Name: 同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学ぶ同心円状ゲルアッセイ法による3D環境での細胞移動解析。コラーゲンゲルを用いて細胞外マトリックスの生物物理特性が移動挙動に与える影響を定量的に評価し、生理学的に関連性の高い環境で細胞動態を研究する。

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著者は批判的な議論のためにW.日とK·ジャンセンに感謝し、シンガポール国立大学でナノバイオメカニクス研究室による支援を認める。 NAKがマリー·キュリーIIFフェローシップによる支援を認めるものです。

1.細胞の回収<ol><li> 37℃、5％CO 2インキュベーターからMD-MBA-231細胞を得る。 0.5％トリプシン-EDTA溶液を用いて組織培養プレートから細胞を剥離。 T25フラスコで培養した細胞のためのトリプシン-EDTA溶液1mlを使用してください。 </li><li> 4分間200×gでの遠心分離により15ミリリットルコニカルチューブ中の細胞をペレット化し、上清を吸引し、そして培養培地の5ミリリットル中に細胞を再懸濁。 </li><li>血球計数器を使用して、ρ、細胞密度をカウントします。 注：細胞播種インナーゲルを調製するために、細胞懸濁液は、後に最終的な細胞播種密度に達するために10倍に希釈される。したがって、10倍濃縮細胞懸濁液が必要とされる。 </li><li> 10×細胞濃度を達成するために必要な媒体の体積を計算する。 <img alt="式1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> 注：最終細胞播種密度を、 最後の C、約2の15; 10 6細胞/ mlのMD-MBA-231細胞に推奨されており、このプロトコルで使用されている。他の播種密度は、他の細胞型のために探索することができる。 </li><li>ペレット細胞1以上の4分間200×gでの遠心分離により15ミリリットルコニカルチューブの時間、上清を吸引除去する。 </li><li>細胞凝集を最小限にするために十分に無血清細胞培養培地の必要量（ステップ1.3で算出したV 培地 ）中で細胞を再懸濁。 注：フェノールレッドを自家蛍光であり、蛍光/反射率画像化を妨害する可能性がある。フェノールレッドを含まない培地の使用は、最高の画像品質を達成すると考えることができる。 </li></ol>コラーゲン溶液の調製<ol><li>原液コラーゲン溶液、10×PBS緩衝液、ミリQ H 2 O、0.1 MのNaOH、及びいくつかの微量遠心管を得る。早期のコラーゲン重合を防止するために氷の上にすべてを保持し、無菌状態を維持する。 </li><li>無菌のガラス - を平衡化する37℃のインキュベーター内に予め加温してボトムディッシュ。 注：このプロトコルのすべてのボリュームは、ウェル12 mmのガラスボトムディッシュに最適化されています。他の皿型が使用される場合、それに応じてボリュームを調節する。 </li><li>コラーゲンストック濃度に基づいて、インナーゲル（溶液I）が2.4 mg / mlのコラーゲン溶液50μlを調製するのに必要とされる必要な容量を計算する。 注意：インナーゲルのための他のコラーゲン濃度を使用することもできる。 </li><li>無菌環境（通常はバイオセーフティーフード）で、ゆっくりと穏やかな旋回と（ステップ2.3で計算）コラーゲン原液の必要量に10×PBS緩衝液の5μlを添加する。気泡の形成を避けるように注意してください。 </li><li>校正されたpHメーターを使用し、0.1M NaOHを用いて7.4に、混合物のpHを調整する。おおよその目安としては、（量がストック濃度とpHによって異なります）7.4に近いpHをもたらすために約5μLを使用しています。 注：ボリュームがこのに関与していることに注意してくださいステップは、標準pHメーターを使用するには小さすぎる。以下のトリックのいずれかを使用します。 <ol><li>複数のサンプルのためのコラーゲン溶液を準備します。標準pHメーターを使用してバルクのpHを調整し、サンプル全体でコラーゲン溶液を配布。 </li><li>あるいは、より大きな体積のコラーゲン溶液のpHを調整する（すなわち、標準的pH計の使用を可能にするボリューム）。 NaOHの量は、最終的なpHにpHを必要に応じて注意してください。ボリュームを縮小し、実験のためのNaOHの適切な量を使用しています。リトマス紙を用いてpH値を確認してください。 </li><li>そうでなければ、より正確に少量のpHを調節するために、マイクロpH電極を使用する。 </li></ol></li><li> H 2 Oを使用して45μLの容積に解決策を持参早期のコラーゲン重合を防止するために氷の上のすべての手順を実行します。 </li></ol>同心円ジェル文化の3の形成<ol><li>予め温めておいたガラスボトムディッシュを取る目から（ステップ2.2を参照してください）Eインキュベーター。 </li><li>溶液を十分I.再懸濁するために（ステップ1.5で調製）10倍濃縮細胞懸濁液の5μlを添加する。気泡の形成を避けるように注意してください。混合物は現在、50μlの容量を有し、（ 最終 = 2×10 6細胞/ mlのc）の最終コラーゲン濃度（2.4 mg / ml）で細胞密度を含有する。 </li><li>それはドーム状の液滴（ 図1A）を形成するように、私は、ウェルの中央にゆっくりと細胞含有溶液20μlを追加します。このステップでの気泡形成を避けるように注意してください。バブルフォーム場合は、慎重にしかしすぐにそれを破裂またはピペットチップを使用してそれを吸い出すするかしてみてください。静かに内側のゲルを45分間重合させるために戻ってインキュベーターで料理を置く。 </li><li> （アウター、無細胞コラーゲンゲル用）は、溶液Oこのインキュベーション工程の終了前に約15分を準備します。 注意：アウターゲル状態はコラーゲン濃度および重合のpHの条件に変更することができる異なる微細構造10とのネットワークを得る。 7.4のpHで重合を4.0mg / mlのコラーゲンゲル - このプロトコルでは、1.5に焦点を当てる。 <ol><li>コラーゲンストック濃度に基づいて、最終濃度のコラーゲン溶液のO200μlの準備に必要な必要量を計算する。 </li></ol></li><li>ゆっくりと穏やかな旋回と（ステップ3.4で計算）コラーゲン原液の必要量に10×PBS緩衝液20μlを追加します。キャリブレーションpHメーターの使用と、0.1M NaOHを用いて、最終的なpHに混合物のpHを調整します。 pH調整に関する2.5のステップに注意してご覧ください。 </li><li> H 2 Oを使用して200μlの最終容量に解決策を持参早期のコラーゲン重合を防止するために氷の上のすべての手順を実行します。 </li><li>内側のゲル（ステップ3.3を参照）の45分の重合後にインキュベーターから一品を取る。溶液が完全に内部を覆うように静かに、内側のゲルの上にソリューションOの180μlを添加するゲルとよく（ 図1B）をいっぱいに。 <ol><li>アウターゲル中の不均一な繊維配向につながる可能なソリューションを、攪拌せずに慎重にこの手順を実行します。ピペットチップで内側のゲルに触れないように注意してください、と気泡やエアポケットの形成を避けるため。バブルフォーム場合は、慎重にしかしすぐにそれを破裂またはピペットチップを使用してそれを吸い出すするかしてみてください。ゆっくりと外側のゲル重合さをできるように戻ってインキュベーターで料理を置く。 </li></ol></li><li>重合の45分後にインキュベーターから一品を取る。大体扱う場合には、それはまだ底面から切り離すことができますがゲルはすでにかなり、この時点で固化されるべきである。 <ol><li>静かに皿（ 図1C）に温め、細胞培養培地2mlを注ぐ。ゲルが完全に中に沈めていることを確認します。文化の期間を通じて3日間 - ごとに2培地をリフレッシュします。 </li></ol></li></ol> 4。生細胞イメージング<ol><li>長期生細胞イメージング機能を備えた倒立共焦点顕微鏡を用いて撮像を行う。温度（37℃）でインキュベーションチャンバーを内蔵し、CO 2（5％）の制御が含まれる。顕微鏡の電源を入れ、実験を開始する前に、ステージを少なくとも1時間のウォームアップ。 注：長作動距離対物レンズで使用する3次元ゲル内の細胞の観察および局在化を最適化する。 </li><li> 3Dシステム内のセルの正確な局在化を可能にするために30分間蛍光細胞追跡色素を5μlを含有する培地中でゲルをインキュベートする。その後、1×PBSで3回洗浄して未結合の色素を除去。その後、シャーレに細胞培養培地を加える。 </li><li>インキュベーターから料理を取り、顕微鏡ステージ（ 図1D）の上に置きます。 注：ライブセルイメージングは​​、右アウターゲルの重合後、原則的に開始することができます。しかしこの時点では、細胞のinの内側のゲルはまだ広がっていない。アウターゲルに侵入した最初の細胞の移動を調べるために、生細胞イメージングは​​、培養開始後24時間（細胞型に応じて）を開始することができます。おおよその目安としては、約12 - 14日間の培養は、外側ゲルを入力するように内側のゲル中の細胞のほとんどのために必要とされる。 </li><li>インナーゲルを囲む外側のゲル中の地域で見る（VOVの）のボリュームを選択します。インキュベーションの24時間後に、細胞集団が広がっているので、内側と外側のゲルとの間の界面を越えて、外側のゲルに侵入し始めた。 <ol><li> VOVのために、すぐに次の外側ゲル7の郊外に近いゲル界面、中間領域、および領域へのゲル領域を含む。可能なエッジ効果を回避するために、近い底面及び側面からだけでなく、ゲルの上部からは50μm以上の領域を除外する。各VOVは、一般的にXで（647×647×100μmの3を測定し、のz -stack5μmの間隔で、それぞれ、y、およびz方向）。 </li></ol></li><li>確実に撮影モード、チャンネル/フィルター、露光時間、及び画像の解像度が正しく選択されている。コラーゲンネットワークのラベルフリーイメージングのために、タイムラプス生細胞イメージングの間に同時に共焦点反射顕微鏡を使用しています。 </li><li> 、サンプル画像を取り、強度ヒストグラムをプロットし、十分な信号を観測し、ヒストグラムがゼロと最大強度の間にあることを保証することにより、飽和を避けるために、ゲインおよびオフセットを調整します。実験期間を通じてこれ以上、これらの設定を変更しないでください。 </li><li> 8時間（または必要に応じてより長い）のために10分、時間間隔、Δtと共に、選択したVOV年代のタイムラプス画像を撮影する。 </li></ol> 5.細胞追跡およびデータ分析<ol><li> appropriaを使用してZ -stack画像から定量的な画像後処理を実施<html>テ画像処理ソフトウェア。 <ol><li>セグメントタイムラプス画像は、自動的に（x、y、zの、t）内の3Dセル位置を選択する。 </li><li>フレームごとに、手動でローカライズ精度を確認し、細胞のために間違われている可能性が細胞の破片と細胞の突起に起因する偽陽性を削除する。分析から増殖細胞を取り出し、個別のオブジェクトに重複または接続されたセルを分割する。 </li></ol></li><li>時系列的に各セルの位置を連結することにより、前工程で得られた細胞の座標（x、y、z、t）から3Dタイムラプス細胞トラックを生成する。 </li><li>しきい値トラック長（通常は20分）より短いトラックを除去することによって、ランダムとシステムノイズを排除します。 </li><li>必要に応じて、トラックからの全体の正味の変位を減算することにより、サンプルのドリフトを修正してください。 </li><li>セルの変位を計算し、ジル/ ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;幅=&quot; 80 &quot;/&gt;、および細胞移動距離、 <img alt="式3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> 、観察細胞の軌跡から、ここで一度にセルの3次元位置を表すベクトルであり、時間点の総数である。 <ol><li> Δtはフレーム間の時間間隔であるS = D /（nは•Δtは）、などの細胞の速度を計算する。 P =Δdを/ Dを使用して、細胞移動の方向性（または持続性）を計算します。持続性のこの単純な尺度は、P = 0のために正味の変位がゼロであり、P = 1のための軌道が直線方向線であることを意味する。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

このプロトコルでは、in vivoで遭遇したECMにトポロジー的に類似したマトリックス環境における細胞の3D遊走挙動を研究するためのin vitroアッセイについて説明します。このアッセイには、現在利用可能な他の方法と比較して、3つの主な強みがあります。まず、このアッセイにより、集団レベルと個々の細胞レベルの両方で細胞遊走メカニズムを同時に調べることができます。これにより、これまで主に2Dアッセイ14に限定されてきた集団細胞遊走13を研究すると同時に、集団内の個々の細胞の挙動を観察する可能性が開かれます。グループまたはクラスターで自然に移動しない細胞の場合、アッセイは、多様な局所微小環境を持つ多数の細胞から移動特性を詳細に分析する方法を提供し、移動効率と方向性の持続性の生物物理学的起源に関する重要な洞察を提供することができます7,15。
第二に、内側と外側のゲルのゲル条件を変更することにより、3D細胞の移動挙動に対するマトリックス力学と微細構造の影響を直接研究できます10...

細胞の遊走は、胚発生、止血、および免疫応答ならびに、血管疾患、炎症、および癌の1のような病理学的プロセスにおける様々な生理学的応答において重要な役割を果たしている。細胞遊走の基礎となる生化学的および生物物理学的な因子を解剖する細胞機能の基本的な原理を理解するだけでなく、そのような組織工学、抗転移および抗炎症薬の開発のように、様々な生物医学的用途を前進させるだけではなく、したがって基本的に重要である。 in vivoでの観察が技術的に困難であるため、多くの努力は、細胞遊走のインビトロ要約が注目されている。 細胞遊走を研究するためのインビトロ法に大きく、最も顕著なのは、2次元（2D）表面上にアッセイのために傷を設計またはアッセイ2創傷治癒されている。このようなアッセイは、簡単な実験装置を提供し、容易なの生細胞イメージング、および細胞遊走の基礎となる様々な生化学的機構に有用な洞察を提供する。しかし、これらのアッセイは、in vivoの移行で理解する上での重要な側面である細胞外マトリックス（ECM）アーキテクチャと改造、を考慮していない。最近、ますます三次元培養モデルは、多くの場合、コラーゲンベースのマトリックス3において、優れたin vivoでの状況に似ているプラットフォームを提供することが理解されている。実際に、細胞が環境4の異なる次元に特に起因する2次元表面上のものとは異なる遊走動態を示す。また、マトリックスの生物物理学的および機械的特性が敏感に腫瘍細胞の浸潤6との関連を含めて、細胞遊走5に影響を与える。 ここでは、製造条件を容易に変更することができる生物物理学的特性を有するECM内の3D細胞遊走挙動を研究するための方法を提示する。細胞である「内部ゲル」に播種しに逃げ込むと、最初は無細胞「アウターゲル」を侵略するために許可されています。この方法は、密接にセル7 mechanosensingにリンクされている外側のゲル、無細胞領域に遊走する細胞のの存在を認識する能力、及び性向に依存する。本研究では、高浸潤性乳癌細胞、MD-MBA-231に侵略されたECMコラーゲンネットワークを採用する。内部と外部の両方のゲルの機械的性質と微細構造8をチューニングし、生理学的に関連する条件を達成するために9を特徴付けることができる。セルトラックの再構築及び分析は、集団レベルおよび個々の細胞レベルの両方で、時空間移行挙動の詳細な定量的な検査を可能にする。重要なことは、同心円状のゲルシステムのセットアップは、このように重要な洞察を提供し、特に癌細胞に侵入、細胞の移行が直面している生体内組織トポロジを模倣細胞遊走および転移の物理的なメカニズム。

<table><tbody><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>モデル:371、S/No 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコンA1R</td><td></td><td>インキュベーターチャンバーを装備した倒立共焦点レーザー走査顕微鏡</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルスメディウム(DMEM)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底ディッシュ</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>直径35mmディッシュと直径12mmガラス底ウェル</td></tr>血<tr><td>球計算盤</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプロセッサpH計</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>NutragenCollagen</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>#5010-D</td><td>酸可溶化ウシコラーゲンI型(ストックpH~2)</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH メーター</td><td>ザルトリウス</td><td>S/No 29153352</td><td>ベーシック pH メーター PB-11</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

同心円状のゲルシステムは、3d細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

遊走する細胞の能力は、腫瘍および癌転移に胚発生及び創傷治癒から一生を通じて細胞機能のさまざまな重要である。熱心な研究の努力にもかかわらず、細胞遊走の基本的な生化学的および生物物理学的な原理は、まだ完全には特に、生理学的に関連する3次元（3D）の微小環境において、理解されていない。ここでは、三次元細胞遊走挙動の定量的検査を可能にするように設計されたインビトロアッセイを記載する。この方法は、以前に占有されていない細胞外マトリックス（ECM）の中に移動する細胞のmechanosensing能力や傾向を利用する。我々は、モデル系としてコラーゲンゲルにおける高浸潤性乳癌細胞の浸潤、MDA-MB-231を使用する。培養の数週間にわたる細胞集団の広がりと個々の細胞の遊走ダイナミクス生細胞イメージングを用いてモニターし、時空間的に分解されたデータを抽出するために分析することができる。さらに、したがって、この方法は、細胞遊走に微小環境における生物物理学的因子の役割を調査するため、シンプルでありながら強力な方法を提供し、多様な細胞外マトリックスのために容易に適応可能である。

ここに提示同心ゲルアッセイは高度に浸潤性乳癌細胞を用いて実施した、MDA-MB-231、2.4 mg / mlの内側のコラーゲンゲルと、一例として= 2×10 6細胞/ mlの細胞播種密度、を有する。 図2に示すように、典型的には培養の数日後に、細胞を、内外ゲル界面に違反し、外側ゲルに侵入し始めた。細胞集団は、主に半径方向外側に広がる。 外側のゲルの重合条件は、細胞遊走特性にマトリックスの密度および機械的特性の役割を研究するために改変することができる。 図3は 、1.5 mg / mlで、2.4 mg / mlの外ゲル中の個々の細胞の動きを示していおよび4.0 mg / mlのコラーゲンは、pH7.4で重合した。共焦点タイムラプス画像は、8時間の内側と外側のゲルとの境界、3つの異なるコラーゲンconcenのセルの変位で得たtrationsは白矢印で示されている。細胞播種密度及び増殖速度に依存して、〜200の個々のセルの軌道は、一般的に抽出することができ、各試料で分析した。 <p cla...

機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

この手順の全体的な目的は、生理学的に適切な3D環境における細胞の遊走特性を研究することです。まず、内側のコラーゲンゲルに細胞を播種し、次に所望のマトリックス特性を持つ細胞不含の外側コラーゲンゲルでこれを包囲することで達成されます。その後、細胞を外側のゲル内で浸潤および遊走させ、その過程をモニタリングし、定量的に分析します。最終的に、この同心円状ゲルアッセイは、細胞の遊走挙動が細胞外マトリックスの生物物理学的特性によってどのように影響を受けるかを示すために用いられます。トランスファーアッセイやスクラッチアッセイなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、細胞の遊走が、構造的および生物物理学的特性を非常に容易に制御できる、生理学的に適切な 3D 環境で行われる点にあります。同心円状の内部ルーターゲルシステムの構築は非常に繊細な操作であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。本実験を成功させるには、適切なゲルの界面を形成することが非常に重要ですが、これを達成するのは時に困難な場合があります。まず、80%コンフルエントに達し、T 25フラスコから回収可能なMD MBA 2 31細胞の培養液を用意します。次に、フラスコ1本につき1 mLの溶液を用いて細胞をトリプシン処理します。次に、200 Gで4分間遠心分離して細胞をペレットとして回収し、上清を捨てて、5 mLの培養液で細胞を再懸濁させます。続いて、血球計数器を用いて細胞密度を測定し、1 mLあたり1億個の細胞にするために必要な液量を決定します。その後、細胞を200 Gで4分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを必要量の無血清培養液で十分に再懸濁します。この懸濁液は、最終的な播種濃度の10倍の濃度になります。まず、10 XPBS、超純水、および0.1 M 水酸化ナトリウムを含む必要なストック溶液を氷上バケットに準備します。また、フード内で無菌操作を維持しながら、いくつかのマイクロ遠心チューブを冷却しておき、2.4 mg/mLの内部ゲル溶液50 µL分に相当する量のコラーゲンを分注します。次に、計量したコラーゲンに10 XPBSを5 µLゆっくりと加えます。PBSを加える際にチューブを軽く回して混ぜ合わせますが、気泡が入らないように注意してください。次に、塩基溶液を用いて混合液のpHを7.4に調整します。通常、5 µLで十分です。トラブルシューティングガイドはテキストプロトコルに記載されています。最後に、10倍濃縮細胞懸濁液を加えるための余裕を残しつつ、無血清培養基を用いて液量を45 µLまで調整します。まず、10倍濃縮細胞懸濁液を5 µLコラーゲン溶液に加え、気泡が入らないように細胞を溶液中で十分に再懸濁させます。次に、あらかじめ温めておいたガラスボトムプレートの中央に、この懸濁液を20 µL添加します。ドーム状の液滴を形成させ、もし気泡が生じた場合は速やかに除去するか、周囲を汚さないように吸引してください。ゲルのキャスティングを正しく行うことは、特にコラーゲンのように粘度の高い溶液では非常に困難な場合があります。可能な限り気泡の発生を避け、重合準備が整った後は溶液をかき混ぜないでください。撹拌すると、人工的な繊維配向が生じる可能性があります。次に、ディッシュをインキュベーターに戻し、内層が重合するまで45分間静置します。なお、インキュベーション終了の15分前に次の準備を行います。氷上で200 µLの外層用コラーゲンゲル溶液を調製します。まず、必要な量のコラーゲンストック溶液を分注します。次に、緩やかに撹拌しながら10 XPBSを20 µLゆっくりと加えます。その後、前述と同様にpHを7.4に調整し、Milli Q水を用いて溶液を200 µLまでにします。ここでディッシュをインキュベーターから取り出し、内層ゲルのドームの上に外層ゲル溶液180 µLを静かに加えます。これにより、内部溶液が完全に覆われ、ウェルが満たされるはずです。溶液をかき混ぜず、内部のゲル溶液に触れないようにしてください。外部溶液を注入する際に気泡が生じた場合は、速やかに破裂させるか、ピペットで吸い戻してください。もう一つの重要なステップは、適切なゲルの界面が形成されていることを確認することです。このステップの鍵となるのは、外側ゲルの溶液を添加することです。これは、内側ゲルの凝固が完了する前に行います。ゲルの凝固速度は重合条件によって変動するため、あらかじめこの条件を最適化しておくことが不可欠です。外側のゲルを重合させるため、ディッシュをインキュベーターに戻し、45分間静置します。45分後、ゲルは十分に凝固しているはずですが、まだ慎重に動かせる状態です。2 mLの温かい培地を加え、ゲルが完全に浸るようにします。これで同心円状ゲル培養の準備が完了します。2〜3日ごとに新鮮な培地を供給してください。数日以内に、細胞が外側のマトリックスへと遊走し始めます。遊走を観察するために、蛍光トラッカーで細胞を染色します。2 mLの培地を、5 µLの染料を含む新鮮な培地に交換し、30分間インキュベートします。インキュベーション後、1 mLのPBSを用いて3回洗浄し、1回あたり2〜3分間洗います。洗浄後、ディッシュに通常の培地を補充します。次に、ディッシュを環境制御顕微鏡にセットします。次に、設定した体積を用いて、ゲル界面に隣接する外側のゲル領域をスキャンします。通常は、Zスタックの間隔を5 µmとして、厚さ100 µm、647 µm四方の視野でスキャンします。次に中間領域をスキャンし、最後にゲルの外縁部をスキャンします。エッジエフェクトの影響を受けている可能性のある細胞を避けるため、底部、上部、または側面から50 µm以内の領域は除外してください。収集したデータから細胞の移動を解析するには、まず imas などのデータ解析ソフトウェアで画像ファイルを開きます。まず、「surpass」コマンドを選択し、次に「surface」コマンドを選択します。これにより、サーフェスのトラッキングオプションが表示されます。その後、データセット内で、デカルト座標およびタイムフレームを含む関心領域を選択します。次に、関心領域から背景を減算します。背景除去によって細胞が消失することを避けるため、オブジェクトに適合する最大の球を選択してください。続いて、シードポイントの直径を選択して連結したオブジェクトを分割し、すべてのシードポイントの分類を行ってください。次のステップは、手動で表面を分類することです。同じオブジェクトを指しているシードポイントをグループ化します。関心領域内のすべてのタイムポイントでこの操作を行ってください。最後に、トラッキングの完了後にオブジェクトを追跡し、オブジェクトの軌跡を分類して、定量データセットを出力し、スプレッドシートを用いて分析します。同心円状のゲル培養を数日間行った後、細胞は内側ゲルと外側ゲルの界面を突破し、外側ゲルへと浸潤し始めました。細胞集団は、主に放射状に外側へ広がりました。さまざまなコラーゲン密度の外層ゲルにおける細胞の移動を比較しました。8時間にわたってイメージングを行い、各サンプルから約200本の細胞軌跡を算出しました。最も薄いマトリックス内の細胞が、移動距離が最も短い結果となりました。この計算では、放射状に外側へ遊走した細胞だけでなく、すべての細胞を考慮しました。いずれの場合においても、総移動距離は正味の変位量よりも大きくなりました。期待された通り、持続性は変位量と移動距離の比として算出されました。持続性の値が0.4であることは、これらの細胞が本質的に弱い方向性遊走能を有していたことを示唆しています。平均速度の算出から、コラーゲン密度が細胞速度に影響を与えないことが示されました。逆相関の関係にあるマトリックスの孔径とコラーゲン密度が、遊走速度に対して相反する影響を及ぼし、その結果、互いに相殺し合った可能性があります。このビデオを視聴することで、同心円状ゲルシステムの構築方法と、3D環境における細胞遊走の研究方法について十分に理解できるはずです。この手順に従えば、細胞抽出やマイクロアレイ解析など、多くの他の操作を行うことができ、遊走中の異なる時点において特定のタンパク質がどの程度発現しているかといった追加の疑問に対する答えを導き出すことができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

このプロトコルの目的は、三次元フィブリン マトリックス内の細胞の移動に及ぼすプロおよび反 migratory...

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

ここでは、粒状ハイドロゲルの界面内および界面への3D細胞遊走を定量的に評価するためのプロトコールを紹介します。...

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

学ぶ同心円状ゲルアッセイ法による3D環境での細胞移動解析。コラーゲンゲルを用いて細胞外マトリックスの生物物理特性が移動挙動に与える影響を定量的に評価し、生理学的に関連性の高い環境で細胞動態を研究する。

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

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