共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

本実験の全体的な目的は、網膜の生体内共焦点イメージングを用いて、慢性緑内障マウスモデルにおけるミクログリアのダイナミクスを明らかにすることである。これは、非侵襲的な月次共焦点眼底検査またはCSLOにより、網膜および視神経乳頭上の蛍光標識ミクログリアを観察することで達成される。閾値に基づく細胞体（SOMA）セグメンテーションおよび形態解析を用いた生体画像解析により、ミクログリアの細胞数および活性化の状態の変化を定量化する。

結果から、生存マウスにおける月次のCSLOイメージングを用いて、慢性的な神経変性の初期進行過程におけるミクログリア細胞密度の分布および形態学的活性化のキネティクスをモニタリングできることが示されました。GFP陽性ミクログリアマウス脳の2光子共焦点イメージングなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、網膜のCSLOイメージングにより、個体全体の老化に伴う神経変性疾患の進行を通じて、ミクログリア細胞を直接的に観察およびモニタリングできることです。私は、若齢のDBA/2Jマウスにおいて、検出可能な神経変性が起こる前の年齢で、ミクログリアが中心網膜において激しい活性化とクラスター形成を示すことをexvivoで実証した後、初めてこの手法を考案しました。

緑内障が検出される前に生じたこれらの初期先天性免疫変化が、神経変性を引き起こしたのかどうかを明らかにするため、ミクログリアの変化を追跡するためのin vivoアプローチを確立する必要がありました。生体イメージングの取得手順については、私の研究室の技術者であるCaesar Romeroが実演します。まず、CSLOシステムを起動し、セッション情報を入力します。次に、安全にイメージングが行えるよう準備します。

洗浄済みの55度広視野対物レンズを取り付けます。麻酔剤投与の2分後にマウスをイメージングプラットフォーム上に置き、散瞳薬を用いて両瞳孔を散瞳させます。5分後、マウスが麻酔状態にあることを確認します。

次に、最小限の圧力で、両眼をコンタクトレンズで覆います。マウスの向きを調整し、右眼を対物レンズに合わせ、眼窩がレンズと平行になるようにします。動物を固定する必要はありませんが、対物レンズから一定の距離を維持してください。

その後10分から15分間、眼を装置に合わせた状態で、CSLOライブイメージングシステムで眼球運動を追跡している間、マウスは動かず、瞬きもしません。まず、内層網膜の眼底像を撮影してイメージングセッションを開始します。そのための手順は以下の通りです。

励起波長 820 nanometers に対応する赤外線モードを選択します。次に、レーザー出力を 100% に、感度を 40% から 60% の間に調整します。続いて、ジョイスティックで眼底鏡を操作して迅速に眼の位置を特定し、視神経乳頭および網膜血管の眼底像を採取する準備をします。角膜と水晶体に損傷や混濁がないか確認してください。

画像取得に影響を及ぼす可能性のある欠損または外傷のある眼を研究から除外します。次に、対物レンズを眼に近づけ、視神経乳頭（ONH）の表面である視神経乳頭領域を特定します。その後、ONHが画像の中央にくるように調整します。

ONHを正しく配置することは、画像全体で均一な焦点とデミッションを得るための鍵となります。次のステップは、ONHとともに網膜の内層を可視化することです。基準となる焦点面として、網膜の硝子体表面に位置する主要な血管を使用します。これは59および60ジオプトリーに相当し、視神経乳頭の陥凹領域ではさらに深い55ジオプトリーになります。

次に、視神経乳頭の周囲の眼底の大部分に白い照明のハローが広がるまで、タッチパネルのノブを使用して画像の彩度を調整します。その後、その眼にとって最適なコントラストを示す均一なハローが得られる、より低い彩度を選択します。暗い領域が残る場合は、カメラの再調整が必要になることがあります。

次に、信号対雑音比を向上させるため、リアルタイムで撮影した30フレームを平均化し、中心網膜の高解像度眼底画像を取得します。これは1秒あたり4.7フレームに相当し、直ちに正規化を行い、GFP陽性細胞の蛍光画像を取得するための準備として同じ位置に合わせます。タッチスクリーンパネルで蛍光イメージングモードに切り替えます。これにより、488 nanometerのレーザー励起を用いる青色レーザーと460 to 490 nanometerのバリアフィルターセットが選択されます。取得設定をレーザー出力100%、感度100 to 125%に設定します。

次に、100回のxスキャンを平均化したONHの単一XY点2次元蛍光画像を収集します。続いて、コントロールパネルでコンポジットを選択し、検眼鏡を用いて鼻側・耳側軸に沿ってパンしながら、ONH周囲の網膜のマルチポイント画像をキャプチャします。ソフトウェアは、新しくスキャンされた領域を自動的に平均化し、リアルタイムでステッチ処理を行います。

網膜の一部の画質が不十分で平均化ができない場合、スキャン領域を示す緑色の円が赤色に変わります。得られる合成画像は、最大1.7 × 4 mmの領域をカバーします。合成画像の取得時には注意を払ってください。

スキャンの平均化および画像のスティッチングが完了する前に対物レンズを速く動かしすぎると、高解像度の画像が失われる可能性があります。麻酔が切れ始めると、マウスの呼吸が激しくなり、イメージングが困難になるため、セッションを終了しなければなりません。まず、血管系と視神経乳頭をランドマークとして使用し、タイムシリーズ用の眼底画像を順次アライメントします。

一般的な画像編集ソフトを使用して、すべての画像がO hsで重なるまで整列させます。ドラッグ中、上の画像は半透明になります。次に、各画像について、主要な血管が前の画像の血管系と重なるまで回転させ、今後の参照のためにその配置を保存します。

各画像の補正角度を記録し、対応する単一XY点蛍光画像に適用します。これにより、アライメント済みのTIFFファイルをFluor renderで開くことで、中心網膜に局在する個々のGFP陽性ミクログリア細胞を識別することが可能になります。すべての細胞を可視化するには、画像を画面いっぱいに表示し、レンダービューの設定をcomposite orthogonalおよびinterpolatedに定義します。

次に、プロパティを 0.58 gamma、255 saturation point、255 luminance、195 alpha、shading を 1.00 と定義します。RGチャネルの両方を可視として選択し、選択を完了させます。個々の細胞をセグメント化するため、ワークスペースフレーム内でBチャネルをダブルクリックして非表示にします。

レッドチャンネルを選択し、ハイしきい値を固定したまま、細胞突起を除外し、かつ大部分の細胞が最小限の重なりでマスクされるまでローしきい値を上げてしきい値処理を行います。最後に、captureコマンドを使用して、マスクされた細胞を含むファイルを保存します。そこで、マスクされた細胞を含む画像をラスターグラフィックエディタで開きます。

直接観察のためにグレースケールを反転させ、解像度を300 DPI以上に調整します。RGB画像はTIFファイルとして保存されます。ライブ画像解析の次のステップはミクログリアの解析であるため、面積定量化のためのSATAを特定するために、セグメンテーションおよび形態解析を行います。

閾値に基づいた強度測定およびオブジェクトカウントが可能なソフトウェアを使用してください。セグメント化された細胞を含むTIFFファイルを開き、最大解像度を得るためにスプライン再スケーリングを選択し、視認性を高めるためにレッドチャンネルを白黒に設定します。次に、個々の細胞をセグメント化するため、年齢に応じて水平方向の直径を1.4から1.7 millimetersと定義し、画像をキャリブレーションします。

次に、レッドチャンネルに強度しきい値を適用します。「Object Count and Account Update」コマンド内にあるしきい値強度関数を開いてください。この関数を使用して、個体を表す関心領域の各しきい値について、二次元パラメータを追跡します。

次に、強度ヒストグラムにおいて強度しきい値を定義します。255段階のレベルのうち、下位50～60%を選択し、個々の細胞の最終的なしきい値を調整します。バイナリツールバーのコントロールまたはオブジェクトカタログを使用して、青色のしきい値カラーマスクと灰色の細胞体外周との重なりを視覚的に評価してください。

複数の細胞を含む細胞体領域（ROI）を手動で特定します。これらの要素を分離するために、ROIを分けて指定してください。その際、トグルを使用して領域制限を行い、細胞を直接可視化してください。

細胞体の面積が50～60 µm²より大きい場合は、マイクログリア細胞を活性化状態として分類します。細胞体がそれより小さい場合は、マイクログリアを非活性化状態として分類します。

最後に、細胞体マスクと単一のXY点画像を重ね合わせ、コントラストを50%上げて、各活性化ミクログリア細胞のプロセスを確認し、分枝の複雑さをチェックします。記述したプロトコルを用いて、中心網膜の広範囲にわたるミクログリア細胞を可視化しました。CX3CR1-GFPをヘテロで発現する若齢のDBA/2Jマウスにおいて、高い細胞解像度とライブイメージング、しきい値処理、および形態計測解析を組み合わせることで、個々のGFP陽性細胞の自動セグメンテーションが可能となり、面積に基づいて細胞を判別しました。DBA/2Jマウスは慢性緑内障モデルであり、個々の眼における神経変性の進行速度のばらつきと一致して、検出可能な神経変性が起こる前の段階から、局所的なミクログリア増殖およびミクログリア活性化の進展をモニタリングするために毎月撮像を行いました。この解析により、網膜ミクログリアの活性化およびミクログリア増殖の時間的変化が明らかになりました。

また、解析により、個々の網膜内における総ミクログリアおよび活性化ミクログリアの密度の動的な変化が検出されました。ミクログリアの個体群密度は、他の知見と一致して、GFP発現細胞密度の変化とは連動していませんでした。したがって、CSLO解析は早期の疾患進行の指標として利用できる可能性があります。

本手順を行う際は、内網膜に局在するGFP陽性ミクログリアの蛍光画像の飽和レベルを慎重に最適化することが重要です。中心網膜のCSLO画像の再現性、および中心網膜全体で検出される一貫した細胞の詳細度は、この開発後のステップに決定的に依存します。このライブイメージングプロトコルは当研究室で適用されており、DBA/2Jマウスおよびその他の慢性網膜変性モデルにおいて、網膜および視神経乳頭のミクログリアにおける早期の変化と、その後の緑内障の進行との潜在的な関連性を検証しています。また、このライブイメージング戦略は、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病など、網膜や視神経の変性を引き起こす他の慢性疾患の早期検出にも寄与する可能性があります。