成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

この手順の全体的な目的は、成体ラットまたはヒト脊髄の室傍領域から神経幹細胞を単離することです。まず、椎弓切除術により脊髄を採取します。次に、脊髄を横方向に1 cmずつのセグメントに切断し、各セグメントから室傍領域を解剖して取り出します。

次に、細切した組織を1 mmの大きさに切り分け、酵素的に解離させます。最終ステップとして、不連続密度勾配遠心分離法を用いて生存細胞を分離し、細胞懸濁液を播種します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いてニューロスフェアの形成および神経幹細胞の増殖を評価することができます。

本日は、成体ラット脊髄の室傍心室領域から神経幹細胞を単離する方法について実演します。これらの細胞は、どの外因性因子が系統制限を促進するか、あるいはこれらの細胞がさまざまな刺激やストレスにどのように反応するかなど、神経幹細胞分野における重要な疑問を解決するために利用できます。まず、付属のテキストプロトコルに従って、培養液、培地、および解剖用バッファーを準備してください。

次に、麻酔剤を過量投与した後、ラットの皮膚を滅菌し、大きな解剖用はさみを用いて背側表面を除去し、脊柱を露出させます。解剖用はさみを背側表面に対して垂直かつ横方向に保持します。後肢より上の位置で脊柱を切断します。

次に、小型の鋏を用いて、露出した尾端から始まり、脊柱を覆う背筋を吻側に向かって縦方向に切開し、棘突起を露出させます。脊髄と脊柱の間の空間にある脊柱管の外側面に、小型の鈍的な骨切削器具を口腔外から挿入します。刃先を脊髄に対して浅く、平行に配置してください。

次に、椎弓に小さな切り込みを入れ、注意深く椎弓を剥離して脊髄を露出させます。この角度で操作することで、下層にある脊髄への損傷を防ぐことができます。そのまま吻側に向かって椎弓の除去を続けます。

鈍端組織鉗子を用いて胸髄および頸髄を露出させ、脊髄を脊柱からそっと持ち上げ、マイクロ鋏で神経根を切断します。脊髄を分離するため、切り出した脊髄を氷冷した滅菌済みのラット解剖用バッファーが入ったペトリ皿に入れます。組織を氷冷解剖用バッファーで洗浄し、鋏を用いて脊髄を1 cm間隔で横断的に切断します。各組織セグメントについて、片手の精密鉗子で組織を保持し、もう片方の手のマイクロ鋏を用いて、脊髄の室周領域のみを残し、白質と灰質の大部分を慎重に除去します。

摘出した脳室周囲組織を、氷冷したラット組織解離バッファーを入れた10センチメートルの滅菌ペトリ皿に移します。ラット神経幹細胞の分離を開始するために、マイクロ鋏を用いて、摘出した脳室周囲組織を1立方ミリメートルの大きさに細切します。次に、パパイン解離キットのパパインが入ったバイアルに、Earl's平衡塩溶液を5ミリリットル加えて、酵素解離バッファーを調製します。

バイアルを37°Cで10分間静置し、パパインを完全に溶解させ、溶液を透明にします。次に、解離キット由来のDNAバイアルに500 µLのEarl's平衡塩溶液を加えます。穏やかに混合した後、このDNA溶液250 µLをパパインを含むバイアルに加え、穏やかに混合します。

次に、細切した組織約0.2 gramsをバイアルに加え、バイアルを37 °Cのロッカープラットフォーム上に置き、45分から1時間静置します。インキュベーション後、10 milliliterピペットで混合物をトリチュレーションし、残っている組織片を解離させて濁った細胞懸濁液にします。細胞懸濁液を滅菌済みの15 milliliterコニカルチューブに移し、300 ×gで5分間遠心分離します。

遠心分離中の室温にて、2.7 mLのEarl'sバランス塩溶液と300 µLの再構成済みアルブミンOVO MOID阻害剤溶液を混合し、OVO moid溶液を調製します。15 mLコニカルチューブ内で、あらかじめ調製したDNA溶液150 µLをoval moid溶液に加え、チューブを転倒混和させます。ペレット化した細胞から上清を除去し、直ちに細胞ペレットを希釈したDNAアルブミン阻害剤混合液で再懸濁します。次に、15 mLチューブにアルブミン阻害剤溶液5 mLを加え、不連続密度勾配を作成します。5 mLピペットを用いて、細胞懸濁液をアルブミン阻害剤溶液の上に静かにゆっくりと層形成させます。

試料を室温で70 ×g、6分間遠心分離します。終了後、上清を捨て、付属のテキストプロトコルに従って調製し、予め加温しておいたラットEFH培地1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて生細胞密度を計測し、EFH培地中で10 cells/µLの密度で細胞をT 25培養フラスコに播種します。

フラスコを37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、スフィアの凝集を避けるため、1週間静置して培養します。ここに、Luxol Fast Blue、ならびにヘマトキシリン・エオジンで染色し、白質と灰白質の境界を示したラット脊髄の横断面を示します。点線で囲まれた部分は、本プロトコルにおいてこの領域から単離した、切り出された残存脳室周囲組織を示しています。

ここに示されているようなニューロスフィアは、高倍率で見ると浮遊培養中で自由に浮遊して増殖します。ニューロスフィアからは、微小な突起（マイクロスパイク）が突き出ているのが確認できます。また、ニューロスフィアを分散させ、マトリゲルでコーティングしたウェルに播種したところ、KI 67陽性染色の結果から、ニューロスフィアが増殖していることが示されました。さらに、これらは主に神経前駆細胞のマーカーであるnestinを発現します。

この手順に続き、分化を促進するために外因性因子を培養細胞に添加することがあります。また、成体神経幹細胞またはその子孫細胞をさまざまな動物モデルに移植し、再生修復能を評価することも可能です。このビデオがお役に立ち、皆様の実験が成功することを願っております。