赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

本手順の全体的な目的は、制御された一定のせん断速度の下で、微小循環における赤血球凝集体を動的に直接定量化することです。これは、まずトレーニングにおいて、赤血球懸濁液とリン酸緩衝生理食塩水を用いてダブルYマイクロチャネルを洗浄し、血液層に一定のせん断力を生成させることで達成されます。第2のステップでは、高速カメラを用いてフローを可視化し、記録します。

次に、画像処理技術を用いて記録されたデータを処理し、マイクロチャネル内における凝集体の平均サイズおよびサイズ分布を算出します。最終ステップとして、マイクロチャネルに注入された蛍光粒子の連続する2フレーム間の変位を追跡することで、血液流速を決定します。最終的に、血液流速と血液層の厚さに基づいてマイクロチャネル内のせん断速度を算出し、凝集体のサイズを対応する局所せん断速度に関連付けます。

光透過法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、赤血球凝集体を他の手法のように統計的にではなく、顕微鏡下の剪断流の中で動的に解析できる点にあります。本手法は、赤血球凝集体の形成条件の解明や、微小循環における血液学的挙動の特定など、血液放射線学分野における重要な疑問の解決に寄与します。まず、標準的なフォトリソグラフィ法に従い、幅120 microns、高さ60 microns、長さ7 mmのマイクロチャネルを作製します。

次に、健康なボランティアドナーから血球を採取し、付属のテキストプロトコルに従ってヘマトクリット値が5%、10%、15%となる赤血球懸濁液を調製します。各赤血球懸濁液1 mLに、蛍光トレーサー粒子を含む1%溶液60 µLを加えて混合します。チューブを軽く振って溶液を混ぜ合わせます。同様に、pH 7.4のPBS 1 mLに対しても同量のトレーサー粒子を加えて混合します。

赤血球を含むトレーサー溶液を25 µLガラスシリンジに、また別の100 µLガラスシリンジに充填します。PBS中のトレーサー溶液を用い、システム内に気泡がないことを確認してください。次に、1秒間に18フレーム以上の記録が可能な高速カメラおよびマイクロパーティクル画像流速計（micro-PIV）システムに接続された倒立顕微鏡のステージ上にマイクロチャネルを設置します。

各シリンジをチューブでマイクロ流路の入口ポートのいずれかに接続し、同じシリンジポンプのホルダーに装着します。25 µLのシリンジを2 µL/hの速度で吐出するようにシリンジポンプをプログラムします。これにより、サイズの差があるため、100 µLのシリンジはその4倍の速度で吐出されます。

異なるせん断速度をテストするために、実験間で流量を変更します。20倍のレンズを装着した状態で校正用定規を使用し、高速カメラを校正してください。その後、ポンプを始動させ、2つの溶液をマイクロチャネル内に注入し始めます。

凝集体の鮮明な画像を得るために、最適なカメラ露光時間を決定します。測定を開始する前に、流れが定常状態に達するまで待機することが重要です。

3〜5分以内に定常状態に達します。シリンジを満たして混合液を攪拌し、赤血球を懸濁状態に維持してください。定常流に達したら、赤血球の動きの記録を開始します。

流れを7秒間記録します。画像処理が可能なプログラムを用いて、ヒストグラム平均化法により、取得した各グレースケール画像のコントラストを強調します。次に、グレースケール画像を二値画像に変換します。

いくつかの値をテストし、すべての凝集体が適切に検出される値を選択して、閾値を慎重に設定します。必要に応じて、1つの凝集体内の隙間に相当する穴を埋めます。次に、バイナリ画像内の隣接する白ピクセルを判定して細胞を検出し、隣接する細胞を凝集体としてカウントします。

検出された各赤血球凝集塊にラベルを付け、次いで可視性を高めるために二値画像をRGB画像に変換します。最後に、このRGB画像を元の画像に重ね合わせます。画像処理の効率を検証するため、検出されたピクセル数に基づき、フレーム内で検出された各凝集塊の面積を算出します。

すべてのフレームを同様の手法で処理します。次に、各フレームで検出された凝集体のサイズの平均を算出し、その後、全フレームの結果の平均を求めます。赤血球懸濁液エンジンの各記録における平均凝集体サイズを得るために、リディキュール画像を用いて結果を平方マイクロメートルに変換してください。

次に、赤血球1個の面積を算出し、代表値を決定します。データ取得後、検出された各凝集塊内に含まれる赤血球の推定数を求めます。高速カメラから、粒子画像流速計（PIV）システムに使用されるダブルパルスカメラに切り替えます。

流体計測および速度場の決定のための画像処理には、ここに示すようなイメージングソフトウェアを使用してください。必ず保護眼鏡を着用してから、レーザーシステムとカメラの電源を入れてください。顕微鏡の下にマイクロメーターを配置し、得られた画像を用いてシステムのキャリブレーションを行ってください。

次に流体を流し、両方の流体中の粒子を可視化します。流れの中で最も速く、最も明るい粒子に焦点を当てて、マイクロチャネルの中央平面を特定します。次に、最速の粒子が2枚の画像間で5〜10ピクセル移動するように、フレーム間の時間間隔を約2ミリ秒に設定し、流れの記録を開始します。すべての異なる赤血球懸濁液および異なるせん断速度について、100組の画像を取得するようにソフトウェアを設定します。

画像のプリプロセッシング後、相関ウィンドウのサイズと形状、および画像のオーバーラップ率を選択します。結果は、100組の画像ペアから算出された平均速度場と、速度の二乗平均平方根誤差（RMSE）として表します。

レーザーカメラとコンピュータの電源を切ります。すべての測定と画像処理が完了した後、まず高速カメラの録画に基づいてマイクロチャネル内の血液の厚さを検出し推定し、せん断率を算出します。この目的のため、特定の録画内のすべてのフレームを平均化し、ビデオの背景画像を取得します。

最後に、全フレームの平均画像を視覚的に確認して血層の端を手動で検出し、血層を画定します。次に、抽出された速度プロファイルから、対応する血層厚における速度値を手動で取得し、その速度値を血層厚で割ることでせん断率を算出します。ここに示されている厚さは、3連続フレームで検出された4つの赤血球凝集体の正味の移動量に基づいています。

30個以上の細胞からなる大きな凝集塊を赤色で示しています。9個から30個の細胞からなる中程度の凝集塊を緑色で、9個未満の細胞からなる小さな凝集塊を青色で示しています。凝集塊の速度は、図に示されているマイクロチャネル内での位置によって異なります。

以下は、流速10 µL/hrにおけるヘマトクリット値5%、10%、および15%で懸濁させた赤血球の速度プロファイルです。予想通り、両端で速度がゼロに向かうことがわかります。また、2つの流れの間の変曲点は、ヘマトクリットレベル間でわずかに異なります。これは、全体のせん断速度が増加することで、各ヘマトクリットレベルにおける凝集体のサイズが低下するためです。これは、マイクロチャネル内のせん断力が凝集力を上回り、赤血球が分散するためです。

この手順を行う際は、マイクロチャネル内の流れの画質を十分に確保し、流れる赤血球と背景画像のコントラストを明確にすることが重要です。このビデオを視聴することで、制御された流れの条件下で赤血球凝集体を定性的および定量的に分析する方法について、十分に理解できるはずです。