EAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞の単離

こんにちは。クリスティーン・ビートンです。カリフォルニア大学アーバイン校の生理学・生物物理学部のジョージ・チェン研究室で助手研究員を務めています。本日は、ラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法について解説します。

本手順では、中枢神経系に血液などの混入物質が残らないよう、ラットを深く麻酔して心拍灌流を行います。その後、脳と脊髄を取り出し、セルストレーナーを用いて単一細胞懸濁液を調製します。そして、Percollの二層密度勾配を用いて、単核細胞を単離します。それでは、開始しましょう。

これから心臓灌流を行いますので、それに必要な材料をすべて紹介します。まず最初にベルジャーを用意し、その下に揮発性麻酔薬を浸したペーパータオルを置きます。麻酔薬には、ハルタンやイソフルランを使用できます。

次に必要なのは、ラットを固定する器具と、血液を回収するための器具です。ここでは、ラットの灌流を行うための簡易的な装置を用意しています。21ゲージの針を使用し、IV灌流システムを用いて生理食塩水を重力落下させて灌流します。

これらのシステムのいずれも利用できない場合は、生理食塩水を入れた複数のシリンジを用いて手動で灌流させることも可能です。しかし、こちらの手法の方がはるかに簡単です。また、Kim wipesを入れた10 mLシリンジのバレルも必要です。

そして、処置中にラットが深く麻酔された状態を維持できるよう、鼻に塗布するための麻酔薬を少量用意します。また、当然ながら器具も必要です。今回は細胞を培養しないため、無菌的な操作は行いません。

使用している器具はすべて滅菌されていません。もちろん、細胞を培養したい場合は、滅菌済みの器具を使用する必要があります。このビデオでは、すでに死亡しているラットを使用します。

手順をゆっくりと、ステップごとに詳しくお見せします。もちろん、実際の操作では、ラットに深い麻酔をかけますが、死なせないようにします。心臓が拍動し続けている状態にする必要があります。

それでは、このラットを用いて開始します。ラットを背にして私とは反対方向に向かせ、濡らしたティッシュで鼻を覆いました。まず最初に、ラットが十分に麻酔されているかを確認します。

したがって、それぞれの処置を行う前にこの確認を行う必要があります。ピンセットでラットをつまみ、全く反応がないことを確認します。もし何らかの反応がある場合は、ラットを再びベルジャーに戻し、十分に麻酔がかかっていることを確認してください。

次に、70% ethanolを用いてラットの上半分を浸します。その後、胸腔を開きます。まず、皮膚を切開し、側方に開きます。

次に、体腔を開きます。この塊が心臓です。ここに右心房が見えます。

血液を流出させるために、ここを切開します。次に、全身に灌流させるため、左心室に針を挿入する必要があります。そのため、ちょうどこの位置に針を挿入します。

針を挿入したら、IVチューブを開いて生理食塩水を流し、5〜10分間そのままにします。灌流が適切に行われれば、赤色の脈拍や鼻、そしてもちろんラットの眼の色が変化し、血液がラットの体内から排出されていることが分かります。これにより、灌流が良好であると判断できます。

心臓灌流後のラットです。ご覧の通り、このラットの鼻、耳、目はもうピンク色や赤色ではありません。完全に白くなっており、これは灌流が適切に行われたことを示しています。

ラットの部位からほぼすべての血液が除去されました。心臓灌流が完了したため、ここからラットの頭部を切り離します。ラットを斬首します。

そのために、一般的な実験器具を使用します。それでは、ラットから脳を取り出します。毛が飛び散るのを防ぐため、全身の被毛を70% ethanolで浸します。

次に、まず皮膚を除去します。今回は脳を組織学的解析に使用せず、細かく切断するため、きれいに取り出すことにそこまで細心の注意は払いません。頭蓋骨の底部、ちょうどここにある脳と脊髄の接合部にハサミを挿入し、一度に切り離します。

骨の両側を切断し、上部を取り除きます。この操作を繰り返し行います。これで脳が完全に露出しました。

ご覧のように、脳が完全に透明になっているため、灌流はうまく行われました。灌流していない動物の場合、脳の最上層が赤い毛細血管、つまり赤血球を含む毛細血管で完全に覆われているのが見えますが、ここでは全く見えないため、灌流が適切に完了したことがわかります。それでは、嗅球を取り残さないように注意しながら脳をかき出し、氷冷したPBSが入ったチューブに入れます。

それでは、形態を完全に保持することに細心の注意を払う必要はないため、脳をPBSのチューブに入れ、視神経を切断します。その後、スパチュラを使用すれば、簡単に取り出すことができます。次に、同じラットから脊髄を取り出します。ここでも、後で細かく切断するため、すべて取り出せさえすれば、極めて丁寧に抽出することに拘る必要はありません。

まず脊柱に沿って皮膚を切開します。ここで脊柱が見えています。次に、脊柱全体が露出するように、周囲の筋肉を除去します。そして、ちょうどここに脊髄が見えます。

マウスの場合、両端を切断してシリンジでPBSを注入すれば、脊髄をほぼ一体のまま取り出すことができます。しかし、ラットではそれほど簡単ではありません。切開して、脊髄を掻き出す必要があります。

次に両側を切開します。脳のときと同様に、骨を切除して脊髄を露出させます。脳と同様に、脊髄が完全に白色であることは、心臓灌流が適切に行われたことを示しています。これを脊柱全体にわたって行います。

右側の股関節の高さ、ちょうどこのあたりまで切り下げます。次にピンセットを使用します。見た目はあまり綺麗ではありませんが、脊髄を慎重に引き出し、脳と一緒にチューブに入れます。これでチューブの中にラットの脳と脊髄の両方が揃いましたので、単一細胞懸濁液を調製する準備が整いました。

それでは、中枢神経系から単一細胞懸濁液を調製します。そのために、10 cmのペトリ皿を用意し、そこに70 µmのセルストレーナーを設置します。また、1 mLシリンジのプランジャー、ピンセット、およびハサミを使用します。

サンプルをセルストレーナーに入れ、チューブ内に何も残っていないことを確認します。次に、脳と脊髄の両方を混ぜ合わせ、細かく刻みます。すべてを十分に細断した後、O'Neillシリンジのプランジャーを使用して、サンプルを押し出します。

単一細胞が通過するにつれて、セルtrainerの外側のPBSが徐々に濁っていくのがわかります。もちろん、細胞懸濁液をより均一にしたい場合は、組織培養フード内で行い、指を入れないようにします。PBSが濁ったので、これを回収して50 mLチューブに移します。

また、注意深く観察しながら、セルストレーナーにPBSを追加し、押し潰していきます。中枢神経系（CNS）には多くの脂肪が含まれているため、この手法を用いて細胞懸濁液を調製するのが最も難しい臓器の一つです。そのため、CNSの組織すべてをセルストレーナーで何度も押し出し、単一細胞懸濁液をすべて回収しました。

こちらが、右側の中枢神経系（CNS）から調製した単一細胞懸濁液を、PBSを用いて50 mLまで満たしたチューブです。それでは、密度勾配遠心法に備えるため、このチューブを遠心分離します。遠心分離が完了しました。ペレットが形成されましたので、上清を捨て、細胞を20 mLのPBS希釈30% Percoll溶液で再懸濁します。

これをPBSで希釈した70% Percoll 10 mLに重ねて、密度勾配遠心分離を行います。そのため、上清は捨てます。細胞がペレット内で凝集せず、単一懸濁液の状態になるようにペレットを分散させます。

CNS細胞を単一細胞懸濁液として調製しました。これらの細胞をPBSで調製した30% Percoll 20 mLに懸濁させ、それをPBSで調製した70% Percoll 10 mLの上に重層します。その後、遠心分離を行います。

それでは、20 mLのCNS懸濁液を、操作を容易にするため、70% Percoll層の上にゆっくりと重層します。また、いずれかの層にフェノールレッドなどの染料を加えることもできますが、それが細胞にどのような影響を与えるか、あるいは影響があるのか定かではないため、私は避けるようにしています。

2つの層が混ざり合わないよう、十分にゆっくりと操作し、下層に大きな乱流が生じないようにしてください。上層が厚くなるにつれて、速度を上げることができます。これで、細胞をグラジエントに添加しました。

したがって、下層の透明な層が70% Percoll層であり、上層の白濁した層が単一細胞懸濁液を含む30% Percoll層となります。これからこのチューブを遠心機にかけ、20分間遠心分離します。適切に操作できていれば、単核細胞の層を視認できるはずです。これで密度勾配遠心分離が完了しました。

いつものように勾配を作りますが、急ブレーキによる減速で勾配が乱れないよう、ブレーキをオフにするのに十分注意してください。これで層が形成されました。勾配の上層に脂肪層がありますが、細胞懸濁液への混入を避けるため、この脂肪層を除去します。

Perkelの30%と70%の2つの層の界面を見ると、界面が鮮明ではなくぼやけており、そこに細胞が存在していることがわかります。細胞を取り除けば、界面はより鮮明になります。そのため、上層の脂肪の大部分を取り除き、廃棄容器に入れます。

すべてを取り除く必要はありませんが、単核細胞を回収しに行く際に、ピペットが完全に覆われない程度に十分に取り除きたいと考えています。次に、別の移送ピペットを使用して、界面のレベルまで移動し、細胞を回収します。これで、界面から数mLを回収しました。

これで、回収可能な細胞はすべて得られたと思われます。この中枢神経系（CNS）に含まれる単核細胞の数は非常にわずかでした。これで、チューブの中に単核細胞が回収されました。

このチューブにPBSを50 mLまで満たし、遠心分離して細胞をペレット化することで、パールを除去します。パールを完全に除去するために、PBSを満たしたチューブで少なくとも2回は洗浄することをお勧めします。これで、目的の手技に使用するための細胞の準備が完了します。

本日は、ラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法について解説しました。得られた単核細胞を用いて、例えば集団の中からTリンパ球を単離するなど、さらに精製することが可能です。今回は、これらの細胞を用いてフローサイトメトリー解析を行い、脳内にどのような細胞集団が存在していたかを確認します。

それでは、細胞分離の成功をお祈りします。