メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

本実験の全体的な目的は、細胞のメカノバイオロジーにおける機械的歪みの役割を、ほぼリアルタイムで観察することです。まず、細胞を培養し伸展させるための柔軟なメンブレンを備えたシステムを構築します。次に、メンブレンを伸展させ、モーターカウントとメンブレン歪みのキャリブレーションを行います。

次に、マウス肺上皮細胞を伸展させ、核をイメージングします。膜の歪みが細胞に伝達されることを示すため、伸展装置をAFMに組み込み、ナノインデンテーション法を用いて伸展前後の個々の細胞の剛性を測定しました。その結果、負荷された伸展によって細胞に直接的な損傷が生じていることが示されました。

また、蛍光イメージングに基づき、ストレッチに伴って活性酸素種の産生が増加することが示されています。本手法は、機械的換気によって上皮細胞が損傷を受けるか否かなど、肺の機械生物学分野における重要な疑問に答えることができます。本手法は肺細胞の機械生物学に知見を提供できるほか、肝臓や成長板のスライスなどの他の軟組織にも適用可能です。

一般的に、原子間力顕微鏡などの本実験で使用される非定型的なツールの組み合わせにより、この手法に不慣れな方は習得に苦労することがあります。まず、付属のテキストプロトコルに従い、細胞培養用に改変されたコラーゲンコーティングPDMSメンブレンを準備します。次に、滅菌済みの柔軟なコラーゲンコーティングメンブレン上に、マウス肺上皮細胞を1ウェルあたり2.5 million cellsの密度で播種します。

細胞を37°C、5%CO2条件下で2日間インキュベートし、コンフルエントになるまで培養します。次に、プリテンション（事前張力）が不要な場合は、コンストラクトの中心から20.5 mmの位置で、1.5 mmのバイオプシーパンチを用いて6つのクランプタブそれぞれに2つの穴を開けます。その後、細胞培養培地を除去します。

メカニカルアクチュエータがゼロ歪みの位置にあることを確認し、パンチ穴がピンおよびクランプと一致するように、ストレッチャー上にメンブレンを配置します。上部クランプを取り付け、その後、異なる側を交互に、ネジを1本ずつ締め付けます。デバイスを顕微鏡ステージに置く前に、細胞培養液を1 mL加えます。

デバイスを光路の中心に合わせます。次に、デバイスをステージに固定します。目的の入力ブロックにある顕微鏡のステージコントローラーを用いて、メカニカルデバイスの面内位置および垂直位置を調整し、膜に焦点を合わせます。

適用したい歪みレベルに対応するモーターカウント値を入力します。次に、伸展前後で同じ視野を観察するため（伸展によって顕微鏡対物レンズに対して視野がずれる可能性があり、伸展中に顕微鏡ステージの調整が必要になる場合があるため）、速度入力ブロックの値を10 RPM以下に設定します。すべての設定が完了したら、「go」をクリックします。

まず、原子間力顕微鏡の調整を行います。AFMヘッドをZ方向に最大高さまで上げます。次に、脚にエクステンダーを取り付け、AFMカンチレバーが試料に接触する平面を高くします。

次に、AFMスキャナープレートと目的の対物レンズを顕微鏡から取り外します。対物レンズにスペーサーを追加し、再び顕微鏡に取り付けます。その後、スキャナープレートをAFMに元通りに取り付けます。スペーサーの高さは、対物レンズや特定のAFMの設定によって異なりますが、光学イメージングを行う場合は、観察面がZ方向にシフトするため、スペーサーの使用が必須となります。

次に、AFMソフトウェア、光学顕微鏡ソフトウェア、および蛍光測定用光源を含むすべての必要な光源を起動します。生細胞の弾性率を測定するため、ばね定数が200 pN/nm以下のカンチレバービームを備えたチップをAFMに装着します。続いてレーザーの光軸調整を行い、デバイスにガラスカバースリップを装着して、メーカーの推奨に従ってカンチレバーのばね定数を校正します。膜をストレッチデバイスに装着する直前に、壁の高さを約1 mmにカットします。

これにより、メンブレン壁とロードセルとの間で発生する干渉が軽減されます。次に、細胞培養液を除去し、メンブレンを機械装置に取り付けます。ソフトウェアを使用して、アダプターを装着した機械装置をスキャナーに配置します。

ナノインデンテーションを行う前に、メンブレンを目的の引張ひずみレベルまで伸長させます。細胞を水和状態に保つため、培地を 0.5 mL 以下添加しますが、FMスキャナーや顕微鏡を損傷させる可能性があるため、液漏れしないよう注意してください。その後、カンチレバービームをメンブレンに接触させます。

使用するAFM装置のプロトコルに従い、関心領域をスキャンします。メンブレン上に播種した細胞に20%の歪みを加えた際、細胞はここに示す通り20%変位しました。活性酸素種の産生に対する細胞の影響は、付属のテキストプロトコルに記載されている通り、累積的ミトコンドリアスーパーオキシドセンサーを用いて気管支上皮細胞で測定しました。機械的伸展がない場合、17%の単一伸展を加えて維持しても、60分間でROS産生に有意な増加は見られませんでした。

原子間力顕微鏡にメカニカルストレッチャーを組み込んだことで、ミトコンドリアROSの増加がさらに60分間持続しました。10%の引張ひずみを加える前後のマウス肺上皮細胞の弾性率マップを、ここに概説する領域から取得しました。40×40 µmの領域にわたって300本の個別の強制変位曲線を記録したところ、ひずみの適用に伴い、高弾性率領域の局在が変化することが示されました。

習熟すれば、細胞ストレッチングは15分で完了できます。一方、FMナノインデンテーションを適切に行うには2時間かかる場合があります。本手順を実施する際は、データ報告前の撹拌や室温空気にさらされる時間の延長が結果に悪影響を及ぼす可能性があるため、細胞を慎重かつ迅速に取り扱うことが重要です。FMの操作は非常に困難であることに留意してください。

本手順の実施中は、すべての液体をスキャナーから遠ざけるなどの注意を払う必要があります。