赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境
2015年6月4日
プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。
この手順の全体的な目標は、微小循環中の赤血球凝集体を直接定量化することであり、動的に制御されておらず、一定のせん断速度です。これは、ファーストイントレーニング、赤血球懸濁液、およびリン酸緩衝生理食塩水を含むダブルYマイクロチャネルによって達成され、血液層に一定の歓声を生み出します。2つ目のステップは、ハイスピードカメラで流れを可視化し、記録することです。
次に、画像処理技術を用いて記録を処理し、マイクロチャネル内の平均集計サイズと集計サイズ分布を取得します。最後のステップは、2つの連続するフレーム間のマイクロチャネルに注入された蛍光粒子の変位を追跡することにより、血流速度を決定することです。最終的に、マイクロチャネル内のせん断速度は、血流速度と血液層の厚さに基づいて計算され、凝集サイズを対応する局所せん断速度に関連付けます。
光透過法のような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、赤血球凝集体が他の手法で統計的に分析されるのとは対照的に、微視的なシェアフローで動的に分析されることです。この方法は、赤血球凝集体の形成条件の理解や微小循環における血液放射線学的挙動の発見など、血液放射線分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、幅120ミクロン、高さ60ミクロン、長さ7mmのマイクロチャネルを標準的なフォトリソグラフィー法で作製します。
次に、健康なボランティアドナーから血液細胞を収集し、添付のテキストプロトコルに記載されているように、5、10、および15%ヘマトクリットレベルの赤血球懸濁液を調製し、各赤血球懸濁液の1ミリリットルを蛍光トレーサー粒子を含む1%溶液の60マイクロリットルと組み合わせます。チューブを静かに振って溶液を混合します。また、同量のトレーサー粒子をpH 7.4で1ミリリットルのPBSに組み合わせます。
25マイクロリットルのガラスシリンジに赤血球を含むトレーサー溶液と100マイクロリットルのガラスシリンジを入れます。PBSのトレーサーソリューションを使用して、システムに気泡が存在しないことを確認します。次に、毎秒18フレーム以上を記録できる高速度カメラと微粒子画像速度測定システムに接続された倒立顕微鏡ステージにマイクロチャネルを配置します。
チューブを介して各シリンジをマイクロ流体チャネルの入口ポートの1つに接続し、それらを同じシリンジポンプのホルダーにロードします。シリンジポンプをプログラムして、25マイクロリットルのシリンジを1時間あたり2マイクロリットルの速度で分配します。これにより、100マイクロリットルのシリンジは、サイズの違いにより、その4倍の速度で分注されます。
異なるせん断速度をテストするために、実験間で流量を変更します。20 x レンズを装着したキャリブレーションの嘲笑を使用して、ハイスピード カメラをキャリブレーションします。次に、ポンプを始動して、2つの溶液をマイクロチャネルに分注し始めます。
最適なカメラの露出を決定します。アグリゲートの鮮明なイメージングの時間です。測定値を取得する前に、流れが定常状態に達するのを待つことが重要です。
定常状態になったら、3〜5分以内に到達します。シリンジを補充して混合物を教育し、赤血球を懸濁液に保ちます。定常状態の流れに達したら、赤血球の動きの記録を開始します。
フローを 7 秒間記録します。画像処理が可能なプログラムを使用して、ヒストグラムイコライザー法で撮影した各グレースケール画像のコントラストを強化します。次に、グレースケール画像をバイナリ画像に変換します。
しきい値は、複数の値をテストし、すべてのアグリゲートが適切に検出される値を選択して、慎重に設定します。必要に応じて、1つの骨材内のギャップに対応する穴を埋めます。次に、バイナリ イメージ内の隣接する白いピクセルを決定してセルを検出し、隣接するセルが凝集体として考慮されるようにします。
検出されたさまざまな赤血球凝集体にラベルを付け、バイナリ画像を赤、緑、青の画像に変換して、視覚化を改善します。最後に、赤、緑、青の画像を元の画像にオーバーレイします。画像処理の効率を検証するために、検出されたピクセル数に基づいてフレーム内で検出された各集計の面積を計算します。
すべてのフレームを同じ方法で処理します。次に、各フレームで検出された集計サイズを平均化し、次にすべてのフレームの結果を平均化します。赤血球懸濁液エンジンの各記録の平均集計サイズを取得するには、嘲笑画像を使用して結果を正方形のマイクロメートルに変換します。
次に、1つの赤血球の面積を計算して、代表を決定します。データ取得後の、検出された各凝集体内の赤血球の推定数。ハイスピードカメラを使用して、微粒子画像速度測定システムに使用されるダブルパルスカメラに切り替えます。
ここに示すようなイメージングソフトウェアを使用して、流れの画像取得と速度場の決定のための画像処理を行います。必ず保護メガネを着用してから、レーザーシステムとカメラの電源を入れてください。マイクロメータを顕微鏡の下に置き、得られた画像を使用してシステムを校正します。
次に、流体の流れを開始し、両方の流体の粒子を視覚化します。マイクロチャネルの中面を見つけるには、流れの中で最も速く、最も明るい粒子に焦点を合わせます。次に、フレーム間の時間間隔を約2ミリ秒に設定して、最速の粒子が両方の画像間を5〜10ピクセル移動し、フローの記録を開始するようにします。
画像の前処理に続いています。相関ウィンドウのサイズと形状、および重なり合う画像の割合を選択します。結果を、100 個の画像ペアと速度の二乗平均平方根誤差から計算された平均速度フィールドとして表します。
レーザーカメラとコンピューターの電源を切ります。すべての測定と画像処理が完了したら、まずハイスピードカメラの記録に基づいてマイクロチャネル内の血液の厚さを検出し、推定することにより、純粋な速度を計算します。この目的のために、特定の録画のすべてのフレームを平均化して、ビデオの背景画像を取得します。
最後に、すべてのフレームの平均画像を視覚的に検査し、血液層のエッジを手動で検出して、血液層をデライトします。次に、抽出した速度プロファイルから対応する血液層の厚さの速度値を手動で取得し、速度値を血液層で割ってせん断速度を計算します。ここに示されている厚さは、3つの連続したフレームで検出された4つの赤血球凝集体の正味の動きです。
30個を超えるセルの大きな凝集体は赤で示されています。9 個から 30 個のセルからなる培地凝集体は緑色で示され、9 個未満の細胞からなる小さな凝集体は青色で示されています。凝集体の速度は、示されているマイクロチャネル内の位置によって異なります。
これは、5%ヘマトクリット、10%ヘマトクリット、および15%ヘマトクリットで1時間あたり10マイクロリットルの流量で懸濁した赤血球の速度プロファイルです。予想どおり、両方のエッジで速度がゼロに近づいているのがわかり、全体的なせん断速度が増加すると、各ヘマトクリット レベルの凝集体のサイズが下がるにつれて、2 つの流れの流れの間の変曲点がヘマトクリット レベル間でわずかに変化します。これは、マイクロチャネル内の純粋な力が凝集力を超えるため、赤血球が凝集しなくなるためです。
この手順に参加する際には、マイクロチャネル内のフローの良好な画質を確保し、流れる赤血球と画像の背景とのコントラストを確保することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、制御されたフロー条件下で赤血球凝集体を定性的および定量的に分析する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、制御されたせん断速度下での赤血球（RBC）凝集体の定量化方法を、画像処理技術を用いて概説しています。この研究は、マイクロ流体環境におけるRBC凝集体の大きさとせん断速度の相関を目的としています。
主要な研究要素
科学分野
- マイクロ流体工学
- 血液学
- 画像処理
背景
- 赤血球凝集体は微小循環において重要な役割を果たします。
- せん断速度の理解は血流ダイナミクスの研究に不可欠です。
- 画像処理技術はRBC凝集体の分析を強化できます。
- この研究は制御された実験のためにマイクロチャネルセットアップを利用しています。
研究目的
- マイクロ流体環境におけるRBC凝集体を定量化すること。
- 凝集体の大きさを局所的なせん断速度と関連付けること。
- 微小循環における血流挙動の理解を深めること。
使用された方法
- リン酸緩衝生理食塩水溶液中でのRBC懸濁液の調製。
- 高速カメラを用いた流れの可視化。
- 平均凝集体サイズと分布を決定するための画像処理。
- 血液速度と層の厚さに基づくせん断速度の計算。
主な結果
- RBC凝集体の大きさの成功的な定量化。
- 凝集体の大きさとせん断速度の関係の確立。
- 画像処理技術の効果的な使用の実証。
- 微小循環におけるRBC挙動のダイナミクスへの洞察。
結論
- このプロトコルはRBC凝集体を研究するための信頼できる方法を提供します。
- 結果はマイクロ流体システムにおける血流の理解を深めます。
- 将来の応用には血液障害と治療法の研究が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to RBC aggregation pathways and modulators of hemorheological function.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization and quantification of aggregate dynamics under physiologically relevant shear conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible aggregate size metrics under controlled flow.
- Operational Value: Enhances assay standardization and scalability through microfluidic platform reuse and quantitative image-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity by modeling shear-dependent RBC behavior in microcirculation.
- Operational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by correlating aggregate stability with hemodynamic conditions relevant to vascular function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic observation of aggregate formation and dissociation under controlled shear rates.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microfluidic environments and quantitative aggregate size distribution outputs.
- Analytics: Provides measurable readouts including average aggregate size, size distribution, and localized shear rate calculations derived from velocity fields and layer thickness.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RBC behavior in microvascular environments relevant to disease states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating compounds or conditions affecting hemorheological properties across multiple hematocrit levels and shear conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RBC-plasma interactions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through controlled shear rates, calibrated imaging, and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hemorheological liabilities that could impact drug safety or efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate aggregation propensity in a shear-dependent manner.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, high-speed imaging, and image processing techniques for binary thresholding and particle labeling.
- Depends on microfluidic fabrication capabilities, high-speed cameras capable of ≥18 fps, and μPIV systems for velocity field determination.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit preparation, tracer particle concentration, and flow rate protocols to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to diseased RBC samples or varying plasma conditions that may alter aggregation kinetics.
- Includes practical limitations such as the need for bubble-free systems, steady-state flow validation, and manual validation of blood layer thickness for shear rate calculation.
