Name: 酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ、ウロキナーゼを用いて凝固した骨髄試料から間葉系幹細胞を分離・培養する方法。迅速かつ低コストで貴重な試料を有効活用し、再生医療研究への応用が可能です。

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この作業は、スイス国立財団助成金CR3I3_140717/1およびスイス対麻痺財団によって支援されました。

注：腸骨稜からのヒト骨髄吸引は、ルツェルン州の倫理委員会の承認を得てドナー同意から採取した。犬の所有者のconsent.Human（約20ml）およびイヌ（約10ml）を骨髄穿刺液を直ちに中止後に3.8％クエン酸ナトリウムを15mlの添加により抗凝固して腸骨稜からイヌ骨髄吸引物を採取した手術室で。試料を回収と同日処理する実験室の環境に移した。 ウロキナーゼの調製（従来1回目使用すること） <ol><li>製造業者の説明書に従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用してウロキナーゼを再：10 mlシリンジを用いてセプタム入口フラスコに10mlのPBSを加える。ミリリットル50,000射出ユニット（U）を得かき混ぜることによって乾燥物質を溶解する。 </li><li> Sに500μlのアリコート（25000 Uそれぞれ）を準備terileチューブ。ストアアリコート-20℃と、少なくとも6ヶ月間に必要なときにそれを使用しています。 </li></ol> 2.取手順（従来すべての骨髄治療へ） <ol><li>凝固した骨髄穿刺液あたりウロキナーゼの一アリコート（25000 U）を解凍し（25 mlまで吸引ボリュームが正常25000 Uの単一のアリコートを使用して治療されている）。 </li><li> 37℃の水浴または振盪インキュベーターを予熱。 </li></ol>血餅の3酵素消化物<ol><li>処理中の骨髄試料の微生物汚染を避けるために、層流生物学的安全キャビネット内ですべての作業を行う。感染の可能性の人間の材料を使用する場合は、保護手袋の使用だけでなく、慎重な取り扱いをお勧めします。 </li><li>無菌の50ミリリットルチューブの上に100μmのセルストレーナーを置きます。慎重にストレーナを傾けたり、凝固材料の周りに移動する、セルストレーナーを通して骨髄穿刺液を注ぐ。のための滅菌ピペットチップを使用して、フィルターメッシュを通してより良い流れ。 注：PBSで凝血塊を洗浄することにより、例えば 、血餅のすべての希釈は避けてください。ウロキナーゼは、間接的に作用し、効果的なダイジェストのための生検からの血清の成分（ すなわち 。、プラスミノーゲン）が必要です。凝固材料と手順を継続しながら、ろ液をステップ3.6においてさらに使用するまで室温で保つことができる。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、空の細胞培養皿に骨髄クロット材料を転送します。滅菌メスを用いて約2ミリメートル3の小片に破片をカット。 </li><li>滅菌ピンセットを用いた50ml反応管に血餅の小片を転送する。ミンチ血栓が濡れ外観を有することを確認してください。それが乾燥しているように見える場合は、湿らせるステップ3.1からのろ液の一部を使用。 </li><li>ピペッティング5ミリリットルマイクロピペットを用いて、5回によって凝血塊を粉砕する。サンプルにウロキナーゼの1分量を追加します。水浴中、またはのいずれかで37℃で30分間インキュベート揺れ（優しく）インキュベータ。 </li><li> 5ミリリットルピペットを用いて5回上下にピペッティングとによって粉砕物。バイオセーフティキャビネットに、この手順を実行します。 37℃でさらに30分間インキュベートする。インキュベーション後5mlのピペットを使用して再度5回粉砕する。ステップ3.2からの濾液とプールする新鮮さ100μmのセルストレーナー上を通過。 </li><li>遠心分離機500×gで10分間、周囲温度で細胞懸濁液。上清を捨てる。以下に記載またはMSC増殖培養のためのあなたの研究室の標準的な手順に従って、メディアで細胞ペレットを再懸濁。 </li></ol>拡張細胞培養およびCFUプレート4.シード<ol><li> α-MEM、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mlペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシンおよび2.5mg / mlのアンホテリシンBを補充した：基礎培地50ml中の（赤血球および単核細胞からなる）細胞を再懸濁。ノイバウアーchambeを使用してトリパンブルー溶液で1:10に希釈した細胞を数えるR。 </li><li> 5×10 7細胞/ cm 2の密度で細胞培養フラスコ中の細胞をプレーティングし、37℃の加湿インキュベーター中でインキュベートする。利用可能な場合は、低酸素（5％酸素）の条件を使用しています。 CFUアッセイの制御のために、直径10cmの細胞培養皿に10 9細胞をプレー。 </li><li>他の細胞は懸濁状態のままで、培養の3日後に、間葉系幹細胞は、細胞培養皿に付着している。 5 / mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を補充した基礎培地でメディアを変更。 CFUアッセイ制御のために、同様に細胞培養皿を扱う。 </li><li>メディア週3回の交換を、2週間の合計のための細胞培養を続けます。細胞が80％コンフルエントを超えた場合、トリプシン処理によって分割。 CFUアッセイ制御のために、同様にメディアを交換しますが、2週間のために細胞を分割しないでください。 </li></ol> CFUアッセイ5.ギムザ染色<ol><li> DIL：皿当たりギムザ-溶液10mlを準備UTE原液（グリセロール中で7.6グラム/リットルギムザ：メタノール）滅菌水で1:10（常に新鮮なワーキング希釈液を調製）。 </li><li>細胞培養皿から培地を除去し、PBSで細胞を洗浄。ペトリ皿に液体を適用するときに非常に警戒して、細胞を洗浄をオフにしないようにしてください。 </li><li> RTで5分間純メタノールで細胞を固定してください。メタノールを捨てる。ギムザ溶液を添加し、37℃の加湿インキュベーター中で60分間インキュベートする。 </li><li> PBSで2回洗浄する。空気は、ペーパータオル上で第一の板状のヘッドを乾燥させる。手動でコロニーを数える。これが最善のプレートの背面にマーカーペンを使用して達成される。 </li></ol> 6. MSCの分化<ol><li>犬MSCの分化 注：犬MSCは、4週間の適切なメディアでの刺激により軟骨、骨形成および脂肪生成系統に分化した。 </li><li>のために 脂肪細胞分化、4×10 5 CEでの単層における培養のMSC次のように二つの異なる培養条件を交互LLS / cm 2で、 <ol><li> DMEM +グルタ、3％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンBおよび170 mMのインスリンを含有する脂肪生成維持培地で培養。 </li><li> 3％FBS、5％ウサギ血清、1μMデキサメタゾン、500μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン、33μMビオチン、5μMロシグリタゾンおよび17μMパントテン酸16を補足した維持培地と脂肪生成誘導メディア文化。 </li><li>オイルレッドOで染色することにより脂肪滴を楽しむ。簡単に述べると、10％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、PBSで洗浄し、イソプロパノール中0.35％オイルレッドOで染色。 </li></ol></li><li> 7×10 3細胞/ cm 2と以下に刺激で単層中の骨形成分化培養MSCの場合： <ol><li>アドバンストDMEM（GIBCO）+グルタ、5％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンB、501; M L-アスコルビン酸-2-リン酸、10mMのSS-グリセロリン酸および100nMデキサメタゾン。 </li><li>フォン·コッサ染色（5％のAgNO 3）で鉱化預金を特定します。簡単に説明すると、蒸留水5％のAgNO 3を含むPBS汚れで洗浄し、10％ホルムアルデヒドで細胞を固定する。 </li></ol></li><li>軟骨細胞分化<ol><li>スポンジ状の医療機器からカットキューブ（側面あたり3 mm）は、凍結乾燥されたI型コラーゲンから構成され、セル17を支持する足場材料として用いる。 </li><li> 4×10 6細胞/ ml（〜7万細胞/立方体）の濃度の立方体の上にシードのMSC。 </li><li>培地の添加の前に、細胞を30分間キューブに付着させる。 </li><li> DMEM / F12 +グルタ、2.5％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンB、40 / mlのデキサメタゾン、50μg/ mlのアスコルビン酸からなる軟骨形成培地中のMSC-コラーゲン構築物を維持する酸2リン酸、を50μg/ mlのL-プロリン、1×インスリン - トランスフェリン - セレンX、および増殖因子β1を形質転換を10ng / mlである。 </li><li>構文セクションにプロテオグリカンの蓄積を可視化するためにアルシアンブルー染色を使用してください。簡単に言えば、0.01％のH 2 SO 4および0.5M塩酸グアニジンに溶解した0.4％アルシアンブルーのセクションO / Nを染色する。次に、洗浄のセクションでは、40％DMSOおよび0.05MのMgCl 2中で30分間洗浄した。細胞を核ファーストレッドで対比染色した。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

患者は少しだけ追加作業が手術室に人員によって行わなければならない利点と、（我々の場合、主に手術を背骨）手術を受けている間に定期的に、我々は、骨髄を​​サンプリングする。サンプルはすぐに撤退した後、クエン酸ナトリウムと混合されるにもかかわらず、彼らは、処理のために研究室に到着したとき、多くのサンプルが部分的に凝固しただった。この段階では、凝固した標本を交換するリサンプリングは、別々の追加の介入が再びローカルまたは全身麻酔6必要となります。これが貢献する臨床スタッフとドナーの両方の意欲を必要とし、資源21を大量に消費する。 ここでは、多能性MSCを分離するために凝固した骨髄サンプルに組換えヒトウロキナーゼを使用するプロトコルを提供する。我々は、ウロキナーゼ処理は細胞を傷つけず​​、分化能が保持されていることを実証できた。プロトコル同等の細胞プールを得ながらunclottedサンプルと比較して、わずか約1 1/2時間によってサンプル処理を延ばすので、短い。現在までに、このプロトコルは正常にいくつかのロットからウロキナーゼを使用して、異なる個人お...

間葉系幹細胞（MSC）は、再生医療及び組織工学における主要な役割を果たしている。彼らは彼らに自家療法の2,3のための理想的な候補をレンダリングしている、様々な細胞タイプ1に分化し、生着、移行することができます。最近、骨および軟骨修復のためのMSCを用いた臨床試験は、宿主病または心臓病、移植片対4を立ち上げた。これらのMSCは、臍帯または脂肪組織から採取することができるが、最も有望な結果は、骨髄由来の幹細胞5から得られた。 腸骨稜は、骨髄のかなりの量を収集することができ、したがって、吸引6の主な部位として働く。しかし、吸引の品質を回収骨髄の体積の増加に伴って減少する。骨髄穿刺液の最初の5mlを、高品質のMSCを含み、一方、より大量の撤退は、末梢血fの吸引物の希釈につながる高度に血管骨7を挿入します。抗凝固剤を使用しない場合は、そのため、本巨核球及び血小板の、骨髄吸引物は、凝固する傾向がある。しかし、たとえ抗凝固剤で、血栓が発生することがあります。 骨髄では、MSCは、全細胞プール8のごく一部を表し、ほとんどの組織工学または治療用途4培養中で増殖しなければならない。そのような文化が大きくすなわち 、初期の細胞プールに依存している。、多様性と高始動番号9の品質。引き出しからMSCの低い数字は、部分的にドナーの変動によって説明することができる。一方、低品質のサンプルからのMSCは、所望の細胞数に到達するために培養においてより長い時間を延長継代を必要とする。いずれの場合も、拡張継代は、細胞老化の源であり、10の潜在的分化の喪失につながる可能性がある。したがって、セルyを最大化することができるプロトコルを最適化ieldと有害な影響を防ぐには、11,12を開発しなければならない。 私たちは、犬のMSCとの仕事を始めたとき、私たちは幸いに凝固したヒトサンプル（10人に1）はあまり頻繁であったが約3〜4におけるイヌの骨髄サンプルは、血栓が含まれているのを見て驚いた。一方で、それは我々が凝固したサンプルからのMSCのはるかに低い収量を観察していることを、全く驚きませんでした。凝固したサンプルの定期的な問題を解決するために、我々は代わりにリサンプリングの血栓溶解薬ウロキナーゼを使用してプロトコルを開発しました。 血栓溶解療法は、心臓発作、脳卒中ため、または不要な凝固の塞栓症の原因となる血管の閉塞などの生命を脅かす状況に対抗することができます。彼らは、プラスミンおよび酵素プラスミノーゲン活性化因子によるフィブリンの酵素的切断を通して血栓の分解によって働く。患者の治療のための幅広い使用にもかかわらず、ごく少数の出版物は、その利用血栓溶解活性を存在実験室でのアプリケーションは、凝固したサンプルを救出するために、主にリンパ球に焦点を当てた。 1987年、肉じゃがら 。 13と4年後の機能的なリンパ球になり、血栓を溶解するためのストレプトキナーゼの使用を記載し、デ·ヴィスら 。フローサイトメトリーアプリケーション14のための血液および骨髄からの白血病細胞を単離するためのストレプトキナーゼの使用を拡張する。より最近の刊行物は、癌の診断15アルテプラーゼの使用を示唆している。同じ酵素アプローチを使用している間、私たちのプロトコルは、多能MSCの分離に焦点を当てて、幹細胞分野の研究者のためのツールを提供するために、骨髄を形成する。

<table><tbody><tr><td>基礎中部成分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inactivated</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>脂肪原性中体成分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>インスリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>ラビットセラム&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>ロシグリタゾン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>パントテンーテ&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>オイル レッドオー</td><td>シグマ</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>骨形成媒体成分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸2-リン酸</td><td>シグマ</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-グリセロリン酸</td><td>シグマ</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>硝酸銀(AgNO3)</td><td></td><td>SigmaS6506</td><td></td></tr><tr><td>軟骨形成培地成分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopad - スポンジ型医療機器&nbsp;</td><td>ユーロリサーチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-プロリン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン x</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>ヒト形質転換成長因子-&β;1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>アルシアン ブルー 8GX</td><td>シグマ</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>核ファスト レッド</td><td>シグマ</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>ジェネリック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>ウロキナーゼ</td><td>メダック</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0.5% トリプシン EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa 染色</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>硫酸 (H2SO4)</td><td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 反応チューブ</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>ブラウン</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>ステリカン針 (22G)</td><td>ブラウン</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml マイクロチューブ</td><td>ブランシュヴィヒ</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>ファルコン</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>滅菌鉗子</td><td>Bastos Viegas、SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>滅菌メス</td><td></td><td></td>ブラウン5518059<td></td></tr><tr><td>プリマリア細胞培養皿</td><td>ファルコン</td><td></td>353803 <td></td></tr><tr><td>Cチップノイバウアー改良バイオ</td><td>スイステック</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ-フラスコT300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微生物バイオセーフティキャビネット クラスII</td><td>スカン</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>メモリ</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>ストライペット 血清ピペット 5ml</td><td>コーニング</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>加湿インキュベーター ヘラセルズ 240</td><td>サーモ科学</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>ヘレウスMultifuge 1S-R</td><td>Thermo scientific</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

間葉系幹細胞(MSC)は、通常は骨髄から採取されますが、しばしば増殖培養が必要です。私たちのプロトコルは、臨床グレードのウロキナーゼを使用して骨髄の血栓を分解し、MSCを放出してさらに使用します。このプロトコルは、骨髄リサンプリングに代わる迅速で安価な代替手段を提供します。骨髄はMSCの主要な供給源であり、組織工学や自家幹細胞療法にとって興味深いものです。骨髄が抜血すると、造血系のすべてを含むため、骨髄が凝固することがあります。得られた血栓には、増殖培養または直接幹細胞治療のために失われたMSCも含まれています。イヌの骨髄サンプルの74%に血栓が含まれており、凝固していないサンプルから予想される幹細胞数の半分未満しか得られなかったことを経験しました。したがって、私たちは、労働集約的で費用のかかる骨髄の再サンプリングを避けるために、これらの血栓の酵素消化のためのプロトコルを開発しました。ウロキナーゼは、臨床的に承認され、すぐに入手できる血栓溶解薬であり、骨髄の血栓をほぼ完全に除去します。その結果、治療された骨髄穿刺液は、凝固していないサンプルと同数のMSCを生成します。また、ウロキナーゼ治療後も、細胞は代謝活性を維持し、軟骨形成、骨形成、脂肪形成の系統に分化する能力を維持しました。当社のプロトコルは、細胞の品質に影響を与えることなく、凝固した血液および骨髄サンプルをサルベージします。これにより、リサンプリングが廃止され、サンプリングコストが大幅に削減され、凝固したサンプルを研究や治療に使用できるようになります。

と一緒に、彼らは私たちの研究室（ 図1A）に到着したとき、犬の骨髄サンプルの74パーセント（N = 54）は血栓を含んでいたことの事実は、私たちはMSCの相当数が、血栓内に捕捉されたと信じていた、これらのサンプルからMSC利回りの低下。実際に、切片凝固材料の単純なDAPI染色は、高密度（ 図1B）中の有核細胞の存在を確認する。これは最終的にウロキナーゼを使用してプロトコルを開発するために私たちをトリガー拡張文化に利用可能なMSCの低い数字、につながる。一般的に私たちのプロトコルを適用した場合、ほぼ完全に消失凝固する。ただし、メソッドの開発中に、我々はダイジェストの前後に計量することによって体系的にダイジェスト血餅の問題に取り組んだ。これらの実験は、未消化の残りは、初期血餅重量（ 図2A）の15％（イヌ）または9％（ヒト）であることが明らかになった。 骨髄由来MSCの典型的な特徴はAです細胞培養皿に付着するビリティ。研究者は、MSCのために選択するには、この特性を利用する。結果として...

間葉系幹細胞は通常、骨髄から得られ、拡大培養が必要です。処理前にサンプルが凝固する場合は、(酵素)血栓溶解薬ウロキナーゼを使用したプロトコルを適用して血栓を分解することができます。したがって、細胞は放出され、拡大培養に利用できるようになります。このプロトコルは、リサンプリングに代わる迅速で安価な代替手段を提供します。

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

本手順の全体的な目的は、ウロキナーゼを用いて凝固物を消化させることで、凝固した骨髄サンプルを活用することです。まず、骨髄サンプルをセルストレーナーでろ過します。次に、骨髄の凝固物を小さく切り分けます。次に、血塊をFalconチューブに移し、ウロキナーゼを用いて消化します。最後に、消化した血塊材料を播種し、間葉系幹細胞（MSCs）を増殖させます。最終的に、em sustainを用いたコントロールプレートと比較し、消化の効率を評価します。この手法の意義は、自家幹細胞治療や診断へと展開されます。移植には大量の幹細胞の増幅と分化が必要であるためです。DOCから提供された多くの骨髄サンプルが、当研究室に届いた時点で凝固していたことに気づいたことが、この手法を考案するきっかけとなりました。このような貴重なサンプルを廃棄したくありませんでした。ウロキナーゼを再構成するには、滅菌PBS 10 mLをセプタム注入フラスコに注入し、ボルテックスして濃度が50,000 units/mLになるまで溶解させます。25,000 unitsずつ500 µLを滅菌チューブに分注し、-20 °Cで最大6ヶ月間保存します。消化反応を行うには、最大25 mLの骨髄穿刺液1検体につき、ウロキナーゼの分注液1本を解凍します。ラミナーフローバイオセーフティキャビネット内で、ウォーターバスまたは振盪インキュベーターを37 °Cに予熱します。次に、手袋を着用した状態で、50 mLチューブの上に100 µmセルストレーナーを配置します。骨髄吸引液をセルストレーナーに慎重に注ぎ、ストレーナーを傾けるか、凝固物を動かしてろ過します。骨髄吸引液を、ストレーナーを傾けたり凝固物を動かしたりしないように注意して、セルストレーナーに慎重に注ぎます。滅菌鉗子を用いて滅菌ピペットで操作することで、フィルターメッシュへの流れをスムーズにします。骨髄の凝固物を空の細胞培養ディッシュに移します。次に、滅菌済みメスを用いて、デブリを2立方ミリメートルの大きさに切断します。続いて、5ミリリットルのマイクロタイターピペットを用い、ピぺッティングを5回繰り返し、凝固物を分散させます。その後、サンプルにウロキナーゼを1アリコート分加え、恒温槽または振盪インキュベーターを用いて37 °Cで30分間インキュベートします。バイオセーフティキャビネット内でのインキュベーション後、再度トリチュレーションを行い、さらに30分間インキュベートします。その後、さらに5回トリチュレーションし、サンプルを新しい100 µmのセルストレイナーに通して、最初のろ過液と合わせて回収します。細胞懸濁液を500 ×g、室温で10分間遠心分離します。上清を捨てた後、50 mLの基本培地を用いてペレットを再懸濁します。トリパンブルー溶液を用いて、再懸濁した細胞のALIクアッドを10倍に希釈し、その懸濁液をノイバウエル計数器に加えて細胞数を計測します。細胞数を数えた後、CFUアッセイのコントロールプレート用として、細胞密度5×10⁷ cells/cm³で細胞培養フラスコに播種します。10⁹ 個の細胞を直径 10 cm の円形細胞培養皿に入れ、37 °C の加湿チャンバー内で培養します。3 日間の培養後、MSC は細胞培養皿に接着し、その他の細胞は浮遊状態のままとなります。実験群および対照群の両方のプレートにおいて、5 ng/mL の塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎培地を用いて培地を交換します。合計2週間、培養を継続する。培地交換は週に3回行う。細胞のコンフルエンスが80%を超えた場合は、トリプシンを用いて培養物を剥離し、分割してCFUアッセイを行う。ストック溶液を滅菌水で10倍に希釈し、ディッシュ1枚あたり10 mLのGSA溶液を調製します。細胞培養ディッシュから培地を除去し、PBSを用いて細胞を注意深く洗浄した後、純メタノールで洗浄します。室温で5分間、細胞を固定します。次に、メタノールを除去し、ギムザ液を加えます。固定後、加湿チャンバー内にて37 °Cで60分間インキュベートします。PBSを用いて細胞を2回洗浄します。その後、プレートを風乾させます。プレートの裏面にマーカーで印を付け、ペーパータオルの上に上向きに置きます。脂肪分化のためのコロニー数を手動でカウントします。MSCを1cm²あたり4×10⁵個の密度で単層培養します。最初の条件について、2つの異なる培養条件を交互に適用します。細胞を培養し、テキストプロトコルに記載されたレシピに従って、脂肪分化維持培地で培養します。また、2番目の条件では、脂肪分化誘導培地と維持培地を用いて細胞を培養します。脂質滴を可視化するために、10% formaldehydeを用いて細胞を短時間固定します。次に、PBSで細胞を洗浄し、0.35% oil red O（イソプロパノール溶液）を用いて、細胞を骨分化染色します。MSCを1 cm²あたり7×10⁵個の密度で単層培養します。本文のプロトコルに記載された培地を用いて細胞を刺激した後、10%形式ホルムアルデヒドを用いて細胞を短時間固定します。PBSで細胞を洗浄した後、Von Kossa染色を用いて鉱物沈着を同定します。凍結乾燥コラーゲンI型で構成され、一辺3 mmの立方体にカットされたスポンジ状の医療デバイスを用いて軟骨分化を行います。室温で30分間細胞を立方体に付着させた後、4×10⁸ cells/mLの濃度でMSCを立方体上に播種します。テキストのプロトコルに記載されている通り、MSCコラーゲン構築物をコンジェニック培地で維持します。切片に0.4% Ian Blue溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、40% DMSOと0.05 M 塩化マグネシウムを用いて細胞を30分間洗浄した後、ここで示すように核速染赤色（nuclear fast red）を用いて細胞を対比染色します。血栓物質の単純なDAPI染色切片により、核を持つ細胞が高密度に存在することが確認され、かなりの数のMSCが血栓内に捕捉されていることが示されました。本ビデオで説明したプロトコルを用い、ウロキナーゼ処理を行うことで、犬の血栓では重量の15%、ヒトの血栓では重量の9%を除いてすべて消化することができ、ウロキナーゼ消化の有効性が確認されました。血栓サンプルのろ過液からの細胞と消化後の血栓からは、それぞれ個別に細胞を播種し、2週間インキュベートしました。細胞の維持において、ウロキナーゼ消化後のイヌサンプルからは、対応する初期ろ過液よりも3.8倍多くのCFUが示されました。ヒトの消化サンプルでは、未消化のろ過液よりも1.6倍多くのCFUが示されました。本実験では、骨髄凝固塊由来のMSCとUNC凝固骨髄サンプル由来のMSCについて、適切な培養条件下での分化能を比較しました。4週間の培養後、消化サンプルから得られたMSCを、脂肪分化、骨分化、および軟骨分化の各系統へと分化させることが可能でした。さらに、von Casa油、レッドO、およびシアンブルーによる染色では、群間での分化度に差は見られませんでした。習熟すれば、適切に行うことでMr.Nickは約1時間半で完了させることができます。このビデオを視聴することで、サンプルが凝固していてもそれを破棄せずに、拡大培養のための造血幹細胞を単離する方法について十分に理解することができます。本プロトコルでは、酵素キナーゼを用いて凝固物を消化し、拡大培養用のES幹細胞を回収します。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。...

ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別

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造血器官からの間質細胞の単離

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マウス由来骨髄間葉系幹細胞の精製、増殖、およびフローサイトメトリーに基づく表現型解析

本プロトコルは、フィコエリスリン(PE)標識されたフローサイトメトリー抗体と抗PEマイクロビーズを用いて、高価な細胞選別機や標的特有のカスタムビーズを必要とせず、試験条件下で高い後選定標的マーカー陽性率とCCK-8ベースの増殖・代謝活性を維持する特定の間葉幹細胞サブポピュレーションを分離する磁気ビーズベースの選別法を説明しています。...

間接磁気ビーズ戦略を用いたポドプラニン陽性間葉質幹細胞サブポピュレーションの単離と検証

学ぶ、ウロキナーゼを用いて凝固した骨髄試料から間葉系幹細胞を分離・培養する方法。迅速かつ低コストで貴重な試料を有効活用し、再生医療研究への応用が可能です。

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

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