細胞外小胞の単​​離および特徴のための紙ベースのデバイス

この手順の全体的な目標は、紙ベースのプラットフォームを使用して細胞外小胞を分離することです。これは、最初に円形のセルロースを備えた2枚のポリスチレンシートでラミネートすることによって達成され、紙の切り欠きは登録されたスルーホールの配列に整列されます。2番目のステップは、細胞外小胞を紙のテストゾーンに結合する分子を化学的に結合することです。

次に、生体サンプルを紙製テストゾーンに直接ピペットで移動し、すすぎステップ後に細胞外小胞を分離します。最後のステップは、電子顕微鏡、Eliza、またはトランスクリプトーム分析を使用して、捕捉された細胞外小胞を特徴付けることです。最終的には、わずか10マイクロリットルの血清サンプルから得られる細胞外小胞のサブセットを精製し、濃縮することができます。

したがって、ウルトラエデュケーションのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、組み立てが非常に穏やかで、実行が簡単であることです。手順を実演するのは大学院生になります。2枚のポリスチレンから始めて、円形の切り欠きの配列を作成します。

それぞれが手動穴あけパンチまたはCAD自動カッタープロッターのいずれかで5ミリメートル未満の直径を示します。さらに、直径5mmのクロマトグラフィーを連続して切り取り、穴あけパンチで紙ディスクを切り取ります。ベンチにポリスチレンシートを1枚置き、対応する貫通穴の上に1枚のペーパーディスクを重ねます。

2枚目のポリスチレンをレジストレーションして重ねて、紙のディスクを挟みます。サンドイッチをサーマルラミネーターに接着する前に、全体的な位置合わせを確認してください。次に、ラミネートされたデバイスをプラズマチャンバーに挿入して、紙ディスクの化学表面修飾を開始します。

チャンバー真空の放出時に酸素プラズマで紙面を短時間活性化し、直ちに紙デバイスをシリン溶液に移し、30分間インキュベートします。室温を設定します。5ミリリットルの200プルーフエタノールでデバイスをすすいで、余分なサイレーンを取り除きます。

次に、デバイスをA-G-M-B-Sリンカー溶液と15分間インキュベートします。室温を設定します。余分なリンカー分子を大量のエタノールリンスで取り除きます。

次に、装置をアバドンと摂氏4度で1時間インキュベートし、結合していないアバドンを5ミリリットルのPBS洗浄液で除去します。その後、デバイスは抗体結合ステップに進むか、必要に応じて摂氏4度で4週間保存することができます。Adenアタッチメントの上で、露出した紙のディスク領域にブロッキング溶液10マイクロリットルをピペットで移し、紙を10分間インキュベートします。

室温で、10マイクロリットルのブロッキング溶液の添加と10分間の室温インキュベーションを繰り返します。露光した紙基質の生体機能化を完了するためにさらに2回、ビオチン化捕捉分子の10マイクロリットルをディスク上にピペットし、細胞外小胞の室温で10分間インキュベートし、選択の捕捉分子は抗CD63抗体またはxin 5のいずれかであり得る。10マイクロリットルのピペッティングと10分間のインキュベーションプロセスを繰り返します。

さらに2回、分子の付着を捕捉した後。ピペッティングで余分な部分を洗い流します。10マイクロリットルの適切な洗浄バッファーを各紙ディスクに塗布します。

室温で1分間洗浄液をインキュベートし、10マイクロリットルの洗浄液と1分間のインキュベーションをさらに2回繰り返します。完全に機能化された紙製デバイスは、血清処理のために血清または房水から細胞外小胞を分離する準備が整いました。バキュテナーチューブに10ミリリットルの末梢血を採取し、チューブを5回静かに反転させます。

チューブを垂直位置に置き、30分間待ちます。室温を設定し、血液サンプルを15分間遠心分離します。室温を設定します。

上部の透明な血清層をきれいなプラスチックチューブに移し、下部の半固相を廃棄します。血清を高速遠心分離速度で30分間清澄化します。室温を設定します。

上清を新しいチューブに移し、上清を0.8マイクロメートルのフィルターに通して微粒子を除去します。得られたろ過された血清は、すぐに使用することも、摂氏マイナス80度で保存することもできます。細胞外小胞を体液から抽出する場合は、侵襲的な手順を通じて患者から直接房水を収集し、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。.

使用するまで、硝子体液サンプルのろ過や清澄化のステップは必要ありません。血清または房水から細胞外小胞を単離するには、生体サンプルの5マイクロリットルを各生体機能紙基板ディスクにスポットピペットで固定します。スポットを室温で1分間インキュベートし、5マイクロリットルのピペッティングと1分間のインキュベーションプロセスを繰り返します。

アフィニティー結合後、まず適切な洗浄バッファー10マイクロリットルをピペッティングして、結合していない小胞を洗い流します。緩衝液を室温で1分間インキュベートし、10マイクロリットルの洗浄とその後のインキュベーションを繰り返します。さらに 2 回ステップを実行します。

捕捉された細胞外小胞は、捕捉された小胞を官能基化された紙支持ピペット10マイクロリットルの0.5×カルノフスキー固定剤の各紙ディスクに固定するための次の下流アッセイの準備が整いました。架橋反応を室温で10分間進行させ、すべてのディスクを大量のPBSで5分間すすぎます。次に、以下の洗浄を順番に塗布して紙基材を脱水します。

35%エタノールインキュベーション1回、50%エタノールインキュベーション2回、70%エタノールインキュベーション2回、95%エタノールインキュベーション2回、100%エタノールインキュベーション4回。個々の洗浄ごとに、エタノール溶液を紙ディスクの上で室温で10分間インキュベートします。紙製デバイスがボーンドライスパッタの場合は、金属スパッタに18ナノメートルのパラジウム金の層でサンプルをコーティングします。

サンプルを走査型電子顕微鏡に挿入し、5キロボルトで顕微鏡検査を行い、生体サンプルの過剰な帯電を防ぎ、イムノアッセイによって捕捉された小胞を検出します。まず、5マイクロリットルの抗CD nine一次抗体を各紙ディスクに加え、室温で1分間インキュベートします。機械的攪拌により、紙製デバイスを30ミリリットルの室温PBSで洗浄することにより、結合していないすべての抗体を除去します。

次に、5マイクロリットルの西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体を各紙にピペットで移します。ディスク化し、室温で1分間インキュベートします。機械的攪拌により30ミリリットルのPBSでデバイスを洗浄し、結合していない二次抗体を除去します。

最後に、5マイクロリットルのカラーとメートル法の基質混合物を各紙ディスクに加えます。室温で反応を20〜30分間インキュベートし、デスクトップスキャナーを使用してスポットカラー強度の変化をスキャンします。まず、ハサミまたはカミソリの刃を使用して余分なポリスチレンラミネートの領域を切り取り、個々の紙ディスクをバルクデバイスから分離します。

各紙ディスクをきれいな1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機に入れます。2つの溶解バッファーの265マイクロリットルを添加することにより、捕捉された小胞を溶解します。そして、35マイクロリットルのPVPベースの多糖類除去キャリアを各チューブに激しく渦巻かせます。

遊離したRNA分子の完全な小胞、溶解、および除去を確実にするために、ライセートボルテックスに30マイクロリットルのホモジネート溶液を加えて混合し、チューブを氷上で10分間インキュベートします。次に、330マイクロリットルの酸性フェノールクロロホルム混合物をライセートに加えて、チューブあたり少なくとも15秒間、タンパク質とDNAボルテックスの両方からRNAが適切に位相特異的に分離されるようにします。チューブを全速力で5分間遠心分離します。

室温で、上部水相を含むRNAを新しい1.5ミリリットルチューブに移し、下部有機相を廃棄します。1.25 aamount amount of 100%ethanol を RNA に加え、短時間ボルテックスして混合します。次に、混合物を市販のRNA固体抽出カラムに適用します。

チューブを室温で15秒間遠心分離し、フロースルーフラクションを廃棄します。700マイクロリットルの作業溶液を加えてカラムを洗浄します。1つ目は、チューブを5〜10秒間遠心分離し、流れを捨て

次に、カラムを500マイクロリットルの作業溶液で洗浄します。その2、チューブを5〜10秒間遠心分離します。流れを捨てて、もう一度洗濯を繰り返します。

室温で最後の1分間のスピンダウンで残留エタノールを除去し、乾燥した抽出カラムを新鮮な1.5ミリリットルチューブに移します。予熱したR RNAフリーの水100マイクロリットルを加えます。チューブを全速力で5〜10秒間遠心分離し、必要に応じて上部の抽出カラムを廃棄します。

市販のRNAクリーンアップキットで蛍光標識ビオチンを使用して、RNA EITを濃縮し、さらに精製します。表面Im動員のレポーターとして。紙の官能基化プロトコールの有効性と特異性は、架橋剤修飾表面で発生する高い蛍光を非官能基化紙表面と比較することで確認できます。

さらに、レポーター分子をビオチン化抗CD63抗体に置き換えると、適切に機能化された紙基質は、ネガティブコントロール紙基質よりも高い細胞外小胞捕捉率を促進します。異なる捕捉分子を紙基板に固定化すると、紙製デバイスを使用して、細胞外小胞の異なるサブグループが異なるサイズ分布を示すように見えます。また、膀胱内RNAの含有量と小胞特異的な表面タンパク質の存在量の両方をアッセイすることもできます。

このビデオを見た後、紙ベースのデバイスを使用して細胞外レスで上昇を分離し、対応する方法をよく理解しているはずです。