同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

この手順の全体的な目標は、3D生理学的に関連する環境における細胞の移動特性を研究することです。これは、まず細胞を内側のコラーゲンゲルに播種し、次に目的のマトリックス特性を持つ無細胞の外側のコラーゲンゲルに封入することによって達成されます。次に、細胞は外側のゲル内に侵入して移動し、その間に細胞をモニターし、定量的に分析することができます。

最終的に、この同心円状ゲルアッセイは、細胞遊走挙動が細胞外マトリックスの生物物理学的特性によってどのように影響を受けるかを示すために使用されます。トランスファーアッセイやスクラッチアッセイなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、細胞の移動が、構造的および生物物理学的特性が非常に簡単に制御できる生理学的に関連する条約環境で発生することです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、濃縮物の内部ルーターゲルシステムの形成が非常に繊細であるため、非常に重要です。

この実験を成功させるには、適切なゲル界面が非常に重要であり、達成するのが少し難しい場合があります。MD MBA 2 31細胞の培養から開始し、T 25フラスコから80%coの流暢さで収穫する準備ができています。まず、トリプシンはフラスコあたり1ミリリットルの溶液を使用する細胞です。

次に、細胞をペレットとして200Gの力で4分間収集し、スナットを廃棄して細胞を5ミリリットルの培養物に再懸濁します。メディア。次に、ヘモサイトメーターを使用して細胞密度を測定し、ミリリットルあたり1億個の細胞に必要な量を決定します。次に、細胞を200 Gで4分間スピンダウンします。

上清を取り除き、ペレットを必要量の無血清培地に完全に再懸濁します。このサスペンションは、最終的な座席濃度の10倍です。まず、必要なストック溶液をアイスバケツに集めるために、10 XPBS ミルク水と 0.1 モルの水酸化ナトリウムが含まれています。

また、フードの下にいくつかのマイクロ遠心チューブを冷やし、無菌技術を維持し、50マイクロリットルの2.4ミリグラム/ミリリットルのインナーゲル溶液に必要な量のコラーゲンを分注します。次に、測定したコラーゲンに5マイクロリットルの10XPBSをゆっくりと加えます。PBSを追加するときにチューブを回転させますが、泡を作らないようにします。

次に、ベース溶液で混合物のpHを7.4に調整します。通常、5マイクロリットルで十分です。トラブルシューティングガイドは、テキストプロトコルで提供されます。

最後に、無血清培地で容量を最大45マイクロリットルにし、10 x細胞懸濁液用のスペースを残します。まず、5マイクロリットルの10 x cell懸濁液をコラーゲン溶液に加え、気泡を形成せずに細胞を溶液中に完全に再懸濁します。次に、ガラスの底板に予熱し、中央に20マイクロリットルのサスペンションを追加します。

ドーム状の液滴を形成し、気泡が発生した場合は、すぐに破裂させたり、混乱を起こさずに吸い上げたりします。ジェルを正しい方法でキャストすることは、特にコラーゲンのような非常に粘性の高い溶液では、非常に難しい場合があります。気泡の発生をできるだけ避け、重合の準備ができたら溶液を渦巻かせないようにしてください。

次に、ディッシュをインキュベーターに45分間戻し、インキュベーションが終了する15分前に内層を重合させます。氷の上に200マイクロリットルの外側のコラーゲンゲル溶液を準備します。まず、必要量のストックコラーゲンを分量します。

次に、20マイクロリットルの10XPBSをゆっくりと加えます。次に、前と同じようにpHを7.4に調整し、Milli Q水で溶液を最大200マイクロリットルにします。次に、インキュベーターから皿を取り出し、内側のゲルドームの上に180マイクロリットルの外側のゲル溶液を静かに加えます。

これにより、内部溶液が完全に覆われ、ウェルが満たされるはずです。溶液を攪拌したり、内側のゲル溶液に触れたりしないでください。外部溶液を排出する際に気泡が発生した場合は、すぐに破裂させるか、ピペットに吸い戻してください。

もう一つの重要なステップは、適切なゲル界面が得られることを確認することです。このステップの鍵は、外側のゲル溶液を添加することです。インナージェルがまだ認証されていない場合。

ゲル化速度は重合条件によって変化する可能性があり、この条件を事前に最適化することが不可欠です 外側のゲルを重合させて、皿をインキュベーターに45分間戻します。45分後、ゲルはかなり固いはずですが、それでも取り除くことができます 2ミリリットルの温かい媒体を慎重に加えてゲルを完全に沈めます。これにより、2〜3日ごとに新鮮な培地を提供する同心円状のゲル培養が完了します。

数日以内に、細胞は外側のマトリックスに移動し始め、その移動を観察し、蛍光トラッカーで細胞を染色します。2ミリリットルの培地を5マイクロリットルの染料を含む新鮮な培地と交換し、インキュベーション期間後30分間インキュベートし、1ミリリットルのPB S3を使用して1回の洗浄につき2〜3分間培養物を洗浄する。洗った後、皿に通常のメディアを補充します。

次に、環境制御された顕微鏡に皿をセットします。次に、使用量設定を使用して、ゲル界面の隣にある外側のゲル領域をスキャンします。通常、厚さ 100 ミクロンの 647 ミクロン四方のビューで、ZS スタックで 5 ミクロン間隔を使用してスキャンします。

次に、中間領域をスキャンし、最後にゲルの周辺をスキャンします。底面、上面、または側面から50ミクロン以内の領域を除外して、エッジ効果の影響を受けている可能性のある細胞を回避します。収集したデータから細胞の動きを解析するには、まずimasなどのデータ解析ソフトウェアで画像ファイルを開きます。

まず、コマンド surpass を選択し、次にコマンド サーフェスを選択します。これにより、サーフェスを追跡するオプションが表示されます。時間の経過と共に、データセット内の関心領域、つまりデカルト座標と時間枠を選択します。

次に、関心領域から背景を減算します。背景の消去によってセルが失われないようにするには、オブジェクトに収まる最大の球を選択します。次に、シードポイントの直径を選択して接続されたオブジェクトを分割し、すべてのシードポイントの分類に進みます。

次のステップは、サーフェスNowを手動で分類することです。同じオブジェクトを指すシード ポイントをグループ化します。これは、対象領域内のすべての時点間で行います。

最後に、追跡が完了したらオブジェクトを追跡し、オブジェクトトラックを分類してから、スプレッドシートを使用して分析する定量的データセットを出力します。同心円状のゲル培養を数日行った後、細胞が内側の外側ゲル界面を破り、外側ゲルに侵入し始めました。細胞集団は、主に半径方向に外側に広がっています。

さまざまなコラーゲン密度の外側ゲル内の細胞の動きを比較しました。イメージングを8時間にわたって行い、各サンプルから約200の細胞の軌跡を計算しました。最も薄い行列内のセルは、移動距離が最も短かった。

この計算では、放射状に外側に移動する細胞だけでなく、すべての細胞が考慮されました。いずれの場合も、カバーされた合計距離は正味の変位よりも大きかった。予想された持続性は、変位と距離の比率として計算されました。

0.4 の持続性値は、これらの細胞が本質的に弱い方向移動を持っていたことを示唆しています。平均速度の計算では、コラーゲン密度は細胞速度に影響を与えないことが示されました。マトリックスの細孔径とコラーゲン密度は反比例しており、移動速度に逆の効果をもたらしたため、互いに相殺し合った可能性があります。

このビデオを見れば、同心円状のゲルシステムを構築する方法と、3D環境でのこの細胞の移動を研究する方法について十分に理解できるはずです。この手順に従うと、細胞抽出、マイクロアレイ分析など、他の多くのことを行うことができ、移行のさまざまな時点で特定のタンパク質がどれだけ発現するかなどの追加の質問に答えることができます。