成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

この手順の全体的な目標は、成体ラットまたはヒト脊髄の傍心室領域から神経幹細胞を単離することです。これは、最初に椎弓切除術によって脊髄を採取することによって達成されます。2番目のステップは、脊髄を横方向に1センチメートルのセグメントに切断し、脊髄の各セグメントから傍心室領域を解剖することです。

次に、ミンチ組織を1ミリメートルの断片に切断し、酵素的に解離します。最後のステップは、不連続な密度勾配による遠心分離により無傷の細胞を分離し、細胞懸濁液をプレート化することです。最終的には、神経球の形成と神経幹細胞の成長は、免疫蛍光顕微鏡を使用して評価できます。

今日は、成体ラット脊髄の傍脳室領域から神経幹細胞を分離する方法を実演します。これらの細胞は、どの外因性因子が系統制限を促進するのか、これらの細胞がさまざまな刺激やストレスにどのように反応するのかなど、神経幹細胞分野の重要な疑問に答えるために使用できます。まず、付属のテキストプロトコルに記載されているように、培養、培地、および解剖バッファーを準備します。

次に、麻酔薬の過剰投与に続いて、ラットの皮膚を滅菌し、大きな解剖ハサミを使用して背側表面を取り除き、脊柱を露出させます。解剖はさみを背側に対して垂直に、横方向に持ちます。後肢の上の脊柱を切断します。

次に、小さなハサミを使用して、脊柱の上にある背筋を吻側方向に縦方向に切断し、露出した抱擁端から始まる棘突起を露出させます。小さな鈍骨切断器具を、脊髄と脊柱の間の空間にある脊柱管の外側面に口腔外に挿入します。ブレードを浅く、コードと平行に置きます。

次に、椎弓板に小さな切り込みを入れ、椎弓を慎重に剥がして脊髄を露出させます。この角度は、下にある脊髄の損傷を防ぎます。吻側の椎弓板を引き続き除去します。

鈍い組織鉗子を使用して胸部および頸髄を露出させるには、脊柱から脊髄をそっと持ち上げ、マイクロハサミで根を切断します コードを解放するには、切除した脊髄を氷冷した滅菌ラット解剖緩衝液が入ったペトリ皿に入れます。氷冷解剖緩衝液で組織をすすぎ、はさみを使用して脊髄を横方向に1センチメートルのセグメントに切断します。組織の各セグメントについて、細い鉗子を使用して片手で組織を保持し、もう一方の手でマイクロハサミを使用して、白質と灰白質の大部分を慎重に取り除き、脊髄の脳室周囲領域のみを残します。

解剖した脳室周囲組織を、氷冷ラット解剖緩衝液を含む10センチメートルの滅菌ペトリ皿に引き込みます。ラット神経幹細胞の単離を開始するには、マイクロハサミを使用して、解剖された心室組織を1立方ミリメートルの断片に細かく刻みます。次に、まずパパイン解離キットのパパインのバイアルに5ミリリットルのアール平衡塩溶液を加えて、酵素解離バッファーを調製します。

バイアルを摂氏37度に10分間置いて、パパインが完全に溶解し、溶液が透明に見えるようにします。次に、解離キットのDNAのバイアルに500マイクロリットルのアール平衡塩溶液を加えます。そして穏やかに混合し、パパインを含むバイアルに250マイクロリットルのDNA溶液を加えて穏やかに混合します。

次に、ひき肉を約0.2gのビンチ組織をバイアルに加え、バイアルを摂氏37度のロッカープラットフォームに45分から1時間置きます。インキュベーション後、10ミリリットルのピペットで混合物をトライレートし、残っている組織片を解離して濁った細胞懸濁液を生成します。細胞懸濁液を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移し、300Gで5分間遠心分離します。

遠心分離中の室温で、2.7ミリリットルのアールバランス塩溶液と300マイクロリットルの再構成アルブミンOVO MOID阻害剤溶液を混合してOVOモイド溶液を調製します。15ミリリットルの円錐管に、楕円形のモイド溶液に予め調製したDNA溶液150マイクロリットルを加えてチューブを反転させて混合し、ペレット化した細胞から上清を捨て、希釈したDNAアルブミン阻害剤混合物に細胞ペレットを直ちに懸濁します。次に、15ミリリットルのチューブに5ミリリットルのアルブミン阻害剤溶液を添加し、5ミリリットルのピペットを使用して、アルブミン阻害剤溶液の上に細胞懸濁液を穏やかかつゆっくりと重ねることにより、不連続な密度勾配を調製します。

サンプルを70 gで室温で6分間遠心分離します。終了したら、上清を廃棄し、添付のテキストプロトコルに記載されているように調製した1ミリリットルのプレウォームラットEFH培地に細胞ペレットを再懸濁します。ヘモサイトメーターで生細胞密度をカウントし、EFHで1マイクロリットルあたり10細胞の密度で細胞をT 25培養フラスコにプレートします。

フラスコを摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートし、球体の凝集を避けるために培養物が1週間邪魔されずに成長するのを待ちます。ここに示されているのは、ラクサルファストブルーで染色されたラット脊髄の横断面、および白質と灰白質の境界を示すためにヘマチンとエオインで染色されたものです。点線のアウトラインは、この領域からこのプロトコルで分離された解剖された残りの脳室周囲組織を示します。

ここに示されているようなニューロスフェアは、高倍率で浮遊培養中に自由に浮遊して成長します。ニューロスフェアから突き出たマイクロスパイクが見られます ニューロスフェアは、ニューロスフェアが解離してマトリゲルコーティングされたウェルに播種されたKI67陽性染色で示されるように増殖します。さらに、それらは主に神経前駆細胞のマーカーである巣を発現します。

この手順に続いて、培養細胞に外因性因子を添加して分化を促進することができます。成体神経幹細胞またはその子孫をさまざまな動物モデルに移植して、再生修復の能力を評価することもできます。このビデオがお役に立てば幸いですし、実験に頑張ってください。