Name: 植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶ 高解像度赤外線サーモグラフィを用いて植物の氷形成と伝播を可視化する方法。INA細菌の役割を評価し、非侵襲的な温度モニタリングで植物凍結メカニズムを解明する。

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P23681-B16：この研究は、オーストリア科学基金（FWF）によって資金を供給されました。

植物材料の調製<ol><li>対象植物材料（ ギボウシ属またはインゲンマメ ）のいずれかの葉や植物全体を使用してください。 </li></ol>氷核活性（INA）細菌を含有する水溶液の調製<ol><li>メーカーの方向に100％グリセロールを10g / Lを用いて調製シュードモナス寒天Fに25℃でペトリ皿で培養INA菌、 シュードモナスシリン （株CIT-7）。 </li><li>必要になるまで培養した後、十分に4℃の場所に成長しているが、氷核活性の高いレベルを確保する前に2日間4℃で維持。 </li><li>使い捨て、プラスチックで寒天の表面から一枚板からの細菌を掻き取りまたは再利用可能な金属へらを使用して場所の時に脱イオン水を10〜15ミリリットルに25ミリリットルの使い捨てキュベットに。濃度が1×10 9〜1×10 7の範囲であるべきです。· </sup&gt;ミリリットル-1。溶液が濁って表示されます。濃度はおおよそのことのみ必要があるとして、血球計または分光光度計を用いて濃度を確認する必要はありません。 </li><li>細菌を配布する10秒の最低キュベットを渦。 注：結果INA混合物の特定の濃度は重要ではなく、記載されているプロトコルは、氷核活性の適切なレベル以上のものを提供します。 INA菌とこの水の混合物を、核実験の後半で使用されます。 </li></ol> 3.凍結実験のセットアップ<ol><li>保護アクリルボックス内の高解像度赤外線カメラ（SC-660）を配置しているので、箱の前面の開口部を介してレンズのプロジェクトやボックスの後部開口部を介してノートパソコンや記録装置出口にカメラを接続する配線。箱の蓋を固定して、そのすべての意志の場所に環境室や冷凍庫の内部にボックスを配置OW主題植物材料が見られます。 <ol><li>反射された赤外線エネルギーからの干渉を防止するために、黒画用紙にチャンバの壁の内側を覆うことにより、植物材料の周りに暗い背景を提供します。 </li><li>可視波長での記録画像が必要とされる場合、光源からの発熱を最小限に抑えるためにLED照明でチャンバーを取り付けます。植物がカメラで見えるようにするために、このようなバッテリ駆動クローゼット光または他の小型LED素子としての照明の唯一の最小値は、必要とされます。 <ol><li>対象植物材料の可視画像が撮影されると、LED照明をオフにします。ポートまたはチャンバ内の他の開口を介して、カメラへのすべての外部有線接続（コンピュータにFireWire接続、電源コードなど）を配布します。 </li></ol></li><li>チャンバ内の温度勾配を回避または低減するために発泡絶縁材料を使用してポートまたは開口部に余分なスペースを埋めます。 1℃のチャンバーの初期温度を設定します。 </li></ol></li><li>植物材料は、カメラの視野内にあり、植物材料は、リモート表示画面または選択されたソフトウェアの中に表示されるように、植物または植物の部分を合わせ。 </li><li>植物は、従来の制御凍結実験を開始する、植物材料の大きさに応じて、1時間に30分1℃で平衡化することを可能にします。これは、凍結実験が開始されると、植物の温度は何度により空気温度に遅れないことを保証します。植物材料の温度が空気温度の0.5℃以内である場合に平衡が達成されます。 <ol><li>鉢植えの植物を使用する場合には鉢植えの土の上に発泡スチロール断熱材の層を配置します。植物が平衡化した後は、室内の冷却開始。 注：ポットの土壌表面上に絶縁層が植物の周囲の空気をポットから継続熱損失の量を低減し、FREから根を防ぎezing、このように一般的に起因する土壌中の残留熱本の巨大なタンクに自然の中で霜イベント中に発生しません。 </li></ol></li><li> 3.4.1-3.4.4で説明したように、所望のカメラパラメータ（カラー·パレット、温度範囲、関心の特定の領域など ） を設定します。 <ol><li>ライブ画像を見ながら温度変化を表示するには、虹のパレットを選択します。 </li><li>ソフトウェアだけで画像の下に配置された温度·バーを調整することにより、5℃に温度スパンを設定します。 </li><li>選択されたパレット（レインボー）で定義されているように擬似カラー画像に赤外線データを変換するためのリニアスケール（アルゴリズム）を選択し、5℃に温度の範囲を設定し、画像に基づいて自動的に追跡します。実験を行いながら別の方法として、手動で設定された範囲を調整します。 <ol><li> SOFTWが提供する目的の定義された領域内の特定の点の温度または平均温度を使用してくださいです。 。記録されたビデオシーケンスから、または画像ファイルに埋め込 ​​まれた情報から、全ての画素の温度データを取得する3 ResearchIRソフトウェアの中から代表的なスクリーンショットを示します。 </li></ol></li><li>興味のある特定のポイントを表す植物組織上の位置にカーソルを置きます。ポイント（サイズは1 -3画素）、ボックス、線、楕円、または円として関心領域を定義します。ポイントまたは形状の複数の組み合わせは、画像の上に配置することができます。 </li></ol></li><li>ビデオシーケンスを記録します<ol><li> 60 Hzで、記録を手動で停止されるのを記録するためにカメラを設定します。 </li><li>録画したビデオファイルが配置されるコンピュータまたは外部ドライブ上の場所を示しています。 </li><li>録音開始。 注：大規模なビデオファイルが生成されますので、外付けハードドライブへの録音を強くお勧めします。録画したビデオファイルは、後にNEを含む部分のみを含むように編集することができますcessary情報。これは、大幅にファイルサイズを小さくします。 </li><li> 0.5 -1.0°Cで増分室の温度を下げます。植物の温度が空気温度と平衡になるまで待ってから、0.5〜1.0°Cで再び温度を下げます。観察される植物組織の質量とその形態に応じて、平衡化は10〜15分かかることがあります。従って、約4℃/ hrの冷却速度を与えます。 </li><li>植物のフリーズとの観測が完了するまで、このように続けます。凍結プロセスが完了したときに記録を終了します。 注意：それらは同じ温度であるため、植物材料と背景が同じ色である場合に、植物組織は、空気温度で平衡化しました。背景温度や植物組織の温度が同じであるため、再度温度を下げるまで、植物材料を可視化することが困難であり、植物組織とAとの間の温度差がありますIR温度。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、全く競合する金融利害や利害の衝突を持っていません。

水は十分に0℃以下の温度に過冷却する能力を有しており、水が凍結する温度は非常に可変であることができる。36純水の過冷却温度の上限は、約-40℃であり、均一な核形成点として定義されます。暖かい温度で水が凍結がより-40℃、それは次いで、氷の形成と成長のための触媒として機能する形成するために、小さな氷の胚を可能にする核不均一の存在によってもたらされた場合。37自然の中での分子の多数があること非常に効率的な氷の核剤として作用し、このように自然の中での水のほとんどの凍結は、ちょうど、0℃以下の温度で起こります。不均一な核形成剤の活性を調節または影響を及ぼす能力は、植物に霜保護を提供するための新規のアプローチとして大きな可能性を有しています。どのように氷の形を理解し、高感度かつ凍結耐性植物を凍結中を伝播すると、交流に不可欠ですこの目的をhieving。 はじめに示されるように、様々な方法が実験室条件下​​で植物における凍結過程を研究するために使用されている、しかし、自然界の植物の凍結は、主に熱電対を用いて監視されています。高解像度の赤外線サーモグラ...

植物が活発に増殖している場合に発生する凍結温度は、植物がほとんど、あるいは全く凍結耐性を持っている場合は特に、致死することができます。このような霜のイベントは、多くの場合、農業生産に壊滅的な影響を持っていると、特に高山、サブ北極および北極の生態系1-6に、植物の自然集団におけるコミュニティ構造を形成する上で重要な役割を果たすことができます。深刻な春の霜のエピソードは、近年7-9でアメリカと南アメリカの果実生産に大きな影響を持っていた、より一般的な平均低温が続く暖かい天候の早期発症によって悪化されています。初期の暖かい天気がない霜耐性1,3,10-12にはほとんど持っているすべてのそれらの新芽、葉、花の成長を活性化し、破壊するために芽を誘導します。このような不安定な天候パターンは、進行中の気候変動の直接的反映であることが報告されており、foresための一般的な天候パターンであることが予想されますeeable今後13。増加霜耐性を提供することができ、経済的で効果的、かつ環境に配慮した経営手法や農薬を提供する努力は、理由のホストのための限られた成功を収めているが、これは、部分的に凍結耐性植物に回避メカニズムを凍結の複雑な性質に起因することができます。 14 植物における霜の生存に関連する適応メカニズムは、伝統的に凍結耐性と回避を凍結、2つのカテゴリに分類されています。前者は、植物が存在し、その組織中の氷の脱水効果に関連する応力を許容することができ、遺伝子の特定のセットで規制生化学的機構に関連しています。後者は、典型的であるが、単独で、プラント14であれば、氷の形を決定し、植物の構造的側面 ​​と関連しないが。広告としての凍結回避の有病率にもかかわらず、aptive機構は、少し研究は、基礎となるメカニズム、凍結回避の調節を理解する最近で専念してきました。読者は、この問題に関するより詳細のための最近の総説15と呼ばれています。 低温での氷の形成は簡単なプロセスのように見えるかもしれないが、多くの要因が植物組織中での氷の核形成温度を決定することに寄与し、それが工場内に広がりますか。このような外因性および内因性の核の氷の存在などのパラメータ、不均一な対均一核イベント、熱ヒステリシス（不凍液）タンパク質、特定の糖および他のオスモライトの存在、および植物の構造的側面のホストがすべての重要なを再生することができます植物における凍結過程における役割。まとめると、これらのパラメータは、氷が開始され、それがどのように成長される植物は、凍結する温度に影響を与えます。また、得られた氷結晶の形態に影響を与えることができます。種々の方法は、磁気共鳴イメージング（MRI）17、低温顕微鏡18-19、低温走査型電子顕微鏡（LTSEM、核磁気共鳴分光法（NMR）16を含む実験室条件下で植物における凍結過程を研究するために使用されています）。実験室とフィールドの設定で、植物全体の20凍結は、しかし、主に熱電対を用いて監視されています。凍結を研究するための熱電対の使用は、水が液体から固体への相転移を受ける熱の放出（融解エンタルピー）に基づいています。凍結次に、発熱事象として記録される。21-23を熱電対は、植物中で凍結研究において選択される典型的な方法であるにもかかわらず、その使用は、凍結事象の間に得 ​​られた情報の量を制限する多くの制限を有します。例えば、熱電対とそれがどのように伝播するか、氷が植物で開始されている場所を特定することはほぼ不可能に困難であり、それも速度で伝播している場合、一部の組織は、氷のない残っている場合。 高解像度の赤外線サーモグラフィ（HRIT）24-27の進歩は、しかし、差動撮影モードで使用する場合は特に、植物全体で凍結プロセスに関する情報を取得する能力を大幅に増加している。28-33本報告書では、凍結プロセスの様々な態様およびどこで、どのような温度で氷植物において開始される様々なパラメータに影響を研究するためのこの技術の使用を記載しています。プロトコルは高い、零下の温度での草本植物での凍結開始外因性核剤として作用する氷核活性（INA）細菌、 シュードモナスシリン （CIT-7）の能力を実証することが発表されます。 高解像度赤外線カメラこのレポートに記載されたプロトコルおよび実施例は、高解像度の赤外線を利用しますビデオ放射計。放射計（ 図1）は、赤外線および可視スペクトル画像と温度データの組合せを供給する。カメラのスペクトル応答は、7.5から13.5ミクロンの範囲であり、640×480ピクセルの解像度を提供します。内蔵カメラで生成された可視スペクトルの画像が複雑な、熱画像の解釈を容易にする、リアルタイムでのIR画像と融合させることができます。カメラ用レンズの範囲は、クローズアップ、顕微鏡観察を行うために使用することができます。カメラは、スタンドアロンモードで使用、またはpropietaryソフトウェアを使用してラップトップコンピュータとインターフェースし、制御することができます。ソフトウェアが記録されたビデオに埋め込まれた温度データの様々な得るために使用することができます。これは、赤外線放射計の多種多様な商業的に入手可能であることに注意することが重要です。したがって、研究者が知識豊富な製品エンジニアとの意図された用途を議論していることと、研究者は、任意の仕の能力をテストすることが不可欠ですC放射計は、必要な情報を提供します。記載されているプロトコルで使用される撮像放射計は、アクリルボックスに発泡スチロールI N温暖化と冷却のプロトコルの間に結露への暴露を抑止するためで絶縁（ 図2）が配置されています。この保護は、すべてのカメラやアプリケーションのために必要とされません。

<table><tbody><tr><td>赤外線カメラ</td><td>FLIR</td><td>SC-660</td><td>アプリケーションに応じて利用可能な多くのモデル</td></tr><tr><td>赤外線分析ソフトウェア</td><td>FLIR</td><td>ResearchIR 4.10.2.5</td><td>$3,500</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae (strain Cit-7)</td><td></td><td></td><td><a href="mailto:icelab@berkeley.edu">カリフォルニア大学のスティーブン・リンドウ博士より提供&nbsp;バークレー icelab@berkeley.edu</a</td></tr><tr><td>>Pseudomonas 寒天 F</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>DF0448-17-1</td><td></td></tr></tbody></table>

植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（hrit）の使用

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

植物が活発に成長しているときに発生する凍結イベントは、特に植物が凍結耐性を持たない場合、致命的なイベントになる可能性があります。このような霜は、しばしば農業生産に壊滅的な影響を及ぼし、特に高山、亜北極、北極の生態系において、植物の自然個体群の群集構造を形成する上で重要な役割を果たすこともあります。したがって、植物の凍結プロセスをよりよく理解することは、霜防止の方法の開発と凍結回避のメカニズムの理解において重要な役割を果たすことができます。ここでは、高解像度赤外線サーモグラフィー(HRIT)を使用してプラント内の凍結プロセスを視覚化するプロトコルについて説明します。この技術を使用すると、植物の氷形成の主要な場所、氷がどのように伝播するか、および氷の障壁の存在を特定できます。さらに、植物が凍結する温度を決定する際の外因性および内因性核生成剤の役割を調べ、凍結プロセスに影響を与えるか、凍結耐性を高めるさまざまな化合物の能力を評価することができます。HRITを使用すると、植物で進化した多くの適応を視覚化でき、それが凍結プロセスに直接的または間接的に影響を与え、最終的には植物が霜イベントに耐えることを可能にします。

アイス+細菌の氷核形成活性を、 シュードモナスシリン （株CIT-7） 10μlの水の低下とPを含む水10μl syringaeの （CIT-7）ギボウシの葉の背軸面上に置いた（ ギボウシ属 ）（ 図4）。図示のように、INA菌を含む水の低下は最初凍結し、葉の表面に水滴が凍結されていないままフリーズする葉の誘導を担当していました。 凍結および木本アイス伝播 図5は、オーク（ コナラオウシュウナラ ）のステムに氷の開始と氷の伝播の両方を示しています。氷の形成は、茎の維管束形成層のの師部領域で開始され、幹の周りに円周方向に伝播しました。木本植物で氷の伝播速度は、横方向とcircumfeよりも長手方向にずっと大きい茎rential方向。31 ア...

ここでは、高解像度赤外線サーモグラフィー(HRIT)を使用して、植物の氷形成部位と氷の伝播経路を視覚化することを可能にするプロトコルを紹介します。

植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

本実験の全体的な目的は、植物材料の凍結を誘導する外部核形成剤の役割を実証し、赤外線サーモグラフィを用いてその過程を可視化することです。これは、研究対象となる植物の葉の表面に、水一滴と氷核活性（INA）細菌一滴を塗布することで行われます。第二のステップとして、植物を氷点下の温度に置き、高解像度赤外線カメラで可視化できるように配置します。次に、研究者が氷の核形成と伝播を観察できるように、カメラのパラメータを設定します。続いて、表面の氷核活性（INA）細菌の凍結を誘発し、それに伴い植物を凍結させるため、チャンバーの温度をゆっくりと氷点下まで下げます。結果から、赤外線サーモグラフィを用いて氷の核形成の正確な位置を特定し、氷が植物全体にどのように伝播するかを可視化することで、植物が過冷却して凍結を回避するのではなく、外因性の氷核剤が植物の凍結を誘発する効果があることが示されます。この手法は、対照条件下での植物の可視化に利用できるだけでなく、自然条件下でのフィールド調査においても活用可能です。自然条件下で植物がどのように凍結するかを理解し、凍結プロセスに関する情報を得ることは、農作物の霜害対策における新技術の開発につながるだけでなく、植物生態学に関する多くの知見をもたらします。また、この手法は特に高山生態学の理解において非常に有用です。私と、私の研究室の技術者であるEric Burchardが、このプロセスを以下のビデオで実演します。培養を開始するには、製造元の指示に従い、100% glycerolを1Lあたり10g加えて調製したpseudo agar Fを用いて、INA細菌であるPsdo Sriniをペトリ皿で25 °Cで培養します。十分な増殖後、高い氷核活性を確保するために、培養物を4 °Cで少なくとも2日間保持します。次に、プラスチック製の使い捨てスパチュラまたは再利用可能な金属製スパチュラを用いて、1枚のプレート上の表面から細菌を掻き取ります。細菌を10～15 mLの脱イオン水に投入します。25 mLの使い捨てチューブに入れると、溶液は濁った状態になります。濃度は概数で十分であるため、血球計数器や分光光度計を用いて濃度を確認する必要はありません。細菌を分散させるため、Q Vetを最低10秒間ボルテックスします。凍結実験のセットアップとして、高解像度赤外線カメラを保護用アクリルボックス内に設置し、レンズがボックス前面の開口部から突き出し、カメラとノートパソコンまたは録画装置を接続する配線がボックス後面の開口部から出るようにします。このポートを介して、カメラへのすべての外部有線接続を分配します。チャンバー内の温度勾配を回避または低減させるため、ポートや開口部の余った隙間を断熱フォーム材で埋めてください。反射した赤外線エネルギーによる干渉を防ぐため、チャンバーの壁面に黒色の工作用用紙を貼り付け、植物材料の周囲を暗い背景にします。可視光線以外の波長のみで画像を記録する際、光源からの加熱を最小限に抑えるため、チャンバーにLED照明を設置します。植物をカメラで視認させるために、電池式のクローゼットライトやその他の小型LEDデバイスなどの最小限の照明が必要であり、可視光画像が撮影された後は消灯してください。ボックスの蓋をしっかりと閉め、被験植物が見える位置にボックスを環境チャンバー内に配置します。次に、チャンバーの初期温度を1 °Cに設定します。続いて、植物体または植物部位を調整し、カメラの視野に植物体が入っていること、およびリモートビューイングスクリーンまたは選択したソフトウェア上で植物体が確認できるようにします。環境チャンバーのドアを閉じる直前に、マイクロピペットを用いて葉のAAL表面に10 µLの水を与えます。次に、別の使い捨てピペットチップを使用して、同じAAL表面の反対側に10 µLのINA細菌溶液を塗布します。凍結実験を開始する前に、チャンバーの温度を約1 °Cまで下げ、植物材料の大きさに応じて30分から1時間ほど、その温度で植物の温度を平衡化させます。これにより、凍結実験を開始して温度を下げ始めた際に、植物材料の温度がチャンバー自体の空気温度から大きく遅れることを防ぐことができます。植物が平衡状態に達したら、チャンバーの冷却を開始し、研究用IRソフトウェアで目的のカメラパラメータを設定します。まず、ライブ画像を表示しながら温度変化を確認するために、レインボーパレットを選択します。次に、ソフトウェア上の画像直下にある温度バーを調整し、温度スパンを5 °Cに設定します。選択したパレットで定義される、赤外線データを擬似カラー画像に変換するための線形スケールを選択します。温度範囲を5 °Cに設定し、画像に基づいて自動的に追従するように設定してください。ソフトウェアによって提供される、特定の一点の温度または定義された関心領域内の平均温度を使用します。次に、植物組織上の関心のある特定の部位にカーソルを合わせます。関心領域を点、ボックス、線、楕円、または円として定義してください。画像上に、点や図形の複数の組み合わせを配置することが可能です。さらに、関心領域は実験終了後に定義することも可能です。保存されたビデオまたは画像ファイルを解析しながらビデオシーケンスを記録する場合、カメラの記録設定を60 hertzにし、記録を停止する際は、記録されたビデオファイルの保存先となるコンピューター内または外部ドライブの場所を指定してください。大容量のビデオファイルが生成されるため、外部ハードドライブへの記録を強く推奨します。ビデオシーケンスを記録するには、カメラを60 Hzに設定し、停止をマニュアル設定にしてから録画を開始します。録画されたビデオファイルは、後で必要な情報が含まれる部分のみを抽出して編集することができます。チャンバーの温度を0.5から1.0 °Cずつ段階的に下げます。観察対象である植物組織の質量および形態に応じて、同様の手順で再び温度を下げますが、その前に植物の温度が空気温度と平衡に達するまで待ちます。平衡に達するまでには10〜15分かかり、これにより1時間あたり約2〜4 °Cの冷却速度となります。植物が凍結し、観察が完了するまでこの操作を繰り返します。凍結プロセスが完了したら、録画を終了します。ここでは、主茎に付着した葉と頂芽が見える高山ツツジの茎の可視光画像を示しています。凍結は茎から始まり、氷が葉へと伝播していきます。頂芽は凍結せず、茎や葉の初期凍結から126分から164分の間で、どこかで独立して凍結します。この間に、茎と葉の凍結によって生じたエンタルピー熱は消散しています。トマトの植物体に疎水性バリアを塗布すると、INA細菌によって誘導される植物の凍結を阻止することができます。コーティングされていない植物では、INA液滴と葉の表面との間に広い接触面があることが観察できます。対照的に、コーティングされた植物では、INA液滴と葉の表面との接触レベルが低下しています。右側のコーティングされていない植物では、植物の凍結に伴う発熱反応が起こっています。左側のコーティングされた植物は、約マイナス6℃の状態で過冷却されており、凍結していません。この技術を使用する際は、適切な冷却速度を利用し、得られた画像やビデオの解釈方法をより深く理解するために、凍結過程を何度も観察することが重要です。また、この手順を熱電対と併用することで、気温および実際に凍結が起こっている温度をより正確に推定することが可能です。

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植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

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