Name: EAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:23:00.000+00:00
Duration: 20 min 51 s
Description: 学ぶEAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法。心臓灌流による血液汚染の除去とPercoll密度勾配遠心分離を用いて、フローサイトメトリーなどの下流解析に適した生存細胞を得る技術です。

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<ol><li> 深くラットを麻酔。 70％エタノールでスプレーし、血管から細胞を（左心室を介して右心房と浸み込ませるをカット）を除去するために10分間PBSで心臓灌流を行う。 </li><li>氷冷したPBSを含む50 mlのチューブに脳と脊髄と場所を削除します。氷冷PBSの10mlを含む10cmペトリ皿に配置された70mmのセルストレーナーに脳と脊髄を切る。滅菌1 mlのシリンジプランジャの背面を使用してセルストレイナーを通して器官の各部分を押してください。氷上で50 mlチューブに、単一の細胞懸濁液を収集する。 PBSで細胞ストレーナーを洗浄し、溶液が透明になるまでチューブに加える。 </li><li> 390 gで80〜10分間遠心する</li><li> PBS + 70％パーコール10 mlの上に20ミリリットルのPBS + 30％パーコールとオーバーレイで細胞を再懸濁します。 </li><li>室温で20分間390グラム間遠心。 </li><li>チューブの上に脂肪を取り除く。インタフェースから細胞を回収し、PBSで2回洗浄する。カウント。 </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+clinical+scoring+of+chronic-relapsing+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.</li>
</ol>

この手順は、生きた動物を含むすべての手順として、所属機関の動物の利用とケアの委員会によって承認されなければならない。我々は、前と手順の間に動物に与えられる麻酔の十分なレベルを確保する最初心臓perfusionsを実行する際に獣医師や動物看護士が存在すること、そして動物が不必要な痛みや苦痛を経験しないことをお勧めします。

<table><tbody><tr><td>PBS, 1x, 滅菌済み</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー, 70 um</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td></td></tr></tbody></table>

eaeモデルラットの中枢神経系から単核細胞の単離

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

このようなポリオ、ライム神経ボレリア、または神経梅毒などの実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE、1）、または中枢神経系の感染に対する免疫応答などの中枢神経系（CNS）、、に向けられた自己免疫疾患を研究するかどうか、それはしばしばです。 CNS浸潤免疫細胞を単離することが必要。 このビデオプロトコルでは、EAEとラットの中枢神経系から単核細胞を（国籍）を分離する方法を示しています。この手順の最初のステップは、血液がCNSを灌漑血管に残っていないことを確認するために生理食塩水と齧歯類の​​心臓の灌流を必要とします。あらゆる血液汚染は人為的に明らかにCNS浸潤多国籍企業の数が増え、浸透させる免疫の見かけ上の構成を変更することがあります。我々は、シングルセル懸濁液を調製するために、後続の引き裂くことのためにラットの脳と脊髄を除去する方法を示します。この懸濁液を多国籍企業を分離する二層Percoll勾配で分離されています。洗浄後、これらの細胞はその後、必要な手続きを受けるために準備が整いました。 この手順を使用して単離された単核細胞は生存可能であり、電気生理学、フローサイトメトリー（FACS）、または生化学のために使用することができます。技術は無菌条件下で行われている場合（組織培養フードの滅菌器を使用して）細胞も組織培養培地で成長させることができる。特定の細胞集団は、さらに磁気分離の手続またはFACSのいずれかを使用して精製することができる。

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎を持つラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法を示します。

EAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞の単離

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE, 1）のような中枢神経系（CNS）を標的とする自己免疫性疾患を研究する場合であっても、あるいは...

こんにちは。クリスティーン・ビートンです。カリフォルニア大学アーバイン校の生理学・生物物理学部のジョージ・チェン研究室で助手研究員を務めています。本日は、ラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法について解説します。本手順では、中枢神経系に血液などの混入物質が残らないよう、ラットを深く麻酔して心拍灌流を行います。その後、脳と脊髄を取り出し、セルストレーナーを用いて単一細胞懸濁液を調製します。そして、Percollの二層密度勾配を用いて、単核細胞を単離します。それでは、開始しましょう。これから心臓灌流を行いますので、それに必要な材料をすべて紹介します。まず最初にベルジャーを用意し、その下に揮発性麻酔薬を浸したペーパータオルを置きます。麻酔薬には、ハルタンやイソフルランを使用できます。次に必要なのは、ラットを固定する器具と、血液を回収するための器具です。ここでは、ラットの灌流を行うための簡易的な装置を用意しています。21ゲージの針を使用し、IV灌流システムを用いて生理食塩水を重力落下させて灌流します。これらのシステムのいずれも利用できない場合は、生理食塩水を入れた複数のシリンジを用いて手動で灌流させることも可能です。しかし、こちらの手法の方がはるかに簡単です。また、Kim wipesを入れた10 mLシリンジのバレルも必要です。そして、処置中にラットが深く麻酔された状態を維持できるよう、鼻に塗布するための麻酔薬を少量用意します。また、当然ながら器具も必要です。今回は細胞を培養しないため、無菌的な操作は行いません。使用している器具はすべて滅菌されていません。もちろん、細胞を培養したい場合は、滅菌済みの器具を使用する必要があります。このビデオでは、すでに死亡しているラットを使用します。手順をゆっくりと、ステップごとに詳しくお見せします。もちろん、実際の操作では、ラットに深い麻酔をかけますが、死なせないようにします。心臓が拍動し続けている状態にする必要があります。それでは、このラットを用いて開始します。ラットを背にして私とは反対方向に向かせ、濡らしたティッシュで鼻を覆いました。まず最初に、ラットが十分に麻酔されているかを確認します。したがって、それぞれの処置を行う前にこの確認を行う必要があります。ピンセットでラットをつまみ、全く反応がないことを確認します。もし何らかの反応がある場合は、ラットを再びベルジャーに戻し、十分に麻酔がかかっていることを確認してください。次に、70% ethanolを用いてラットの上半分を浸します。その後、胸腔を開きます。まず、皮膚を切開し、側方に開きます。次に、体腔を開きます。この塊が心臓です。ここに右心房が見えます。血液を流出させるために、ここを切開します。次に、全身に灌流させるため、左心室に針を挿入する必要があります。そのため、ちょうど

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生物学

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ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

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同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ

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成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

学ぶEAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法。心臓灌流による血液汚染の除去とPercoll密度勾配遠心分離を用いて、フローサイトメトリーなどの下流解析に適した生存細胞を得る技術です。

EAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞の単離

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