メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング
2015年8月19日
新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。
次の実験の全体的な目標は、細胞メカノバイオロジーに対する機械的ひずみの役割をほぼリアルタイムで観察することです。これは、まず、細胞を増殖させ伸ばすための柔軟な膜を持つシステムを構築することによって達成されます。2番目のステップとして、メンブレンを伸ばして、メンブレンひずみでモーターカウントを校正します。
次に、マウスの肺上皮細胞を伸ばし、核をイメージングします。膜ひずみが細胞に伝達されることを示すために、ストレッチャーをナノインデンテーション用のA FMに組み込み、ストレッチ前後の個々の細胞の剛性を測定します。結果は、適用されたストレッチによる細胞への直接的な損傷を示しています。
また、蛍光イメージングに基づくと、活性酸素種の産生は伸張とともに増加することが示されています。この方法は、上皮細胞が人工呼吸器で損傷を受ける可能性があるかどうかなど、肺の機械生物学分野の重要な質問に答えることができます。この方法は、肺細胞、機械生物学に関する洞察を提供するだけでなく、肝臓や成長板スライスなどの他の軟組織にも適用できます。
一般に、この方法に不慣れな個人は、原子間力顕微鏡などのこれらの実験で使用されるツールの型破りな組み合わせのために苦労するでしょう。まず、付属のテキストプロトコールに記載されているように、細胞培養で使用するために修飾したコラーゲンコーティングPDMSメンブレンを調製します。次に、マウス肺上皮細胞をウェルあたり250万個の細胞で、無菌の柔軟なコラーゲンコーティング膜に播種します。
細胞がコンフルエントに達するまで、細胞を摂氏37度および5%CO2で2日間インキュベートします。次に、1.5ミリメートルの生検パンチを使用して、プリテンションが不要な場合は、コンストラクトの中心から20.5ミリメートルの6つのクランプタブのそれぞれに2つの穴を開けます。そして、細胞培養培地を取り出します。
機械式アクチュエータがゼロひずみ位置にあることを確認し、パンチ穴がピンとクランプと揃うようにメンブレンをストレッチャーに配置します。トップクランプを所定の位置に置き、ネジを一度に1つずつ、異なる側面を交互に締めます。デバイスを顕微鏡ステージに置く前に、1ミリリットルの細胞培養培地を添加します。
デバイスを光路の中央に配置します。次に、デバイスをステージに固定します。目的地入力ブロックの顕微鏡のステージコントローラーを使用して、機械装置の平面内位置と垂直位置を調整して、膜に焦点を合わせます。
適用する目的のひずみレベルに対応するモーターカウント値を入力します。次に、Velocity Input ブロックの値を 10 RPM 以下に設定して、顕微鏡の対物レンズに対して磁場がシフトする可能性があるため、伸張の前後で同じ視野を観察するため、伸張中に顕微鏡のステージを調整する必要がある場合があります。すべての設定が完了したら、[実行]をクリックします。
原子間力顕微鏡の調整から始めます。a FMヘッドの高さをZ方向の最大位置まで上げます。次に、脚にエクステンダーを取り付けて、FMカンチレバーがサンプルに接触する平面を持ち上げます。
次に、A FMスキャナープレートと目的の対物レンズを顕微鏡から取り外します。対物レンズにスペーサーを追加し、顕微鏡に取り付け直します。次に、スキャナープレートをAFMMに戻します。スペーサーの高さは、対物レンズや特定のFM設定によって異なりますが、光学イメージングが必要な場合は、観測計画がZ方向にシフトするため、スペーサーを使用する必要があります。
次に、A FMソフトウェア、光学顕微鏡ソフトウェア、および蛍光測定用の光源を含むすべての必要な光源を起動します。A FMで生細胞の弾性率を測定するために、ナノメートルあたり200ピコニュートン以下の剛性を持つカンチレバービームを備えたチップをマウントします。次に、レーザーの位置を合わせ、次にガラスカバースリップをデバイスに取り付け、それを使用してメーカーの提案に従ってカンチレバーの剛性を校正します。メンブレンを延伸装置に取り付ける直前に、壁を高さ約1ミリメートルに切ります。
これにより、メンブレン壁とロードセルとの間に生じる干渉が減少します。次に、細胞培養培地を取り出し、メンブレンを機械装置に取り付けます。ソフトウェアを使用して、アダプター付きの機械装置をスキャナーに配置します。
ナノインデンテーションの前に、メンブレンを所望の引張ひずみレベルまで引き伸ばします。細胞に0.5ミリリットル以下の培地を添加して水分を補給しますが、FMスキャナーや顕微鏡を損傷する可能性のあるこぼれないように注意してください。次に、カンチレバービームをメンブレンにかみ合わせます。
特定のAFMデバイスのプロトコルに従って、関心のある領域をスキャンします。膜上に播種した細胞に20%のひずみを適用したとき、細胞はここに示されているように20%変位し、活性酸素種の産生に対する細胞の影響を、添付のテキストプロトコルに記載されているように、累積ミトコンドリアスーパーオキシドセンサーを使用して気管支上皮細胞で測定した。機械的なストレッチがない場合、17%のストレッチを1回適用して維持した場合、ROSの生成は60分間で大幅に増加しませんでした。
ミトコンドリアのROSが増加し、これは機械式ストレッチャーを原子間力顕微鏡に組み込むことでさらに60分間持続しました。弾性率、10%引張ひずみ前後のマウス肺上皮細胞のマップを、ここで概説した領域から取得しました。40 x 40 マイクロメートルの領域にわたって 300 の個別の強制変形曲線が記録され、ひずみの適用による高弾性領域の局在化の変化が示されました。
一度習得すれば、細胞のストレッチは15分で完了します。FMナノインデンテーションは、この手順を試行する際に適切に実行するために2時間かかる場合がありますが、データが報告される前に、結果が攪拌や長時間の室内空気曝露によって悪影響を受ける可能性があるため、細胞を慎重かつ迅速に取り扱うことを覚えておくことが重要です。FMでの作業は非常に難しい場合があることを忘れないでください。
この手順を実行するときは、すべての液体をスキャナーから遠ざけるなどの予防措置を講じる必要があります。
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概要
この研究は、生細胞の機械的歪み応答をリアルタイムで観察することを可能にする新しいイメージングプロトコルを提示します。カスタムモーター駆動式機械アクチュエータを用いて、システムは最大20%の歪みを適用しながら、共焦点または原子間力顕微鏡を用いたほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- メカノバイオロジー
- 細胞イメージング
- 生細胞力学
背景
- メカノバイオロジーにおいて、細胞に対する機械的歪みの効果を理解することは極めて重要です。
- リアルタイムイメージング技術は細胞応答の研究を強化します。
- 機械的歪みは細胞の挙動と完全性に影響を与える可能性があります。
- 以前の方法では、リアルタイムの応答を効果的に測定する能力が不足していました。
研究の目的
- 生細胞のメカノバイオロジーにおける機械的歪みの役割をほぼリアルタイムで観察すること。
- 細胞に適用される歪みの校正を可能にするシステムを開発すること。
- 機械的伸張前後の細胞の剛性を測定すること。
使用された方法
- 細胞の成長と伸張のための柔軟な膜を持つシステムの構築。
- モーターカウントと膜の歪みの校正。
- マウス肺上皮細胞の伸張と核のイメージング。
- 原子間力顕微鏡へのストレッチャーの組み込みによるナノ窪み形成。
主要な結果
- 適用された機械的伸張により細胞への直接的な損傷が観察されました。
- リアルタイムイメージングは歪みに対する細胞応答への洞察を提供しました。
- 開発されたシステムは膜の歪みを細胞に効果的に伝達しました。
- 剛性の測定により、機械的伸張後の細胞特性の変化が示されました。
結論
- 新しいイメージングプロトコルは、メカノバイオロジー応答の詳細な研究を可能にします。
- リアルタイム観察は歪み下での細胞力学の理解を強化します。
- このアプローチは様々な文脈における細胞応答のさらなる調査に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Real-time live cell imaging during mechanical stretch enables direct observation of mechanobiological responses, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This approach provides actionable insights into cellular injury mechanisms relevant to respiratory and soft tissue disease models, informing risk-adjusted portfolio decisions. Integration of confocal and atomic force microscopy (AFM) with mechanical actuation advances the precision and reproducibility of mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular responses to mechanical strain, clarifying mechanistic pathways.
- Supports functional target validation by quantifying changes in cell stiffness and reactive oxygen species (ROS) production.
- Facilitates predictive confidence in selecting disease-relevant targets for further development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live cell systems for downstream screening of mechanobiology-modulating compounds.
- Standardizes quantitative outputs such as elastic modulus and ROS levels for reproducible assay development.
- Enables reliable evaluation of compound effects under physiologically relevant mechanical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical injury models with disease-relevant endpoints for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct measurement of injury phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular damage and stress responses.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, lead identification, and preclinical mechanistic studies by enabling real-time, quantitative assessment of cellular responses to mechanical stimuli.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mechanotransduction and injury pathways in live cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay standardization and compound triage.
- Analytics: Provides high-content measurements of cell stiffness and ROS production for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant injury mechanisms in lung and other soft tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple tissue types and mechanobiology research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanobiology assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing early mechanistic insights.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, AFM operation, and mechanical actuation systems.
- Demands specialized instrumentation including confocal microscopy and AFM with compatible actuators.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible strain calibration and data acquisition.
- Adaptable to various cell and tissue models with protocol modifications for substrate and actuator compatibility.
- Careful handling and rapid execution are critical to minimize artifacts from cell agitation or environmental exposure.
