胆管の両方で発生する可能性があり、管腔内の胆泥や鋳型形成を伴うことがある3,4。NASの病因は多因子的なものと考えられているが、グラフト保存および移植中の胆管の虚血再灌流傷害が主要な基礎メカニズムとして特定されている2,5。DCDグラフトの移植は、NAS発症の最強のリスク因子の1つとして特定されている。DCDドナーにおける温暖虚血期間、臓器保存中の冷虚血、およびその後のレシピエントにおける再灌流傷害の組み合わせが、胆管の不可逆的な損傷の原因と考えられており、これが胆管の低い再生能力と相まって、肝移植後の胆管の線維性瘢痕化と狭窄を招く2,5。DCD肝を移植された患者の最大30%にNASが報告されている6-8。移植用肝グラフトに対する現在のSCS法は、DCDドナー由来のような、あらかじめ損傷を受けたECD肝に対しては不十分であることが明らかになっている。ECD肝の移植利用を拡大し最適化するためには、代替的な手法が必要である。
機械灌流（MP）は臓器保存の一手法であり、単純冷却保存（SCS）と比較してドナー臓器をより良好に保存できる可能性があります。MPは、特に拡大基準ドナー（ECD）グラフトの保存において有用と考えられます。MPの重要な利点は、保存期間中にグラフトへ酸素を供給できることです。MPはさまざまな温度で実施でき、低体温（0-10 °C）、亜正常体温（10-36 °C）、および正常体温（36-37 °C）の正常体温機械灌流（NMP）に分類されています。MPに使用する温度に応じて灌流液の種類を調整する必要があり、温度が上がるにつれてより多くの酸素を供給する必要があります。ヒト肝移植におけるMPの最初の臨床応用は、灌流液への能動的な酸素供給を行わない低体温灌流に基づいたものでした9,10。動物モデルにおいて、低体温酸素化MP（0-10 °C）は肝グラフトの虚血再灌流傷害に対する保護効果を有し11、胆管の胆管周囲血管叢をより良好に保存することが示されています12。20 °Cまたは30 °Cでの亜正常体温酸素化MPも動物モデルで研究されており、SCSと比較してDCD肝のグラフト機能がより早期に回復することが示されました13,14。ヒト肝臓における亜正常体温酸素化MPの実現可能性については、最近、廃棄予定のヒトドナー肝7例のシリーズで報告されました15。NMP（37 °C）では、移植前にグラフトの生存能および機能性を評価することが可能です16,17。さらに、MPを用いることで移植前に肝グラフトを徐々に再加温させることができ、これによりグラフトの回復と蘇生が促進されることが実証されています18。
本プロトコルで使用される肝臓機械灌流装置は、2台の遠心ポンプを用いて門脈および肝動脈を介した二方向灌流を可能にし、門脈への持続的な血流と肝動脈への拍動流を提供します。本システムは圧力制御方式であり、肝内抵抗に応じて肝臓を流れる流量が自動調節されます。2つの中空糸膜オキシゲネーターにより、肝移植片への酸素供給およびCO2の除去が行われます。温度は、予定しているMP（機械灌流）のタイプに基づいて設定可能です（最低温度10 °C）。流量、圧力、温度はデバイス上にリアルタイムで表示され、灌流プロセスの継続的な制御が可能です。各移植片の灌流には、チューブ、リザーバー、およびオキシゲネーターからなる新しい滅菌使い捨てセットが用意されています（図1）。
このビデオ記事の目的は、新たに開発された肝灌流装置を用いて、ヒトドナー肝臓のex situ常温機械灌流を行うためのステップバイステップのプロトコルを提供することです。
<img alt="肝灌流システムの図解：ロータリーポンプの構成、酸素供給プロセス、柔軟な肝保持器。" src="/files/ftp_upload/52688/52688fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 1"> 
図 1: ヒトドナー肝臓の常温灌流に使用される、（A）概略図、（B）灌流装置の写真、（C）オキシゲネーターの拡大図、および（D）遠心ポンプ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52688/52688fig1large.jpg" target="_blank">こちらのリンクから、本図の拡大版をご覧いただけます。</a>

<table><tbody><tr><td>肝臓補助</td><td>臓器補助</td><td>OA。Li.Li.140</td><td>灌流装置</td></tr><tr><td>肝臓アシスト使い捨てパッケージ</td><td>臓器アシスト</td><td>OA.Li.DP.540</td><td>使い捨てセットとカニューレ</td></tr><tr><td>Meredith No.8</td><td>Vygon Nederlands B.V.</td><td>1362082</td><td>胆管カニューレ</td></tr><tr><td>ヒトアルブミン 200 g/L / ALBUMAN</td><td>Sanquin</td><td>15522598</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Modified Noneroral nutrition</td><td>Baxter Nederland B.V.</td><td>N14G30E</td><td>7.35 ml</td></tr><tr><td>輸液用マルチビタミン / CERNEVIT</td><td>Baxter International Inc.</td><td>9800927</td><td>7 &mu;l</td></tr><tr><td>輸液用濃縮微量元素 / NUTRITRACE</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>14811332</td><td>7.35 ml</td></tr><tr><td>メトロニダゾール 5 mg/ml</td><td>Baxter Nederland B.V.</td><td>98181882</td><td>40 ml</td></tr><tr><td>セファゾリン / SERVAZOLIN</td><td>Sandoz B.V.</td><td>15611337</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>速効型インスリン</td><td>さまざまなベンダー</td><td></td><td>20 ml</td></tr><tr><td>グルビオン酸カルシウム、静脈内溶液 10%、137.5 mg/ml</td><td>サンドス</td><td>97038695</td><td>40 ml</td></tr><tr><td>滅菌 H2O</td><td>フレゼニウス カビ オランダ B.V.</td><td>98084453</td><td>51.3 ml</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>Baxter Nederland B.V.</td><td>15262510</td><td>160 ml</td></tr><tr><td>ヘパリン 5,000 IE/ml for i.v. iv.</td> 投与用 <td>LEO Pharma B.V.</td><td>98026178</td><td>4 ml</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム 8.4%</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>97973874</td><td>量は pH によって異なります</td></tr><tr><td>パック赤血球 (SAGM)</td> <td>血液銀行 (Sanquin)</td><td>N0012000</td><td>750 ml</td></tr><tr><td>新鮮凍結血漿</td><td>血液銀行 (Sanquin)</td><td>N04030A0/N04030B0</td><td>900 ml</td></tr></tbody></table>

ex situドナー肝臓のnormothermicマシン灌流

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

従来の静的低温保存(0-4°C)とは対照的に、ex situマシン灌流はドナー肝臓のより良い保存を提供する可能性があります。臓器の継続的な灌流は、臓器の質を改善する機会を提供し、移植前にドナーの肝臓のex situ生存率評価を可能にします。このビデオ記事では、肝動脈の圧力と温度を制御した拍動性灌流と門脈の連続灌流を提供するデバイスを使用して、ヒトドナー肝臓のex situ常温マシン灌流(37°C)の段階的なプロトコルを提供します。灌流液は、2つの中空糸膜型人工肺装置によって酸素化され、温度は10°Cから37°Cの間で調整できます。灌流中、肝臓の代謝活性と損傷の程度は、灌流液から採取したサンプルの生化学的分析によって評価できます。機械灌流は、移植に適した肝臓の数を増やすための非常に有望なツールです。

様々な理由で移植が見送られた12例のヒト肝臓を、ドナー家族から研究へのインフォームドコンセントを得た後に使用した。ドナーの特性は表2に記載されている。ヒトドナー肝臓を、本論文に記載されたプロトコルを用いて6時間、常温で灌流した。肝移植片の品質は、肝灌流のマクロな均一性をモニターすることで評価した（図2A-D）。肝臓の血液動態は、動脈血流および門脈血流の変化をモニターすることで評価した。肝動脈および門脈の血流が当初増加し、その後安定することが観察され、6時間時点での平均動脈血流量は256 ± 16 ml/min（平均 ± SEM）、平均門脈血流量は748 ± 34 ml/min（平均 ± SEM）となり、灌流中の肝臓の血液動態が安定していることが示された（図3A）。動脈灌流液から採取した灌流サンプルを用いて血液ガス分析を行い、灌流液中の酸素化状態をモニターした。カーボゲン（95% O2および5% CO2）を4 L/minの流量で...

ここでは、ドナーの肝臓移植片の酸素化ex situマシン灌流を説明するプロトコルを提示します。この記事には、機械灌流用の肝臓移植片を調達および準備し、灌流液を準備し、灌流機械をプライミングし、肝臓移植片の酸素化常温機械灌流を実行するための段階的なプロトコルが含まれています。

Ex Situドナー肝臓のNormothermicマシン灌流

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

この手順の全体的な目的は、マシンパーフュージョン（機械灌流）を用いて、ヒトドナー肝移植片を体温で灌流することです。まず、必要な灌流液を調製します。次に、灌流液の各成分を装置に添加し、灌流装置のプライミングを行います。同時に、調達された肝移植片をバックテーブル上で準備し、灌流装置に接続できるようにします。最後のステップは、肝臓を灌流装置に接続し、常温灌流を開始することです。最終的に、画面に表示される動脈流および門脈流の変化を用いて肝臓の血行動態を評価し、動脈灌流液から採取したサンプルの血液ガス分析を用いて、灌流液のpHと酸素化をモニタリングします。静的な保存という従来の方法に対するこの技術の主な利点は、人体外の通常温度で肝臓を生かしたまま維持できることです。グラフトに酸素と栄養を供給することで、代謝活性を維持します。これにより、虚血再灌流および寒冷誘発性損傷を軽減することが可能になります。肝臓は37°Cで代謝活性を持つため、移植前にグラフトの生存能を評価することができます。ヒト肝グラフトの体外正常温度マシン灌流の手順について、私の研究室の博士課程学生であるAlex Mehanがステップバイステップで実演します。この手順を開始するには、オキシジネーター上部のコネクターを介して、灌流液の成分をマシンに加えてください。灌流液は、ヒト濃縮赤血球、新鮮凍結血漿、ヒトアルブミン、およびその他の成分で構成されています。静脈ポンプと動脈ポンプの電源を入れます。画面上の製造元の指示に従い、両側のポンプ出力を上げます。閉鎖系内からすべての気泡を系統的に除去します。画面の指示に従い、圧力計を大気圧に対してゼロ点調整します。これにより、灌流中の圧力測定値が門脈レベルでの実際の圧力になることが保証されます。デバイスの門脈側の設定温度を37°Cに調整します。平均門脈圧を11 mmHgに設定します。デバイスの動脈側で圧力ゼロ点調整の手順を繰り返します。温度を37°Cに、平均動脈圧を70 mmHgに設定します。カーボゲンを用い、流量4 L/minで酸素供給を開始します。空気の流れは2台のオキシゲネーターに分配され、これにより灌流液中の酸素分圧は約60 kPaになります。長時間の灌流を行う場合は、酸素と二酸化炭素を個別の供給源から導入することをお勧めします。これにより、酸素と二酸化炭素の比率を微調整でき、灌流液のpHおよび二酸化炭素分圧を調整することが可能になります。血液ガス分析を行い、灌流液のpHを確認します。サンプルを採取する前に、必ず約3 mLの灌流液を廃棄してください。この液は末梢チューブ内にあり、システム内の灌流液の状態を代表していないため、血液ガスサンプルからすべての気泡を除去してください。緩衝能を持たせるため、生理的なpHを目指して8.4%炭酸水素ナトリウム溶液を加えます。通常、8.4%炭酸水素ナトリウム溶液を15から30 milliliters添加します。この段階で、ドナー病院において標準的なin situ冷却法を用いてドナー肝臓を摘出し、動脈のカニューレ挿入を容易にするために冷保存液でフラッシュします。ドナー肝臓がマシンパーフュージョンセンターの手術室に到着次第、上行大動脈の一分を肝動脈に付着させたままにし、バックテーブル操作を開始してください。微生物検査用として、保存液を少なくとも10 milliliters採取します。ドナー病院での採取時に、肝臓の胆嚢管は外科用鋏で結紮されています。肝臓の裸領域への横隔膜付着部、および下大静脈の上端に残っている心筋を除去してください。解剖用鋏を用いて、動脈と門脈を剥離します。外科用縫合糸または止血クリップを使用して、側枝を結紮します。3.0 Proleneなどの非吸収性モノフィラメント縫合糸を用いて、上幹大動脈セグメントの遠位端を閉鎖します。動脈カニューレを上幹動脈の近位端に挿入し、縫合糸で固定します。次に、静脈カニューレを門脈に挿入し、縫合糸で固定します。肝静脈はカニューレを挿入せずにそのままにします。保存液で胆管を洗浄します。シリコンカテーテルを胆管に挿入し、縫合糸で固定します。胆管上皮を損傷させる可能性があるため、カテーテルを胆管の深すぎる位置まで挿入しないでください。最後に、門脈カニューレを介して0.9% saline solutionで肝臓を洗浄します。グラフトがUniversity of Wisconsin solutionで保存されていた場合は、2 Lの冷 saline solutionで洗浄した後、0.5 Lの温 saline solutionで洗浄してください。グラフトがHTK solutionで保存されていた場合は、マシンパーフュージョン（機械灌流）の準備として、1 Lの冷 saline solutionで洗浄した後、0.5 Lの温 saline solutionで肝臓を洗浄してください。まず、肝臓の前表面を下に向けて臓器チャンバーに配置します。すぐに、門脈カニューレを装置の門脈流入チューブに、動脈カニューレを装置の動脈流入チューブに接続し、プライミング済みの灌流装置に肝臓を接続します。このプロトコルにおいて最も重要な点は、門脈および肝動脈カニューレを灌流装置に接続することです。その後、速やかに十分な灌流を開始してください。画面上のメーカーの指示に従い、門脈側と動脈側の両方で灌流を開始します。チューブの折れ曲がりや肝内抵抗の上昇がある場合、圧力アラームが発生することがあります。平均動脈圧と平均門脈圧を確認し、必要に応じて再設定します。正常体温でのマシン灌流中、代謝活性を持つグラフトからの胆汁産生および肝動脈の拍動を確認してください。灌流中の任意の時点で、付属の滅菌カバーを用いて臓器チャンバーを密閉します。新しい1 mLシリンジを用いて、血液、ガス、および生化学的パラメータを直ちに分析するための灌流液サンプルを採取します。各サンプルについて、灌流装置の使い捨てチューブセットの一部であるサンプリングコネクタから灌流液を吸引します。ここでも、サンプルを採取する前に数mLの灌流液を必ず廃棄してください。シリンジ内の気泡を直ちに取り除きます。1 mLシリンジを血液ガス分析機に挿入し、製造元の指示に従って血液ガスおよび生化学的パラメータの分析を行います。後の分析のために、灌流液のサンプルを採取します。それらを採血管に移し、溶けかけの氷上に置いて保存します。サンプルを1400 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。灌流液から血漿を回収し、灌流中の肝臓の品質を評価するための移植片損傷量を測定する後の生化学的分析に備え、血漿を-80 °Cで凍結保存します。肝臓の肉眼的な均一性をモニターします。ここでは、灌流前、および正常体温機械灌流開始後30分と6時間後の肝臓を示しています。肝臓の血行動態は、正常体温機械灌流中の動脈血流量および門脈血流量の変化をモニターすることで評価しました。流量の初期上昇とその後の安定化は、融合中の肝臓の血行動態が安定していることを示しています。灌流液の酸素化および二酸化炭素の抽出をモニタリングするために、血液ガス分析を用いました。毎分4リットルの流量でカルボゲンによる酸素化を行った結果、酸素飽和度は継続的に100%となりました。肝機能の指標として、胆汁産生を用いました。総ビリルビンおよび重炭酸塩濃度の増加は、産生された胆汁の質の改善を示していました。時間の経過とともに、胆汁の色が徐々に濃くなることが観察されました。灌流液中のLTアルカリホスファターゼ、γ-GT、カリウムなどの肝損傷マーカーの濃度が安定していたことは、グラフトの損傷が最小限であったことを反映しています。さらに、肝組織および肝外胆管遠位端の組織学的検査において、正常体温機械灌流中のグラフトへの追加的な損傷は認められませんでした。胆管周囲腺および血管系が示されています。このビデオを視聴することで、ヒト肝移植片の常温機械灌流の方法について十分に理解することができます。この技術は、移植前に移植片の生存能を改善し、評価できる可能性を提供します。

ex-situ-normothermic-machine-perfusion-of-donor-livers

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ドナー肝臓の 体外体温下マシン灌流

そのような脂肪肝、古いドナーからの移植片、または心臓死（DCD）の後に検索された肝臓のような限界移植片は、不十分にしか従来、冷たい静的記憶を容認。私たちは、移植前に限界肝臓移植片の保存、評価、および修復のためのsubnormothermic ex vivoでの肝灌流の新規モデルを開発した。...

Subnormothermicのテクニック<em&gt;生体外</em&gt;肝臓ストレージ、評価のための灌流、およびマージナル肝移植片の修復

我々はsubnormothermic温度（21℃）で、ヒト肝臓移植片のex vivoでの機械灌流法を説明する。...

Subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復

深刻な臓器不足は移植のための限界​​腎臓移植片の使用の増加をもたらしました。限界移植片は特に不十分冷蔵を許容するので、これは、代替ストレージ·メソッドへの関心を引き起こしました。正常体温ex vivoで腎臓灌流（NEVKP）の技術は、移植前に腎臓移植のための新規の保存方法を表します。...

正常温度の<em&gt;エクスビボ</em&gt;腎臓の保全のための腎臓の灌流は移植前の移植片

重要な肝ドナー不足があるし、肝ドナーの条件が展開されています。常温体外肝灌流 (NEVLP) は評価し臓器の機能を変更しました。本研究は NEVLP のモデルラットを示します、保存肝傷害を軽減するために、ペグインターフェロン...

Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

ここでは、ラットモデルにおける正常体温 exsitu...

ノルマザーミックEx-situ灌流異所性心臓移植のラットモデル

ここで説明した肝臓正常温機械灌流(NMP)のブタモデルは、NMPの保存戦略、生存率評価のツール、および臓器修復のプラットフォームとしての研究にうまく使用できます。高い翻訳価値を持っていますが、技術的には困難で、労働集約的です。...

ブタのNormothermic分離肝灌流

マウス肝臓用に正常体温 外生体外...

マウスにおけるノルマザーミック Ex vivo 肝臓機械灌流

このプロトコルでは、ドナーの肝臓の保存とそれに続く同所性肝移植 (OLTx) のための可変温度制御機械灌流 (MP) を利用したブタ...

灌流および同所性肝移植による循環器死(DCD)肝臓後のブタ提供の保存

このプロトコルは、ラットの腎臓を体内外 で正常母...

移植のためのラット腎臓の正常性機械灌流

ここでは、既存のプラットフォームの高コストと限られた柔軟性を克服するように設計された、オープンソースで変更可能な常温 ex vivo...

研究者向けに設計されたオープンソースのノーマザミック灌流システム

学ぶヒトドナー肝臓の常温マシン灌流法。灌流液調製、デバイス準備、血流動態モニタリングの手順を詳しく解説し、移植前の生体活性評価に役立つ技術を示します。

Ex Situドナー肝臓のNormothermicマシン灌流

さらに動画を探す