Name: 共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶ共焦点検眼鏡イメージングによるマウス緑内障モデルの網膜ミクログリア動態解析法。CX3CR1-GFP蛍光標識と月次CSLO観察で神経変性初期の細胞密度・形態変化を非侵襲的に追跡し、治療開発に寄与する。

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FluoRenderソフトウェア（R01GM09815を使用してくださったユタ大学のScientific Computing and Imaging Instituteに感謝します。この研究は、緑内障研究財団、メルサ・M・アンド・フランク・セオドア・バー財団、米国国立衛生研究所、(R01EY020878およびR01EY023621)からM.L.V.、および(R01EY017182およびR01EY017950)B.K.A.からの助成金によって支援されました。

in vivoイメージングではユタ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して病原体を含まない施設で行われています。 注：このイメージングプロトコルは、網膜ミクログリアおよび浸潤単球/マクロファージは、フラクタルカイン受容体遺伝子座（CX3CR1）の制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するレポーターマウスのために使用されます。 走査型共焦点レーザー眼底検査により網膜のGFP +ミクログリアのin vivoイメージング 1.（cSLO） <ol><li>手順の間に35〜37ºCの間のマウスの温度を安定させるために設定し、水制御された加熱システム、電源を入れ、2つの加熱パッドを接続します。 <ol><li>共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）システム（ 図2A）を起動します。 cSLOプログラムを開き、個々のマウスを識別し、2ミリメートル（患者データ]メニュー）の角膜曲率を設定します情報を入力します。 </li></ol></li><li> IMAの準備エージング。しっかりとそのソケットのクリーン55º広視野の対物レンズを取り付けます。きれいな紙で覆われた加熱パッドを固定することにより、検眼鏡の撮影台を準備します。パッドや紙を平らにし、対物レンズの移動を阻止するからそれらを保つためにクリップを使用してください。 </li><li> 1.3％2,2,2-トリブロモエタノールおよび0.8％tert-アミルアルコールの腹腔内注射によりマウスを麻酔（250 mg / kg体重; 0.5ミリリットル/ 25グラム体重）を1mlの使い捨てに装着30½G針を使用して注射器。そのケージにマウスを返し、加熱パッド上に保持。 注：吸入対注射による麻酔薬の送達はノーズコーンとチューブの自由、イメージングや目に遮るもののないアクセスのためのマウスの容易な位置決めを可能にします。 </li><li>動物が移動を停止し、尾のピンチに反応しないすると、発生しやすい動物を配置し、7分間滴で両眼を覆うことにより、トロピカミドおよびフェニレフリン（0.5％ずつ）で瞳孔拡張を誘導します。 </li><li> 5分、pの後の検眼鏡プラットフォームの中心になりやすいマウスをレースし、最小限の圧力をかけ、両眼の上にコンタクトレンズを装着します。 注：鉗子、代わりに40を使用することができるが、コンタクトレンズは、小型で壊れやすいが、慎重に指で取り扱うことができます。コンタクトレンズの使用は任意であるが、それは目の乾燥を最小限に抑え、撮像中に角膜の透明性を保持するようお勧めします。 </li><li> 7分後、プラットフォーム（ 図2B）のエッジ付近の気ままな動物を維持し、対物レンズと、対物レンズへの軌道と平行に向かって右目でマウスを向けます。同程度の飽和と向きの画像を収集するために、常に対物レンズに目からの距離だけでなく、イメージングセッション全体に光路に目の位置合わせを維持。目の観察を妨害する長いウィスカをクリップ。 注：次の8-10分のために、マウスを移動したり、点滅、および穏やかな動きとなります息ませんコントラストの高い眼底ランドマークに基づいて、走査ヘッドの位置を調整cSLOアイトラッキング技術（自動リアルタイム）モードによって追跡されメント、。その時間を過ぎて、マウスは、イメージングが実用的でない、喘ぐと点滅し始め。 </li><li>イメージングは​​、コンタクトレンズを使用せずに行った場合、PBSを両眼に乾燥するのを防ぐために、すべての2~3分を廃棄適用します。 </li><li>網膜血管系および視神経乳頭の眼底画像を収集し、内側の網膜に焦点を当てました。 <ol><li>赤外線モード（IR）を選択し、820 nm励起、100％のレーザーパワー、40〜60％の感度（ 図2C）に設定を調整します。 </li><li>高速モード（12.6フレーム/秒）での作業、検眼鏡を駆動するために、ジョイスティックを使用して、目を探します。低倍率では、傷害や不透明性のため、角膜とレンズを検査し、網膜（ 図3A）イメージング影響する欠陥や損傷と研究の目から除外する。 </li><li>視神経乳頭領域（の表面の位置を確認します近い目に目的を持って来ることにより、視神経乳頭、ONH）は、その上に画像を中心とジョイスティックをねじ込むことにより、この位置をロックします。検眼鏡の目のこ​​の位置合わせは、さらに、画像全体に焦点を当てると発光を得るための鍵となります。 </li><li>出土光学系を示す目に基準焦点面（59,60 D）、または深い（55 D）のような網膜の硝子体表面上に位置し、主要な血管を使用して、ONHと同様に、網膜の内側の面を視覚化ディスク。最適な焦点は明らかに異なる彼らの内腔と壁と、主要な血管内の血液の循環細胞解決する必要があります。 </li><li>均一な照明の白ハロ（わずかな露出オーバーを使用して）視神経乳頭の周り55º眼底フィールドのほとんどに及ぶまで、タッチスクリーンコントロールパネルのダイヤルを調整することにより、画像の鮮やかさを最適化します。次に、主要な血管に沿って移動する血​​液細胞が明確に解決することができるまで、コントラストを最適化するために彩度を下げます。焦点暗い場合領域は、網膜の損傷によるものではない永続化、均一に明るい画像が得られるまで、カメラに目を再調整します。この調整は、位置、品質の画像の再現性のあるセットをキャプチャするために基本的です。 </li><li>信号対雑音比を改善するために、;（正規化された4.7フレーム/秒）（ 図2Dリアルタイムに30フレームを平均化する、中心網膜（年齢に応じて、直径1.4〜1.7ミリメートル）の高解像度のIR画像を集め）。 </li></ol></li><li>すぐに、GFP +ミクログリアおよび/または網膜およびONHの内側面に局在浸潤単球の蛍光画像を取得。 注：網膜のIR眼底画像の最適化は、GFP +細胞の蛍光画像の分解能を決定するだけでなく、内側の網膜の範囲がスパン。血管系の不十分な分解能で検出することができる網膜の内側の面に焦点を当てるに失敗すると、淡色表示GFP +細胞のビュー（ 図3B）になります。 IRサトゥを調整に失敗比が正しくかつ均一にGFP +細胞の強度とサイズ（ 図3C）での人為的変化を導入し、蛍光画像（FA）に影響を与えます。 <ol><li>維持されている青色、488nmレーザー励起（460から490 nmのバリアフィルタセット）を使用してタッチスクリーンパネルの蛍光撮影モード（FA）と、取得設定（100％レーザー出力および100から125までパーセント感度）に切替スイッチすべてのマウス（ 図2E）のための定数です。 </li><li>単一のxy点、網膜の二次元蛍光画像を収集し、すぐに同一の位置に眼底画像を取り込む（100倍のスキャン平均;両方のイメージのために55º走査角; 図2F）。 </li><li>コントロールパネル（ 図2G）に「コンポジット」を選択し、検眼鏡の左右の移動、鼻、時間軸（ 図2H）を横切って網膜をパンニングによりマルチ画像をキャプチャします。 注：単一のXY点画像をスキャンした後（100×S同じと新しい分野の）、ソフトウェアは自動的に平均化する新しいスキャン（スキャンが実行不可能である場合に最適なスキャン中に緑色の円に外接する、または赤）を平均化し、リアルタイムですべてのxy位置をステッチすることができます。得られた合成画像は、縦軸（55ºX120-124º走査角度）の横軸のx 3〜4ミリメートルで1.5〜1.7ミリメートルに及びます。 </li></ol></li><li>点滅動きを再起動する前に、麻酔を誘導した後、15分以内に各マウスの完全なイメージング。 </li><li> PBSでコンタクトレンズ、水和物の目を削除し、運動性の完全回復までの動作を確認し、その温めケージに動物を返します。 </li><li>同じ個体のマウスで断続的cSLOイメージングセッションを使用して長期的な研究のために、麻酔の累積毒性、ならびに角膜の刺激を避けるために劣らず3日以上離れて撮影する繰り返します。 </li></ol> 2.ライブ画像処理と解析<ol><li>シーケンシャルイメージの位置： <ol><li>整列しますランドマークとしての血管系および視神経乳頭を使用して、同じ目の時系列のための眼底画像。そのまでのトップ画像を回転させ、その後、それらの光学ディスクがXY-平面上に整列するまで（ドラッグされている間、トップの画像が半透明表示されます）前の1つの上に、各画像をドラッグして、商業スライドショープレゼンテーションプログラムですべての画像を開きます。主要な血管が（視神経円板から最も遠い船に焦点を当て）下の画像上の血管系と重なります。各画像の回転角度を記録し、今後の参考のため、この時系列を保存し、マウスと目のアイデンティティを追跡します。 </li><li>ラスターグラフィックエディタプログラムを使用して、各時点でのXY回転を修正するために記録された角度を適用することによって、単一のXY点蛍光画像の対応する一連の位置を合わせ。さらに、300（リスケーリングなし）解像度と背景に解像度を調整（RGBモード、選択レベルで、黒などの血管の内腔をサンプリング）。これらの画像を保存しますTIFファイルとして、その名前に「整列」を追加します。 </li></ol></li><li>ミクログリア細胞のセグメンテーション： <ol><li>最も早い時点/時代に対応する「整列」TIFファイルFluoRenderで開いて、中心網膜におけるGFP +細胞を同定します。画面に合わせて画像をズームし、目に見える（非表示のように、両方のRGチャンネルを選択して、レンダービュー（コンポジット、直交、補間）とそのプロパティ（0.58ガンマ、255飽和点、255輝度、195アルファ1.00シェーディング）を定義ダブルクリックワークスペースフレームでそれをすることによってBチャネル; 図4A）。 </li><li>細胞の大部分がマスクされるまで、高閾値を一定に保ちながら、最小の重なりや細胞プロセスと（白）（シアン）低閾値を増加させることにより、赤チャネルに（ワークスペースフレームで強調表示されなければならない）、個々の細胞、しきい値を選択するには（255）。低いしきい値は、蛍光強度（ 図4B &lt;によっては、100と170の間で変化します/強いです&gt;）。 </li><li>元の名前（ 図4C）に「cellsegm」を追加し、新しいTIFファイルとして見える赤チャンネルのみ（キャプチャコマンド）と、このビューを保存します。一般的なラスタグラフィックエディタソフトウェアを使用して、そのグレースケールが反転し、上記のように300 dpiのに解像度を調整し、RGB（ 図4D）として再度保存します。 注：自動的にFluoRenderによって作成されたフォルダ（プロジェクト）を削除して、今後の参考のために適用されたしきい値を保存します。 </li></ol></li><li>ミクログリア細胞体のセグメント化と形態計測： <ol><li>エリア定量化のために、GFP +細胞の細胞体を同定するために、自動化された強度測定値としきい値機能だけでなく、しきい値ベースのオブジェクトのカウントと測定と画像解析ソフトウェアを使用しています。 「cellsegm「TIFファイルを開き、再スケーリング法（スプライン）と赤のチャンネルを選択します（RGBの赤いタブをクリックします）。 「色のビューチャンネル」を選択解除して可視化を向上させる（赤RGを右クリックし、Bタブ）と、「色を補完」を選択する（画像/グレースケールを反転し、白の背景（ 図4E）ブラックオーバー/グレーのセルを参照するように）画像を調整します。 </li><li>画像全体（校正、クイックキャリブレーション）を横切って水平線を描くことによって、年齢に応じて1.4〜1.7ミリメートルにイメージを調整します。 </li><li>強度閾値（ 図4B）を適用することにより、セグメント個々の細胞細胞体。このため、赤のRGBチャンネルの仕事とは、閾値強度機能を開きます（オブジェクト数、「カウント更新」コマンドを選択）は、個々の細胞体を表す関心（ROI）の各閾値領域を二次元のパラメータを追跡するために。 </li><li> 255レベルの最も低い50〜60％を選択し、目視で閾値カラーマスク（青）、および細胞体の周辺部（グレー）との間の重なりを評価することによって、最終的な閾値を精製して、輝度ヒストグラムにおいて強度閾値を定義します個々の細胞（Figure 4E）。 </li><li> 10細胞における分割前後の面積を測定することにより、ソマ​​リ族の寸法を表し、測定は（バイナリツールバーと注釈測定値を使用）10％未満で異なる場合に選択された閾値範囲を受け入れるように細胞体マスクの精度を推定します。 </li><li>手動で複数のセルを含み、直接細胞（ 図4F）を可視化するためのバイナリのオン/オフを切り替えることながら、これらの要素は、（バイナリツールバーコントロール、またはオブジェクトカタログを使用して除去するか、別個のROI）を分離ソマリ族の関心領域を特定します。 </li><li>活性化ミクログリアに対応するセルの細胞体を区別するために50〜60ミクロン2より大きく、小さいソマリ族の領域でのROIとしてミクログリア細胞を分類し、エリア制限を使用することにより、それぞれミクログリアを非アクティブ化。 注：各セルのソマリ族のサブセットが異なる疑似カラーバイナリ層で識別され、さらに他の形態学的パラメータについて特徴付けることができる（perimeター、真円度等 ）、並びに個別の網膜セクタ（ 図4G）内で定量しました。 ND2ファイルとして解析した画像を保存します。 </li><li>プロセスを確認し、個々の活性化ミクログリア細胞が複雑に分岐、ソマリ族マスク、単一のxy -点の画像を重ね合わせることによって（コントラストが50％増加した。 図4H）。手動で直接細胞体から伸びる過程を数えるか、アーバー（バイナリツールバーと注釈測定値を使用）を包含する多角形の直径を測定します。 注：活性化された細胞は、プロセスを欠いているか、分岐し、大規模なアーバー（&gt; 3-10xソマリ族の直径）を含む非活性化細胞プロセスとは対照的に、いくつかの（&lt;4）とショート（&lt;2倍のソマリ族の直径）のものを負担する、比較的周囲小さなソーマ。 </li><li>手動したがってinで検出されない検出限界以下に細胞体よりも小さい&lt;20μmの2および/ ​​またはGFP発現を有する細胞を同定tensityのしきい値。手動で識別された要素をカウントするために注釈に分類コマンドを使用します。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

神経変性疾患の間の小グリア細胞の数および形態学的活性化のライブモニタリングは、細胞機能の詳細な視覚化を可能にする非侵襲性の画像化方法を使用する必要があります。撮影後、ミクログリア細胞は、ミクログリアの活性化のための読み出しとしてソマリ族のサイズおよび/またはプロセスの複雑さを評価するために、複数のしきい値工程の使用により、形態学的分析のために（セグメント化）を単離する必要があります。このプロトコルでは、我々はcSLOを使用して、ライブ画像の取得、および順次細胞と体細胞のセグメンテーションに基づいて、ミクログリアの活性化の定量分析のための方法を説明します。我々は、網膜の慢性神経変性疾患との関連で2ヶ月の間に網膜ミクログリアの活性化および小膠の動態を評価するために、これらの戦略を適用します。 レポーターマウスおよびミクログリア/末梢単球細胞型フラクタルカイン受容体（CX3CR1）の制御下でGFPを発現するマウスの使用座46は、常駐ミクログリアの信頼性の高い同定を可能にする、堅牢なGFP発現は、in vivo...

ミクログリアはもっぱら初期胚発生以来と成人期を通じて、中枢神経系（CNS）に存在する神経免疫細胞です。受容体の複雑なレパートリーを搭載し、ミクログリア活性および地域の異質性は、隣接するニューロン、グリア、血液脳関門および神経炎症細胞1,2浸潤との双方向の相互作用によって調節されています。基礎ミクログリア関数は、ホメオスタシス3,4における摂動のために自国の領土をサンプルとして、生理的なメンテナンスや修理に貢献しています。 CNS傷害または病気の間に、ミクログリアは、その後、反応性の表現型への移行を誘発する神経信号に第一応答者であり、「ミクログリア2,5-7活性化と呼ばれます。ミクログリアの活性化は、細胞体およびプロセスのサイズ変更に結合され、6-9の改造された遺伝子およびタンパク質発現の複雑なサイクルを伴います。ミクログリアの活性化、ならびに細胞の再分配とクラスタリングは、セルの数（と呼ばれる小膠）の局所的な全体的な増加を伴うことができます。これは、細胞増殖および自己再生から、または血液由来の単球の動員3,4,7,10-14ことなくもたらすことができます。年齢依存、慢性CNS疾患の広い範囲に、小膠細胞およびミクログリアの活性化、並列疾患進行15-19を持続。どのようにミクログリア衝撃神経変性は、彼らは、疾患の発症および進行に多様な貢献を有することができ、両方の神経保護および有害な役割を果たしている主な理由は、不明のままです。慢性CNS疾患を理解することを目的としたライブイメージング研究は、動物モデルおよびヒトの損傷したCNSにおける小膠細胞の挙動を監視し、ミクログリアの変化は疾患の初期段階で検出15-17,19,20始まりであることを実証しました。従って、 インビボでのミクログリアの活性化を検出し、監視するためのアプローチを開発することが重要です。 非侵襲的DETE脳のミクログリアの活性化の地域変化のctionは、分子イメージングまたは生物発光と陽電子放射断層撮影法または磁気共鳴画像18,21,22を用いて、神経変性疾患の進行のインビボ指標で重要なものとして設立されました。これらの高度に定量的および非侵襲的な分子と核イメージング法は、地域の分解能で神経膠症を検出します。あるいは、CX3CR1 GFP / +マウスにおける二光子共焦点イメージングは、細胞解像度3,4,9,20,23-28で脳のミクログリアの観察を可能にしました。しかし、この方法は、さらに低侵襲的脳イメージング手順29によってその動作を妨害する潜在的なリスクを考慮すると、長期的な慢性のミクログリアの変化の繰り返し観察を制限します。あるいは、網膜は、急性損傷後の、 生体内可視化と高齢化を通じて、その無傷のCNS ​​のニッチにおけるミクログリアの繰り返しモニタリングで 、直接に最適な条件を提供し、潜在的に慢性神経変性疾患中。したがって、最近の研究では、画像に共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）ライブCX3CR1 GFP / +マウスを適合させることにより、GFPを発現する網膜ミクログリアの高分解能イメージングの可能性を証明しています。これは、誘導された急性傷害または高眼圧症30-36以下の最大10週間、個々のマウスにおけるGFP +細胞数の毎週の変化を追跡するために使用されています。 我々は、数ヶ月にわたって長期撮影を行い、定量的形態計測分析を用いて、細胞体の大きさに基づいて、ミクログリアの活性化の変化を追跡するために、このアプローチを拡張しました。ソマリ族サイズがCX3CR1-GFP +ミクログリア9のインビボイメージングに実行するために、皮質切片における二光子共焦点顕微鏡を使用してライブイメージング研究におけるミクログリア活性化の有用な基準として定義しました。これらおよび他の研究はまた、WH、ソマリ族サイズとIBA1タンパク質発現のレベルの間の相関関係を示しましたICHはまた、活性化9,37とともに増加します。したがって、活性化ミクログリアは、生きたマウスにおいて同定することができ、それらの数および分布は、中枢神経系の健康と病気の間に経時的にモニター。 このプロトコルは、cSLOライブ画像の取得と分析のための方法は、ミクログリア細胞数、網膜神経節細胞（RGC）の変性（ 図1）の間に分布し、形態学的な活性化を監視することについて説明します。このように、本 ​​研究では使用しています。年齢依存性視神経と網膜神経変性を受け、年齢38,39の5と10ヶ月の間、疾患の進行の著しい変動を示し、継承緑内障（DBA / 2J）の1）マウスモデルを、2）毎月細胞細胞体と測定を分離するヘテロ接合CX3CR1 GFP / + DBA / 2Jマウスの網膜および無髄視神経におけるGFP +細胞の長期的な可視化高齢者3-5ヶ月のcSLO in vivoイメージング、セグメンテーションと閾値による3）ライブイメージング解析ザIR領域。これらの戦略は、慢性緑内障の初期段階網膜ミクログリアの活性化状態の動態を評価するために適用されます。

<table><tbody><tr><td>DBA/2JおよびCX3CR1-GFP/+マウス</td><td>ジャクソン研究所、バーハーバー、ME</td><td>000671、00582</td><td>マウスは社内で飼育されており、遺伝的浮動を防ぐために3〜4世代ごとに新しいブリーダーを導入しています。</td></tr><tr><td>30&frac12;G針と1mlのツベルクリンスリップチップシリンジ</td><td>BD、イーストラザフォード、ニュージャージー</td><td>州305106および309659</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-トリブロモエタノール、tert-アミルアルコール99%およびリン酸緩衝生理食塩水錠剤</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ</td><td>T48402、152463およびP4417</td><td>アベルチン溶液(pH 7.3、滅菌ろ過)は、作りたての溶液または4°Cで保存する必要があります。Cは最大1週間。</td></tr><tr><td>温熱療法T /ポンプ</td>ゲイ<td>マーインダストリーズ、オーチャードパーク、ニューヨーク</td><td>TP-650</td><td></td></tr><tr><td>綿先端アプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア</td><td>州23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>トロピカミド1%</td><td>バウシュ&Lomb、ロチェスター、NY</td><td>NDC 24208-585-64</td><td></td></tr><tr><td>PMMAコンタクトレンズ、1.70ベースカーブ、3.2 mm全径、0.40 mm厚センター</td><td>カンター&Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td><td>G003709</td><td>レンズは滅菌PBSですすぎ、ポリプロピレン製の箱に保管されています。</td></tr><tr><td>HRA/Spectralis 共焦点走査型レーザー検眼鏡およびEye Explorerソフトウェア</td><td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td><td>Version 1.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>PowerPoint</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>Version 14.4.3</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Version CS3</td><td></td></tr><tr><td>FluoRender</td><td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td><td>Version 2.13</td><td>フリーウェア。<a href="http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html" target="_blank">http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</a></td></tr><tr><td>NIS-Elements C</td><td>Nikon, Melville, NY</td><td>Version 4.30.01</td><td></td></tr></tbody></table>

共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

CNS常駐神経免疫細胞であるミクログリアは、異なる機能や遺伝子発現プロファイルを用いて活性化状態に切り替え、CNS損傷に応答してその形態と大きさを変換します。健康、傷害および疾患におけるミクログリアの活性化の役割が不完全に、それらの微小環境の変化に応じて、そのダイナミックで複雑な規制に理解されたままです。これにより、非侵襲的にモニターするために重要であり、無傷の生物の経時ミクログリアの活性化の変化を分析します。ミクログリアの活性化のインビボ研究では、CNS環境を変えることなく、ミクログリアの行動を追跡することに技術的な限界により遅延されています。これは長期的な変化を追跡する必要があり、慢性神経変性、中に特に困難でした。網膜、非侵襲的なライブイメージングの影響を受けやすいCNS器官は、慢性障害時にミクログリアの活性化の動態を可視化し、特徴づけるための強力なシステムを提供しています。 、in vivoイメージング、携帯解像度でミクログリアを可視化するために、共焦点検眼鏡（cSLO）とCX3CR1 GFP / +レポーターマウスを使用する方法の概要を説明します。また、我々は大規模な細胞サブセットでの細胞の活性化および密度の月次変化（網膜あたり200〜300細胞）を定量化するための方法を記載しています。我々は、in vivoでの画像の自動化されたしきい値ベースの形態学的分析を適用することにより、網膜における小グリア細胞活性化のライブ追跡するのに有用な測定基準としてソマリ族領域の使用を確認します。我々は、これらのライブ画像の取得を使用して、慢性緑内障のマウスモデルにおける網膜神経変性の初期段階ミクログリア活性化および小膠細胞の動的変化を監視するための戦略を分析します。このアプローチは、網膜や視神経に影響を与える慢性CNS障害におけるニューロンおよび軸索の減少にミクログリアの貢献を調査するのに有用であるべきです。

我々の最近のin vivoでの研究は、59後期神経変性に慢性緑内障およびそれらの関係の初期段階ONHおよび網膜ミクログリアの変化の速度とパターンを視覚化し、追跡するために、これらのライブ画像の取得及び分析方法を使用していました。ここでは、個々の若いヘテロ接合CX3CR1-GFPのDBA / 2J網膜における網膜中心（ 図5）の大領域にわたってミクログリア細胞を可視化するためにcSLO画像取得プロトコルを示しています。高い細胞決議に基づき、当社は、ライブ画像閾値を適用し、形態学的には、個々のGFP +細胞と細胞体（ 図6）の自動セグメント化を可能にする分析します。 慢性緑内障のこのモデルでは、検出可能な神経変性の前に年齢で地元の小神経膠細胞および/またはミクログリア活性化の開発を監視するために、我々は個々の若いヘテロ接合Cxの中の総ミクログリア細胞密度の毎月の変動を測定しました3CR1-GFPのDBA / 2J網膜年齢（ 図7A）の3~5ヶ月の...

ミクログリアの活性化および小膠は、慢性神経変性に重要な応答です。ここでは、in vivoで 、共焦点検眼鏡による網膜CX3CR1-GFP +ミクログリア細胞の長期的な可視化のための方法を提示し、閾値と形態計測のために識別し、それらの活性化を定量化するために分析します。我々は、年齢関連の緑内障の早期の段階でミクログリアの変化を監視します。

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

本実験の全体的な目的は、網膜の生体内共焦点イメージングを用いて、慢性緑内障マウスモデルにおけるミクログリアのダイナミクスを明らかにすることである。これは、非侵襲的な月次共焦点眼底検査またはCSLOにより、網膜および視神経乳頭上の蛍光標識ミクログリアを観察することで達成される。閾値に基づく細胞体（SOMA）セグメンテーションおよび形態解析を用いた生体画像解析により、ミクログリアの細胞数および活性化の状態の変化を定量化する。結果から、生存マウスにおける月次のCSLOイメージングを用いて、慢性的な神経変性の初期進行過程におけるミクログリア細胞密度の分布および形態学的活性化のキネティクスをモニタリングできることが示されました。GFP陽性ミクログリアマウス脳の2光子共焦点イメージングなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、網膜のCSLOイメージングにより、個体全体の老化に伴う神経変性疾患の進行を通じて、ミクログリア細胞を直接的に観察およびモニタリングできることです。私は、若齢のDBA/2Jマウスにおいて、検出可能な神経変性が起こる前の年齢で、ミクログリアが中心網膜において激しい活性化とクラスター形成を示すことをexvivoで実証した後、初めてこの手法を考案しました。緑内障が検出される前に生じたこれらの初期先天性免疫変化が、神経変性を引き起こしたのかどうかを明らかにするため、ミクログリアの変化を追跡するためのin vivoアプローチを確立する必要がありました。生体イメージングの取得手順については、私の研究室の技術者であるCaesar Romeroが実演します。まず、CSLOシステムを起動し、セッション情報を入力します。次に、安全にイメージングが行えるよう準備します。洗浄済みの55度広視野対物レンズを取り付けます。麻酔剤投与の2分後にマウスをイメージングプラットフォーム上に置き、散瞳薬を用いて両瞳孔を散瞳させます。5分後、マウスが麻酔状態にあることを確認します。次に、最小限の圧力で、両眼をコンタクトレンズで覆います。マウスの向きを調整し、右眼を対物レンズに合わせ、眼窩がレンズと平行になるようにします。動物を固定する必要はありませんが、対物レンズから一定の距離を維持してください。その後10分から15分間、眼を装置に合わせた状態で、CSLOライブイメージングシステムで眼球運動を追跡している間、マウスは動かず、瞬きもしません。まず、内層網膜の眼底像を撮影してイメージングセッションを開始します。そのための手順は以下の通りです。励起波長 820 nanometers に対応する赤外線モードを選択します。次に、レーザー出力を 100% に、感度を 40% から 60% の間に調整します。続いて、ジョイスティックで眼底鏡を操作して迅速に眼の位置を特定し、視神経乳頭および網膜血管の眼底像を採取する準備をします。角膜と水晶体に損傷や混濁がないか確認してください。画像取得に影響を及ぼす可能性のある欠損または外傷のある眼を研究から除外します。次に、対物レンズを眼に近づけ、視神経乳頭（ONH）の表面である視神経乳頭領域を特定します。その後、ONHが画像の中央にくるように調整します。ONHを正しく配置することは、画像全体で均一な焦点とデミッションを得るための鍵となります。次のステップは、ONHとともに網膜の内層を可視化することです。基準となる焦点面として、網膜の硝子体表面に位置する主要な血管を使用します。これは59および60ジオプトリーに相当し、視神経乳頭の陥凹領域ではさらに深い55ジオプトリーになります。次に、視神経乳頭の周囲の眼底の大部分に白い照明のハローが広がるまで、タッチパネルのノブを使用して画像の彩度を調整します。その後、その眼にとって最適なコントラストを示す均一なハローが得られる、より低い彩度を選択します。暗い領域が残る場合は、カメラの再調整が必要になることがあります。次に、信号対雑音比を向上させるため、リアルタイムで撮影した30フレームを平均化し、中心網膜の高解像度眼底画像を取得します。これは1秒あたり4.7フレームに相当し、直ちに正規化を行い、GFP陽性細胞の蛍光画像を取得するための準備として同じ位置に合わせます。タッチスクリーンパネルで蛍光イメージングモードに切り替えます。これにより、488 nanometerのレーザー励起を用いる青色レーザーと460 to 490 nanometerのバリアフィルターセットが選択されます。取得設定をレーザー出力100%、感度100 to 125%に設定します。次に、100回のxスキャンを平均化したONHの単一XY点2次元蛍光画像を収集します。続いて、コントロールパネルでコンポジットを選択し、検眼鏡を用いて鼻側・耳側軸に沿ってパンしながら、ONH周囲の網膜のマルチポイント画像をキャプチャします。ソフトウェアは、新しくスキャンされた領域を自動的に平均化し、リアルタイムでステッチ処理を行います。網膜の一部の画質が不十分で平均化ができない場合、スキャン領域を示す緑色の円が赤色に変わります。得られる合成画像は、最大1.7 × 4 mmの領域をカバーします。合成画像の取得時には注意を払ってください。スキャンの平均化および画像のスティッチングが完了する前に対物レンズを速く動かしすぎると、高解像度の画像が失われる可能性があります。麻酔が切れ始めると、マウスの呼吸が激しくなり、イメージングが困難になるため、セッションを終了しなければなりません。まず、血管系と視神経乳頭をランドマークとして使用し、タイムシリーズ用の眼底画像を順次アライメントします。一般的な画像編集ソフトを使用して、すべての画像がO hsで重なるまで整列させます。ドラッグ中、上の画像は半透明になります。次に、各画像について、主要な血管が前の画像の血管系と重なるまで回転させ、今後の参照のためにその配置を保存します。各画像の補正角度を記録し、対応する単一XY点蛍光画像に適用します。これにより、アライメント済みのTIFFファイルをFluor renderで開くことで、中心網膜に局在する個々のGFP陽性ミクログリア細胞を識別することが可能になります。すべての細胞を可視化するには、画像を画面いっぱいに表示し、レンダービューの設定をcomposite orthogonalおよびinterpolatedに定義します。次に、プロパティを 0.58 gamma、255 saturation point、255 luminance、195 alpha、shading を 1.00 と定義します。RGチャネルの両方を可視として選択し、選択を完了させます。個々の細胞をセグメント化するため、ワークスペースフレーム内でBチャネルをダブルクリックして非表示にします。レッドチャンネルを選択し、ハイしきい値を固定したまま、細胞突起を除外し、かつ大部分の細胞が最小限の重なりでマスクされるまでローしきい値を上げてしきい値処理を行います。最後に、captureコマンドを使用して、マスクされた細胞を含むファイルを保存します。そこで、マスクされた細胞を含む画像をラスターグラフィックエディタで開きます。直接観察のためにグレースケールを反転させ、解像度を300 DPI以上に調整します。RGB画像はTIFファイルとして保存されます。ライブ画像解析の次のステップはミクログリアの解析であるため、面積定量化のためのSATAを特定するために、セグメンテーションおよび形態解析を行います。閾値に基づいた強度測定およびオブジェクトカウントが可能なソフトウェアを使用してください。セグメント化された細胞を含むTIFFファイルを開き、最大解像度を得るためにスプライン再スケーリングを選択し、視認性を高めるためにレッドチャンネルを白黒に設定します。次に、個々の細胞をセグメント化するため、年齢に応じて水平方向の直径を1.4から1.7 millimetersと定義し、画像をキャリブレーションします。次に、レッドチャンネルに強度しきい値を適用します。「Object Count and Account Update」コマンド内にあるしきい値強度関数を開いてください。この関数を使用して、個体を表す関心領域の各しきい値について、二次元パラメータを追跡します。次に、強度ヒストグラムにおいて強度しきい値を定義します。255段階のレベルのうち、下位50～60%を選択し、個々の細胞の最終的なしきい値を調整します。バイナリツールバーのコントロールまたはオブジェクトカタログを使用して、青色のしきい値カラーマスクと灰色の細胞体外周との重なりを視覚的に評価してください。複数の細胞を含む細胞体領域（ROI）を手動で特定します。これらの要素を分離するために、ROIを分けて指定してください。その際、トグルを使用して領域制限を行い、細胞を直接可視化してください。細胞体の面積が50～60 µm²より大きい場合は、マイクログリア細胞を活性化状態として分類します。細胞体がそれより小さい場合は、マイクログリアを非活性化状態として分類します。最後に、細胞体マスクと単一のXY点画像を重ね合わせ、コントラストを50%上げて、各活性化ミクログリア細胞のプロセスを確認し、分枝の複雑さをチェックします。記述したプロトコルを用いて、中心網膜の広範囲にわたるミクログリア細胞を可視化しました。CX3CR1-GFPをヘテロで発現する若齢のDBA/2Jマウスにおいて、高い細胞解像度とライブイメージング、しきい値処理、および形態計測解析を組み合わせることで、個々のGFP陽性細胞の自動セグメンテーションが可能となり、面積に基づいて細胞を判別しました。DBA/2Jマウスは慢性緑内障モデルであり、個々の眼における神経変性の進行速度のばらつきと一致して、検出可能な神経変性が起こる前の段階から、局所的なミクログリア増殖およびミクログリア活性化の進展をモニタリングするために毎月撮像を行いました。この解析により、網膜ミクログリアの活性化およびミクログリア増殖の時間的変化が明らかになりました。また、解析により、個々の網膜内における総ミクログリアおよび活性化ミクログリアの密度の動的な変化が検出されました。ミクログリアの個体群密度は、他の知見と一致して、GFP発現細胞密度の変化とは連動していませんでした。したがって、CSLO解析は早期の疾患進行の指標として利用できる可能性があります。本手順を行う際は、内網膜に局在するGFP陽性ミクログリアの蛍光画像の飽和レベルを慎重に最適化することが重要です。中心網膜のCSLO画像の再現性、および中心網膜全体で検出される一貫した細胞の詳細度は、この開発後のステップに決定的に依存します。このライブイメージングプロトコルは当研究室で適用されており、DBA/2Jマウスおよびその他の慢性網膜変性モデルにおいて、網膜および視神経乳頭のミクログリアにおける早期の変化と、その後の緑内障の進行との潜在的な関連性を検証しています。また、このライブイメージング戦略は、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病など、網膜や視神経の変性を引き起こす他の慢性疾患の早期検出にも寄与する可能性があります。

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典:Bosco, A., 他.In vivo 神経変性中の網膜ミクログリア活性化のダイナミクス:マウス緑内障における共焦点眼鏡イメージングと細胞形態測定。J. Vis. Exp. (2015) このビデオは、緑内障のマウスモデルにおける網膜ミクログリアのin...

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