表面EBL作製したナノ構造基板を用いた生体分子のラマン分光検出の強化

次の実験の全体的な目標は、固体ナノ構造基板と固定化された生体分子とインターフェースする共役ナノ生物学的システムを作製し、特性評価することです。これは、超高分解能電子ビームリソグラフィーまたはEBLを利用して、溶融シリカ支持体上に小さな金属ナノ構造のアレイを取得することによって達成されます。第2のステップとして、基板を溶液中に入れ、生体分子をその表面に固定化して、ナノ生物学的界面を生成します。

次に、界面の生体分子を調べるために、表面増強ラーメン分光法(SIRS)が使用されます。結果として得られるsirスペクトルは、特定の分子のラーメンモード特性を示し、強度は基板設計に強く依存します。赤外分光法のような既存の技術に対する私たちのアプローチの主な利点は、金属ナノ構造内の表面プラズマと共鳴により感度を大幅に向上させることができることです。

私たちのアプローチは、分子機能化と電子ビームリソグラフィーの組み合わせを使用して容易に制御できる高度に選択的な表面を作成します。この手法は、構造生物学の探索研究やポリマーによるサービスから、ナノ生物学的界面を含むさまざまなデバイスの開発まで、複数の分野にわたる重要な質問に答えることができます。この方法は、医療診断や環境検出にまで及ぶ意味を持つ生体分子の構造特性を科学で提供することができます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、ナノ加工、表面機能化、生化学、および分光法の側面を含むため、従来は無関係であったため、ポリメチルメタクリレートまたはPMMAのスピンコートを開始すると、基板上のポリメチルメタクリレート、レジスト、および導電性層が苦戦する可能性があります。これを実現するには、真空チャック付きのウェーハスピナーを使用し、サンプルをチャックの中央に個別に配置します。ガラスピペットを使用して、サンプルの中央にPMMAレジストを1滴置きます。

その後、3, 500 RPMで60秒間回転し、加速時間は2秒です。次に、基板を焼いた後、180°Cで3〜5分間基板をベーキングし、基板を冷やした状態でサンプルを室温まで冷却し、スピナーチャックに戻します。基板上に導電性ポリマーを一滴広げます。

基板を3000RPMで40秒間回転させ、スピン後に2秒間のランプを空けて回転させます。テキストプロトコルに記載されているように、電子ビームリソグラフィーまたはEBL露光を行った後、サンプルを摂氏80度で1分間焼き、導電性ポリマーを除去するためのイオン化水でビーカーを準備します。次に、現像剤の混合物で2番目のビーカーを準備し、5分間攪拌し、室温に設定します。

最後に、ピンセットを使用して、すすぎ剤として3番目のビーカーにイソプロパノールを調製します。サンプルを水中に3秒間入れて、導電性ポリマーフィルムを除去します。次に、サンプルを現像液に入れ、ピンセットをゆっくりと上下に20秒間動かし、すぐに基板をイソプロパノールに移し、さらに10秒間すすぎてからサンプルを窒素で乾燥させ、サンプルを逆さまにして電子ビーム蒸発器システムにロードし、蒸発した金属をサンプルの前面に堆積させます。

デザイン1とデザイン3のサンプルに厚さ10ナノメートルの金層を堆積させ、デザイン用に厚さ10ナノメートルの銀層を堆積させます。毎秒約0.1ナノメートルの速度で2つ。次に、超音波処理システムを推奨高さまで水で満たし、別のビーカーにアセトンを入れます。

ビーカーの底にサンプルを上向きに置き、ビーカーを持ってサンプルを10分間浸します。それをウォーターバスに入れ、アセトンの高さを水の高さに合わせます。次に、超音波処理システムをオンにします。

超音波処理を最大60秒間行います。デザイン1サンプルを調製するには、まずMUAとエタノールの1ミリモル溶液を室温で調製し、10分間超音波処理します。適切なナノ構造基板をMUAの溶液に48時間浸漬します。

次に、サンプルをエタノールで3回すすぎ、5分間乾燥させます。室温を設定します。次に、EDCと蒸留水の75ミリモル溶液を調製します。

また、マイクロピペットデポジットを使用して蒸留水にNHSの15ミリモル溶液を準備し、基板上の金に100マイクロリットルのNHSを調製し、すぐに同じ領域に100マイクロリットルのEDCを追加します。1分間インキュベートして、MUAの自己組織化単分子膜を活性化します。次に、100マイクロリットルのタンパク質を溶液として基板の同じ領域に置きます。

サンプルをペトリ皿の1つのコンパートメントに入れ、別のコンパートメントに1ミリリットルの蒸留水を入れます。シャーレを蓋で密封し、サンプルを摂氏5度で24時間保管します。次に、各ビーカーで20秒間別々のビーカーでサンプルを連続的に使用して、蒸留水でサンプルを3回すすぎ、すすぎ後または設計2つのサンプルのすすぎ中にサンプルを乾燥させないでください。

グルコース結合タンパク質またはGBPの0.9ミリモル溶液をリン酸カリウム緩衝液に調製します。また、緩衝液中にDGグルコースの100ミリモル溶液を調製します。次に、30マイクロリットルのDグルコース溶液と30マイクロリットルのGBP溶液を混合します。

1ミリリットルのプラスチックマイクロチューブ容器とマイクロピペットを使用して30分間インキュベートした後、20マイクロリットルのリガンドフリーGBP溶液と20マイクロリットルのリガンド結合GBP溶液を調製した基質に沈着させます。マイクロピペットを使用して、サンプルを摂氏5度で24時間、密閉された蓋付きのシャーレに保存します。リン酸カリウム緩衝液でサンプルを室温で3回すすぎます 準備します。

設計 3つのサンプルで、ドーパミン結合アプレまたはDBA溶液を1マイクロモルの濃度に希釈します。最終pHが7.4のtris EDTAバッファーを使用して、分析天びん上でドーパミン粉末を測定し、リン酸緩衝生理食塩水またはPBSに攪拌ビーズで5分間混合することにより、5マイクロモル濃度のドーパミン溶液を調製します。次に、各基板の表面に20マイクロリットルのDBA溶液を沈殿させ、サンプルを室温で1時間放置し、シャーレを覆います。

リン酸カリウムバッファーでサンプルを3回すすいだ後、サンプルをクリーンルームグレードのワイプの上に直立させて、基板の前面にフィルムを維持しながら裏面を乾燥させます。サンプルをコントロールとして脇に置きます。次に、既存のPBSの表面に5マイクロリットルのドーパミン溶液を滴下します。

残りのサンプルにドロップします。サンプルを10分間インキュベートしてから、サンプルをリン酸カリウム緩衝液で3回すすぎます。ラーメン分光法を行うため。

レーザー照射による蒸発を避けるために、各サンプルを防水チャンバーに入れます。プラスチック製のシリンジに化学的に不活性な高真空グリースを充填します。次に、サンプルをスライドガラスに置き、サンプルに触れずにサンプルの周囲に数ミリメートルのグリースを分注します。

基板の上に顕微鏡カバースリップを置きます。静かに押し下げてシールを形成し、バッファーが真空グリースに接触しないように、基板とカバースリップとの間に薄い液体界面を作成します。光学ラマン顕微鏡システムを使用して、レーザーをオンにせずに、サンプリングする金属ナノパターン領域の表面に焦点を合わせます。

示されているテキストプロトコルで説明されているように、ラマンサンプリングを実行します。これは、溶融シリカ上の金と銀のニッケルのナノパターンドットアレイです。電子ビームリソグラフィーまたはEBLの使用により、優れた位置と寸法が可能になります。

コントロールドットサイズとギャップ幅は、EBL露出によって制御されます。銀ニッケルの金端の線量六角形配列がここに表示されます。このような非常に薄い金属層の核形成挙動は、不連続な構造をもたらします。

これは、デザイン1の基質固定化タンパク質Aのシリーズスペクトルであり、アレイ1からのシグナル強度はアレイ2からのシグナル強度よりもはるかに強いです。アレイ3からの信号は非常に弱かった。ギャップ間隔は、プラズマのアンカップリングとラーメン散乱の表面強化にとって重要なパラメータであることは明らかです。

これは、リガンドフリー状態とリガンド結合状態でのさまざまな基質設計の影響を示すグルコース結合タンパク質のスペクトルです。最後に、ドーパミン結合アプタマーのsスペクトルを、リガンドフリー分子とリガンド結合分子について示します。ドーパミン粉末のスペクトルが参考として示されています。

この手順を試みるときは、基板の汚染を避けることが重要です。分光法の技術は非常に感度が高いため、この手順を採用すると誤った測定値が得られる可能性があります。特定の分析種に対して最適なソース基質設計を特定できます。

次に、ノンプリントphyなどの他のnphy方法を実行して、開発後の基板製造のスケーラビリティを向上させることができます。この技術は、生化学およびバイオセンシングの分野の研究者が、溶液中に留まったまま、特定の表面を持たない生体分子を非常に少量で検出するのに役立ちました。このビデオを見れば、作製技術を使用して金属ナノ構造のサイズと膜特性を制御する方法や、さまざまな生体分子認識戦略を利用してさまざまな分析物を標的とする方法が理解できるはずです。