Name: などの酸素グルコース欠乏および再酸素化インビトロ虚血再灌流傷害モデル血液脳関門の機能障害を研究するための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ酸素グルコース欠乏・再酸素化法による虚血再灌流傷害モデル。ラット脳微小血管内皮細胞を用いて血液脳関門機能障害のメカニズムを解明し、免疫蛍光染色で緊密結合と細胞骨格変化を評価する方法です。

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我々は、共焦点レーザー顕微鏡を使用するための財政支援と医療の統合イメージング研究所のテキサスA＆M健康科学センター大学のためにスコットと白病院研究費補助金プログラムを認めます。私たちは、原稿編集のヘルプ氏グレンクライヤーを認めます。

内皮細胞の1播種<ol><li>大人のSDラットからRBMEC年代の初代培養物を得る（または商業的にそれらを得ます）。 </li><li> 100センチメートルフィブロネクチン（50μg/ mlの）ラット脳内皮細胞増殖培地を用いて被覆されたペトリ皿で​​RBMECs育成。密集度に到達するまで、2日ごとに培地を変更します。 </li><li> 80〜90％コンフルエントに達すると、穏やかに旋回を5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。次いで、細胞を37℃に平衡化した温かい0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液1ml、それらを暴露することによって分離されます。 </li><li>細胞が剥離して分散されるまで2〜5分間、37℃で細胞をインキュベートします。 注：細胞を剥離するために培養皿をタップします。顕微鏡下で見る細胞が皿の表面から細胞を完全に剥離を確認しました。 </li><li>トリプシンを中和するためにペトリ皿に5ミリリットル完全培地を追加します。剥離した細胞を含む培地をピペット15mLの遠心分離管にそれを収集します。 。 </li><li>遠心分離媒体を5分間220×gでの内皮細胞を含みます。 </li><li>上清を吸引した後、自動細胞カウンターまたは血球計数器を用いてカウントされるピペット細胞で軽くそれを混合することにより、およびダウン3〜5ミリリットルの新鮮なラット脳内皮細胞増殖培地中にcells.Suspendにペレットを含むペレットを保存します。 </li><li>ウェルあたり10,000〜15,000細胞の間の範囲の播種密度で8ウェル滅菌チャンバースライドシステム0.7 cm 2で/ウェルをプレコートフィブロネクチンへの細胞懸濁液（50μg/ ml）を転送します。コンフルエンスが達成されるまで37℃で細胞を増殖させます 注：実験によって要求されるようにウェスタンブロットまたは他の実験を行うために、細胞を10cmの細胞培養皿または特殊皿で増殖させることができます。 </li></ol> 2.酸素およびインビトロでのグルコース欠乏、再酸素化モデル注：以下のプロトコルをスルエタらから適応されています。 1997;朱H ら。2012 8,9。 <ol><li> （ 図1参照）でRBMECsのOGD-Rの効果を研究するために、低酸素細胞培養システムを使用してください。セットアップし、製造業者の指示に従って、実験を開始する前に、低酸素細胞培養系を較正します。 </li><li> 37℃のインキュベーターからコンフルエントチャンバースライド（ステップ1.8）を取り外します。 OGD状態を表すために、37℃で2時間、脱酸素とチャンバースライドで完全培地、無グルコース、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および95％の低酸素チャンバーに入れ、N 2及び5％CO 2を交換します。 </li><li> 37℃で95％O 2、5％CO 2インキュベーターで逆に細胞を移動させ、新鮮なラット脳内皮細胞の完全な媒体を備え、37℃でさらに1時間インキュベートします。 注：このステップは、再酸素化の状況を表しています。 </li><li>免疫蛍光局在化およびローダミンファロイジン標識のためチャンバースライドを使用します（セクション3を参照）。 </li></ol> 3.免疫ZO-1の局在とローダミンファロイジンを使用したFアクチンラベリング<ol><li> OPTI-MEM /低血清培地/ウェルの1時間の100μlにRBMEC単層を含むチャンバースライドを公開します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pHが7.0〜7.2）100μlのチャンバースライドを3回洗浄します。 </li><li> 15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（pHは7.0〜7.2）の100μLを使用して細胞を固定し、PBSで3回（pHは7.0〜7.2）のためのチャンバースライドを洗浄します。 </li><li>さらに15分間、PBS中0.5％トリトンX-100100μlの、（pHが7.0〜7.2）を用いて細胞を透過性。時間、PBS中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）100μlでブロックします。 ZO-1またはF-アクチンのためのこのステップのいずれかで染色/ラベル細胞のいずれかの後に。 <ol><li>免疫STA用ining 1にZO-1に対する抗ウサギ一次抗体で細胞をインキュベートする：150、Oのために/ N 4℃にて2％BSA-PBS中で調製しました。細胞をPBS中で3回、（pHは7.0〜7.2）を洗浄します。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）100μlでインキュベートし、室温で1時間、抗ウサギ二次抗体をタグ付き。 </li><li>ローダミンファロイジン標識のために、ブロッキングに続いて、20分間、2％BSA-PBS中で調製し、1：50希釈でローダミンファロイジンの100μlに細胞を公開します。 </li><li> （pHは7.0〜7.2）、PBS中の免疫蛍光染色およびローダミンファロイジン標識から細胞を洗浄します。 DAPIと退色防止試薬を含むマウント培地を用いてチャンバをマウントします。 </li></ol></li><li> 60 Xの水浸レンズを用いて細胞を視覚化し、細胞を共焦点顕微鏡下で単一の光学面に走査されます。 </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

虚血再灌流障害のためのin vitroモデルとしてOGD-Rはよくニューロン10,11を研究するために設立されました。透過性及びTJの整合9における脳内皮細胞および変更のOGDの影響を示す研究もあります。しかし、我々の研究は、虚血性脳卒中後の発生のインビボ条件における虚血再灌流障害の近い表現である、OGDの影響だけでなく、再酸素化を示しています。 低酸素性虚血性の条件は、傍細胞透過性および血管原性浮腫4を増加させることによって、破壊をBBBに至る、中枢神経系の炎症を誘発することが知られています。再灌流障害は、過剰な活性酸素種の生成がである、非常に複雑で動的なプロセスであるATP枯渇、細胞外カリウム、興奮性神経伝達物質の放出、内皮細胞および神経細胞の腫脹、免疫細胞活性化の上昇します。このターンCでBBBの完全性5,12の破壊につながる、さまざまなカスパーゼを活性化することが示されているすべてのそれらのausesの種々の炎症性経路の活性化、サイトカイン産生につなが...

虚血再灌流（IR）傷害は、脳卒中、心筋梗塞、外傷、末梢血管疾患および外傷性脳損傷1,2に関連する様々な衰弱性の合併症や死亡の頻繁な原因であることが見出されています。脳血管のIR傷害は、炎症および浮腫3につながる初期の二次的損傷です。酸化および炎症次代謝ストレスの結果として生じる重篤な合併症の一つは、恒常的なフリーラジカル形成をもたらすバランス、血液脳関門の変化（BBB）タイトジャンクション（のTJ）と微小血管透過性4,5の損失です。 現在、BBBにおけるIR傷害の影響を研究するために使用される生体内モデルにおいて 、中大脳動脈閉塞（MCAO）、微小塞栓、およびトランスジェニックまたはノックアウト動物を含みます。 Hossmann 6で説明したようにしかし、それぞれがその欠点と制限があります。 MCAOモデルはeffecを研究するために使用されますレドックスストレスのTS、BBBの接合部コミュニケーションの変化と脳と免疫細胞間の相互作用。しかし、彼らはその中に正確な顕微手順や困難の必要性など、様々な技術的な課題を提示します。脳虚血を研究するためのトランスジェニックまたはノックアウト動物の使用は、梗塞形成上の遺伝子に依存する分子の影響、血管構造の変化と変化させ、体重6のような課題を持っているかもしれないが微小塞栓は、瞬時にBBBを分解します。したがって、虚血のin vitroモデルは、薬物のための機構研究を行う際にその適用に起因する主に最近の関心を増大させる発見しました。しかし、in vitro試験の結果が完全にin vivo試験を表していない場合があり、注意6と解釈されなければなりません。 内皮細胞単層および微小血管透過性の低酸素濃度の反作用効果がありました小川7によって研究。ラット脳微小血管内皮細胞（RBMECs）はインビトロ BBBを開発するために使用されました。このプロトコルで提示酸素-グルコース欠乏と再酸素化（OGD-R）技術はスルエタらと朱ら 8,9によって研究から適応されています。我々は、0％O 2、5％CO 2及び95％N 2を含む、低酸素/無酸素チャンバー中に置くことにより、OGD-Rの脳内皮細胞を曝露しました。細胞は、後にそれぞれの免疫蛍光局在化およびローダミンファロイジンラベルを使用して、TJの整合性とストレスファイバー形成の変化について評価しました。閉鎖帯-1（ZO-1）についての免疫蛍光染色は、ZO-1と、TJの完全性を決定するために実行されることTJタンパク質に結合した重要な足場膜です。ローダミンファロイジン標識が細胞骨格に繊維状アクチン（Fアクチン ）を決定し、内皮細胞におけるアクチンストレスファイバー形成の明確な指標です。 &lt;Pクラス= &quot;jove_contentは&quot;&gt;この方法の目的は、BBB内皮細胞TJの整合性とF-アクチンストレスファイバー形成を研究するためのin vitroでの IRモデルとしてOGD-Rの開発に洞察力を提供することにあります。結果は、TJタンパク質の運命についての情報を提供し、ZO-1およびOGD-R次のストレスファイバー形成します。これらの関係を理解することはOGD-R以下のトリガされる根底にある分子メカニズムを決定し、OGD-R処理後のBBB破壊を増強する潜在的な治療戦略を開発する機会を提供します。

<table><tbody><tr><td>Proox model 110</td><td>Biospherix</td><td>model 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp;よく無菌、ガラス&nbsp;スライド&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>FITCタグ付き抗ウサギ二次抗体&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>SH 30028.03</td><td>利用可能な他のPBSを使用することができます</td></tr></tbody></table>

などの酸素グルコース欠乏および再酸素化<em&gt;インビトロ</em&gt;虚血再灌流傷害モデル血液脳関門の機能障害を研究するための

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

虚血再灌流（IR）傷害は、虚血性脳卒中に関連する罹患率および死亡率に大きく寄与することが知られています。虚血性脳血管障害は、すべてのストロークの80％を占めています。 IR傷害の一般的な原因は、血液の急性/慢性閉塞次流体、栄養素、フリーラジカルの形成を誘発する組織への酸素の迅速な流入です。 虚血性脳卒中は、血液脳関門（BBB）機能不全および血管原性脳浮腫が続きます。構造的には、内皮細胞間のタイトジャンクショ​​ン（のTJ）は、血液脳関門（BBB）の完全性を維持する上で重要な役割を果たしています。 IR傷害は、非特異的、炎症反応を引き起こす早期二次損傷です。炎症次酸化および代謝ストレスがBBBの透過性とタイトジャンクショ​​ン（TJ）の完全性の破壊などの二次的脳損傷を誘発します。 我々のプロトコルは、in vitroでの提示します&lt;/ em&gt;のラット脳内皮細胞TJの整合性とストレスファイバー形成の酸素 - グルコース欠乏と再酸素化（OGD-R）の例。現在、in vivoモデルでいくつかの実験は、IR傷害の影響を研究するために使用されます。しかしそれらは、手術、遺伝子依存性分子の影響とメカニズムの関係を研究することの困難を行う際に技術的な問題など、いくつかの制限があります。しかし、in vitroモデルは、これらの制限の多くを克服するのを助けることができます。提示されたプロトコルは、潜在的な治療戦略を提供するために、様々な分子機構と機械的な関係を研究するために使用することができます。しかし、in vitro試験の結果は、in vivo試験で 、標準と異なる場合があり、注意して解釈されるべきです。

フィブロネクチンプレコートヌンクIIチャンバースライド上で培養した細胞はBiospherix ProOxモデル110チャンバー内に配置することにより、OGD-Rに供しました。ローダミンファロイジン染色ラベルを使用して、Fアクチンストレスファイバーの形成を示す図2及び細胞骨格の組み立てに示すように、図3に示すように、OGD-Rの細胞を施した後、それらは、免疫蛍光技術を使用してZO-1接合部染色のために処理した。あった対照細胞をOGD-Rに供内皮細胞がTJインテグリティ図2の消失を示し、不連続な接合を示したOGD-Rを受けないで継続的な接合部の完全性を示さなかった。OGD-R処理を行わなかった対照細胞は、全くまたは最小限のFアクチンストレスファイバーを示しました。形成OGD-Rにかけた内皮細胞は、アクチン細胞骨格の組み立て図3の変化を示す増加Fアクチンストレスファイバー形成を実証している間、代表<html>リファレンス＃13からの許可を得てRINT <p clas...

虚血再灌流(IR)損傷は、高い罹患率と死亡率と関連しています。ここで説明する酸素-グルコース欠乏および再酸素化(OGD-R)のin vitroモデルの目標は、さまざまな細胞、特に血液脳関門(BBB)内皮細胞に対する虚血再灌流障害の影響を評価することです。

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

この手順の全体的な目的は、血液脳関門機能不全を研究するためのin vitro虚血再灌流障害モデルとして、酸素・グルコース剥奪の役割を実証することです。これは、チャンバースライドで培養した脳血管内皮細胞の培地を脱酸素・無グルコース培地に置換して酸素・グルコース剥奪状態にし、低酸素チャンバー環境に2時間置くことで達成されます。その後、細胞を通常条件に戻して1時間置くことで再酸素化を行います。細胞の処理後、Zola Occludin oneの免疫蛍光染色およびフィラメント状アクチンのRod Domine Phinラベル化を実施します。次に、共焦点顕微鏡と60x水浸レンズを用いて細胞を撮影し、解析用の単一光学的スライスを取得します。この手順の実演は、私の研究室の大学院生であるhem negaが行います。手順を開始する前に、成体sprag-dawleyラットから作製した一次培養RBM eecsを用意してください。市販の細胞株を使用しても構いません。フィブロネクチンでコーティングした100 cmディッシュでR BM EECSを培養し、ラット脳血管内皮細胞増殖培地を用いて、1日おきに培地を交換します。細胞が80〜90%コンフルエントになるまで培養します。その後、5 mLのPBSで細胞を穏やかに洗浄します。次に、1 mLの温めた0.25% trypsin EDTA溶液を加え、プレートを旋回させて細胞をプレートから剥離させます。その後、細胞を2〜5分間インキュベートします。ディッシュの側面を軽く叩いて細胞の剥離を促進させ、顕微鏡下で細胞が剥離したことを確認します。トリプシン処理を停止させるため、完全培地を5 mL加え、剥離した細胞を含む培地をピペットで吸い出して15 mL遠心チューブに回収します。細胞を含む培地を220 Gで5分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。その後、5 mLピペットで細胞を穏やかに流し、3〜5 mLの新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁します。次に細胞数を計測し、フィブリンおよびアクチンでコーティングした8ウェルチャンバースライドの各ウェルに20,000～30,000個ずつ播種します。もちろん、他の用途に応じて異なる方法で培養することも可能です。その後、準備として細胞がコンフルエントになるまでチャンバースライドをインキュベートします。低酸素細胞培養システムを設置し、キャリブレーションを行います。メーカーの指示に従い、チャンバー内環境を95%窒素、5%二酸化炭素、37 °Cに設定してください。次に、グルコースフリーDMEMを低酸素チャンバー内に4〜6時間静置し、脱酸素化させます。培地を脱酸素化しグルコースを含まないDMEMに交換し、細胞を低酸素チャンバーに2時間入れることで、細胞にストレスを与え始めます。2時間後、細胞をラット脳血管内皮細胞完全培地に戻します。その後、細胞を通常条件に戻し、1時間かけて再酸素化させます。まず、R-B-M-E-C単層の各ウェルに100〜200 µLの最適化還元血清培地を添加し、1時間インキュベートします。次に、1回につき各ウェルに100〜200 µLのPBSを用いて、チャンバースライドを3回洗浄します。PBSに含まれる4%パラアルデヒドで細胞を固定し、室温で15分間インキュベートした後、前述と同様にPBSで細胞を3回洗浄します。次に、各ウェルにPBSで希釈した0.5% Triton X 100を100～200 µL添加して細胞を透過処理し、プレートを室温でさらに15分間インキュベートします。細胞の透過処理後、ブロッキング溶液を添加し、室温で1時間作用させます。その後、ZO-1タンパク質の免疫蛍光染色を行うか、またはF-actinの標識を行います。ZO-1の細胞免疫蛍光染色を行うには、一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。翌日、固定液を除去した際と同様に、PBSで細胞を3回洗浄します。その後、100〜200 µLのFITC標識抗ウサギ二次抗体を用いて、室温で1時間インキュベートし、細胞をロドミンで標識します。ブロッキング溶液を1時間適用した後、2% B-S-A-P-B-Sで1:50に希釈したR domine Phin 100～200 µLを細胞に添加し、20分間反応させます。二次抗体またはR domine Phinによるインキュベーション後、前述と同様にPBSで細胞を3回洗浄します。その後、ゴムを剥がしてチャンバーを取り除きます。抗退色剤を含む封入剤を用いてスライドを封入し、DPI画像を取得する。共焦点顕微鏡を用い、60 x 対物レンズで単一平面の細胞を観察する。細胞はフィブロネクチンコートされたチャンバーで培養したものである。スライドを低酸素チャンバーに入れることにより、OGDRにさらした。詳細は既述の通りである。その後、細胞をZO-1ジャンクショナル（junctional）用に処理した。染色したコントロール細胞では接合部の完全性が維持されていましたが、酸素およびグルコース飢餓細胞では接合部の断裂が見られました。さらに、F actinを標識するphalloidinを用いて細胞骨格の変化を観察しました。ストレスファイバー形成において、コントロール細胞ではF ACTの形成が認められないか最小限でしたが、OGDRにさらされた細胞ではストレスファイバーの形成が増加していました。このビデオを視聴することで、酸素およびグルコース飢餓（OGD）および再酸素化の実施方法について十分に理解することができます。この手法は、血液脳関門、タイトジャンクションの完全性、およびストレスによる線維形成を研究するための虚血再灌流傷害モデルとして利用可能です。

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

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医学

出典:Alluri, H., et.al.血液脳関門機能障害を研究するためのIn Vitro虚血再灌流損傷モデルとしての酸素-グルコース欠乏と再酸素化。J. Vis. Exp.

酸素-グルコース欠乏と再酸素化が細胞間相互作用に及ぼす影響

全身性低血圧と相まって、二国間の頸動脈閉塞は再現重症度と海馬への損傷、その結果、ラットの全脳虚血を生成します。動物の被験者は脳損傷の予測可能なパターンで損なわれて、彼らは便宜上回復し、死亡率は比較的低いです。...

2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

インビトロで外傷性脳損傷モデルは、in vivo脳の変形が再現するために開発されている。延伸誘起損傷は星状細胞、神経細胞、グリア細胞、大動脈、脳内皮細胞のために用いられている。しかし、我々のシステムは、in vitro TBIモデルで確立するためにこちらの正当なモデルを構成する特性を持っている血液脳関門（BBB）モデルを使用しています。...

として脳微小血管内皮細胞（CEND）でストレッチ<em&gt;インビトロ</em血液脳関門の&gt;外傷性脳損傷モデル

虚血性脳損傷の多くの局面を再現することができentorhino海馬器官型切片培養のためのプロトコルは、提示される。神経細胞の変化に加えて、神経脈管構造の変化を研究することによって、このプロトコルは、損傷後の神経組織内のプラスチック製の変化を研究するための汎用性の高いツールです。...

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

このプロトコルは、マウスにおける一過性中大脳動脈閉塞後の梗塞容積と血液脳関門の破壊を減少させる反復的な低酸素プレコンディショニング、または全身性低酸素症への短時間の曝露について説明しています。また、脳卒中後の梗塞容積と血液脳関門の破壊の二重定量化についても詳しく説明し、神経血管保護の有効性を評価します。...

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

虚血性脳卒中、酸素無グルコース (OGD) に影響を受ける脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献がさらされて複雑なイベントは調査しにくい。孤立したアストロ サイトを取得し、反応性、OGD...

反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視

プロトコルの目的は、プライマリ ブタ脳血管内皮細胞 (pBECs) に基づく体外血液脳関門 (BBB)...

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

この手順の全体的な目標は、虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊の生体内評価の再現性の高い技術を提供することです。...

虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊のIn Vivo評価

ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。...

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

ここでは、初代ヒト脳微小血管内皮細胞、アストロサイト、周皮細胞に基づく血液脳関門のトリプルセル培養モデルの確立方法について述べる。この多細胞モデルは、 in vitro...

虚血性脳卒中をin vitroで研究するためのヒト血液脳関門のトリプル初代細胞培養モデル

血液脳関門(BBB)は、安定した健康な脳環境を維持する上で重要な役割を果たしています。BBB機能障害は、多くの神経疾患と関連しています。私たちは、脳血管の病理学、BBBの完全性、およびBBBが遺伝学や疾患によってどのように変化するかを調べるために、BBBの3D幹細胞由来モデルを開発しました。...

神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

学ぶ酸素グルコース欠乏・再酸素化法による虚血再灌流傷害モデル。ラット脳微小血管内皮細胞を用いて血液脳関門機能障害のメカニズムを解明し、免疫蛍光染色で緊密結合と細胞骨格変化を評価する方法です。

などの酸素グルコース欠乏および再酸素化

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