Name: メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶメカニカルストレッチ中のライブセルイメージング法。マウス肺上皮細胞を用いて、原子間力顕微鏡によるナノインデンテーションで細胞硬さを測定し、機械的ストレス応答をリアルタイムで観察する革新的アプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、彼らのサポートのためにメンフィス大学の技術のフェデックス研究所に感謝そのたいと思います。著者らは、メンフィス（デビッド·バトラー、ジャッキー·カーター、ドミニククリーブランド、ヤコブシェーファー）の大学で機械工学部門のシニア·デザイン·プロジェクトグループの学生を認めるしたい、モータ制御のための大学メンフィスの技術工学部門からのダニエル·コーン細胞培養における彼らの助けのため、博士ビンテンさんとCharlean Luellen。この作品は、K01 HL120912（ER）とR01 HL123540（CMW）によってサポートされていました。

1。細胞培養培地の保持のためのウェル壁を有する膜の構築（最終製品については、図1Dを参照してください） <ol><li>コラーゲンIでコーティングされたポリジメチルシロキサン（PDMS）のシートを使用して、外科用メスまたはダイを可撓性膜の輪郭をカットします。 </li><li>ストレージのための60ミリメートルペトリ皿に各膜を配置します。 </li><li>壁の作成： <ol><li> B（硬化剤）をエラストマーにエラストマーAの1の重量比：10にPDMSを混ぜます。 </li><li> 50mlチューブに完全に混合PDMSの5ミリリットルを注ぎます。 </li><li>ハイブリダイゼーションオーブンに水平に未硬化のPDMSを用いて50 mlチューブを置きます。 </li><li>硬化時間の間に8回転で被覆するために、チューブの内壁をローター関数を使用します。 RTで、PDMSは、完全に2日間で硬化させることになります。 </li><li>滅菌細胞培養フード内管からPDMSを削除します。 </li><li>新しいカミソリの刃を使用して、セクションの高さ4ミリメートルにPDMSのシリンダーを分割。 </li><li>膜WAとなるセクションを配置壁が折り目を付けになることを可能にすることのないペトリ皿容器にLLS、。 </li></ol></li><li>ペトリ皿に2を維持しながら、一つの膜の上にPDMSの一方の壁を選択し、中央。 </li><li>接着剤として使用する壁の外側周囲に：（1比10）静かに未硬化PDMSを配置します。それは、液体を保持することがあるため、壁と膜との間のギャップの形成を防止します。 </li><li>各ペトリ皿完成膜を含有し、硬化させる24時間70℃のオーブンでカバーを置きます。 </li></ol>キャリブレーションのためのクランプ変位または放射状の成長（図2）とモータ回転2.相関<ol><li>モータを制御するソフトウェアを起動します。 </li><li>モーターソフトウェアの手動設定を使用してデバイスのクランプを移動さ。 </li><li>距離を測定し、クランプの最小値と最大変位の両方でクランプの対向間のモータカウント位置を記録。 </li><li> Dの変化率（％）を計算しますモーター·カウント（〜0-75kカウント）の関数としてのクランプ間istance。これは、膜上で達成される最大の潜在的なひずみを示します。 </li></ol>マウス肺上皮細胞株のストレッチの3.アプリケーション（MLE12） <ol><li>ウェルあたり可撓性膜上の250万細胞（ステップ1）でのシードMLE12細胞は、2日以内にコンフルエントします。播種密度は、異なる細胞タイプについて変化し得ます。 </li><li>機械式アクチュエータが完全にリラックスした位置にあることを確認します。 <ol><li>細胞培養培地を除去します。 </li><li> 6クランプのそれぞれに2つの穴を開け、1.5ミリメートルに生検パンチを使用して膜のタブ（ 図1Dを参照してください）。穴の径方向の配置は、最初にプリテンション膜経験の量を決定します。何の予備張力を希望されない場合、膜のタブで20.5ミリメートルの半径で穴を開ける。 </li><li>パンチ穴がクランプ内ピンと並んでストレッチャー上の膜の位置を調整します。代わりにトップクランプを配置します。ネジの側面を交互に一つずつを締めます。 </li><li> 1ミリリットルの細胞培養培地を追加します。 </li></ol></li><li>光路を有する膜の中央を中心に顕微鏡ステージ上には置か。 </li><li> （可能な場合）ステージにデバイスを固定するテープや磁石を使用してください。いったん固定、顕微鏡のステージコントローラと機械装置の面内（膜に平行）および垂直（Z方向）を制御します。 </li><li>手動でモータ回転20の位置や速度を制御することにより、製造業者によって提供されるソフトウェアでストレッチを適用します。 </li></ol>ミトコンドリア活性酸素種の4測定（ROS） <ol><li>細胞がコンフルエントになったら、直接細胞にミトコンドリアのスーパーオキシドインジケータ（5μM最終濃度）でRT DMEM 1〜2mlのを追加します。 </li><li> 37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>洗浄細胞を穏やかに緩衝液で3回の水浴中で加温し37°C。 </li><li>すぐに直立共焦点顕微鏡下で既に代わりにストレッチャ（ステップ2.2）に柔軟な膜を配置します。 </li><li>フェノールレッドを含まない培地およびHEPES 25mMので1mlのDMEMを追加します。 </li><li> 580分の510 nmの励起/発光フィルターを設定します。 </li><li>画像の複数のフィールドは、15分ごとには、ミトコンドリアのスーパーオキシド産生の所望の時間経過を作成します。 </li><li>撮影された画像から、記録蛍光強度は、蛍光強度を定量化することが可能なソフトウェアを使用して、各時間間隔でヒストグラム。 </li></ol>ストレッチや原子間力顕微鏡（AFM）の5.アプリケーション注：これらの手順は、特定のAFMと光学顕微鏡の組み合わせ（ 図4および物質一覧）のために提供されます。 <ol><li>実験のAFMを準備します。 <ol><li> z方向の最大位置にAFMヘッドの高さを増やします。 </li><li> AFMの足への増量を入れてサンプルAFMカンチレバーコンタクトれるプレーンを持ち上げます。試料とAFMヘッドは機械装置の高さに対応するために持ち上げられる必要があります。 </li></ol></li><li> （利用可能な場合）、光学顕微鏡を準備します。 <ol><li> AFMスキャナプレートを取り外します。所望の目的を削除します。 </li><li>客観的にスペーサーを追加します。スペーサの高さは、客観的かつ具体的なAFMのセットアップに依存しますが、光学イメージングが所望される場合、観察面がストレッチャーとアダプター高さに等しい量だけz方向にシフト（ 図になりますので、それが必要です図5（a））。 AFMは、通常、デバイス上記光路から低倍率のイメージングを提供することに注意してください。 </li><li>バックの位置で所望の目的をマウントします。 AFMに戻すにスキャナを配置します。 </li><li> AFMソフトウェアを起動します。蛍光測定のための光源を含むすべての必要な光源を起動します。 </li><li>その片持ち梁にチップをマウントします目的の測定に適しています。生細胞の弾性率を測定するとき200 PN / nm以下剛性が好ましいです。 </li><li>レーザーの位置を合わせ、デバイスに搭載されたガラスカバースリップ上で製造者の指示に従ってカンチレバー剛性を調整します。 </li></ol></li><li>ステップ1のものが、以下のように変更して膜を準備します。 <ol><li>すぐにストレッチデバイス上に膜を取り付ける前に、高さ約1mmの壁をカット。これは、膜の壁とロードセルとの間に経験する干渉を防止します。 </li><li> 3.2.1-3.2.3に記載されているように機械装置の膜をマウントします。 </li><li>流出の場合にはAFMスキャナへの損傷を防ぐために、細胞培養培地を取り除き。 </li><li>カップルアダプタ（ 図5A）を持つデバイス。スキャナーのアダプタと機械装置を配置します。 </li><li>希望の引張ひずみレベルに膜を伸ばします。 </li></ol></li><li&gt;延伸した細胞のナノインデンテーション。 <ol><li>による流出にAFMスキャナや顕微鏡の損傷を避けるために、細胞上のメディアの限定（&lt;0.5 ml）のボリュームを追加します。 </li><li>膜と片持ち梁に係合します。 </li><li>関心領域をスキャンするために、特定のAFM装置のプロトコルに従ってください。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+new+opportunities+in+lung+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology.</a> J Biomech. 43, 99-107 (2010).</li>
<li>Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+CM+%22Comprehensive+Physiology%22">Comprehensive Physiology</a>. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Sensitivity+and+Mechanotransduction+during+Heart+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development.</a> Current Biology. 24, R495-R501 (2014).</li>
<li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475, 316-323 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell-surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force-induced+signal+transduction+in+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical force-induced signal transduction in lung cells.</a> Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).</li>
<li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in mechanotransduction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).</li>
<li>Chapman, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cyclic+opening+and+closing+at+low-+and+high-volume+ventilation+on+bronchoalveolar+lavage+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Car+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines.</a> Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).</li>
<li>Tschumperlin, D., Margulies, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+deformation-induced+injury+of+alveolar+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro.</a> Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).</li>
<li>Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+failure+in+ventilator-injured+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular stress failure in ventilator-injured lungs.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).</li>
<li>Roan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+alters+the+mechanical+properties+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).</li>
<li>Gamerdinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+load+and+mechanical+integrity+of+lung+cells+-+Experimental+mechanostimulation+of+epithelial+cell-+and+fibroblast-monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).</li>
<li>Hayashi, K., Naiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+remodeling+of+vascular+wall%3B+biomechanical+response+to+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).</li>
<li>Villemure, I., Stokes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+mechanics+and+mechanobiology.+A+survey+of+present+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding.</a> J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).</li>
<li>Waters, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+impose+prescribed+homogenous+strains+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells.</a> J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).</li>
<li>Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+simultaneous+live+cell+imaging+during+uni-axial+mechanical+strain+or+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression.</a> J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).</li>
<li>Dassow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+measure+mechanical+properties+of+pulmonary+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).</li>
<li>SmartMotor User's Guide v523. , Animatics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf ">http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf </a> (2011).</li>
<li>Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).</li>
<li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> J Physiol. 552, 335-344 (2003).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+single+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Pouvreau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+mouse+skeletal+muscle+are+produced+by+discrete+arrays+of+active+mitochondria+operating+coherently%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Yalcin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+on+epithelial+cell+injury+during+cyclic+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).</li>
<li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+claudin+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4.</a> J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).</li>
<li>DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+magnitude+and+frequency-dependent+actin+cytoskeleton+remodeling+in+alveolar+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

メカニカルストレッチ中に生細胞イメージングのためのユニークなデバイスを開発しました。このデバイスは、肺上皮細胞のメカノを研究するためのプロトコルで使用されました。予備研究では、単一の保持されたストレッチは、気管支上皮細胞におけるミトコンドリアのスーパーオキシド産生を刺激することが見出されました。また、機械的な歪みのレベルの増加は、肺胞上皮細胞の単層の完全性に直接的な損傷を引き起こすことが実証されました。 これらの予備実験を行うために、デバイスが最初に較正し、次に、膜株細胞（ 図2-3）に送信されたことが示されました。 図3Eに示されている（膜上のマークによって測定される）は、膜のひずみと（核との間の距離によって測定される）細胞株との間に密接な相関関係によって示されるように、全体的なデバイスは、好調に推移しました。しかし、ストラの間で観察されたいくつかのマイナーな違いがありました図2Dに示すように、アプローチ中膜およびマーカーの戻り曲線に測定しました。これは、装置内のバックラッシュや...

細胞は、多くの組織における機械的負荷にさらされ、この機械的刺激は、遺伝子発現、増殖因子の放出、サイトカイン、または細胞外マトリックスと細胞骨格のリモデリング1-4のパターンの変化を促進することが示されています。このような機械的刺激から形質細胞内シグナルは、メカノ5-7のプロセスを経て起こります。呼吸器系では、メカノの一つの結果は、活性酸素種（ROS）の環状の引張歪みの存在下での肺上皮細胞における8,9およびプロ炎症性サイトカイン10の増加です。強力な証拠も過度の引張歪みがセル11-14の生化学的応答に加えて、肺胞上皮の損傷を導くにつながることを示唆しています。ここでの焦点は、機械的変形に肺細胞の応答に主であるが、メカノによって誘発される経路は、BASにおいて重要な役割を果たし血管緊張15の調節および成長板16の開発など、人体の多くの組織のIC機能。 メカノへの関心の高まりは、培養細胞や組織への生理学的に関連する機械的負荷の適用のための多数のデバイスの開発をもたらしました。具体的には、組織が ​​経験する機械的負荷の一般的な形態である引っ張り歪を適用するデバイスは、人気11,17-19あります。しかし、利用可能なデバイスの多くは、いずれかの組織工学アプリケーションのためのバイオリアクターとして設計やストレッチでリアルタイムイメージングに資するものではありません。このように、メカノの経路の調査を容易にするために、張力の細胞及び組織を視覚化することができるツールおよび方法を開発する必要があります。 ここで、面内の機械的延伸装置が設計され、プロトコルは、Mを適用するために開発されましたultiple組織への株の形態および細胞リアルタイム（ 図1A-D）における生化学的および機械的応答のイメージングを可能にします。デバイスは、可撓性膜をつかみ、約20％（ 図1B）に面内、ラジアル膨満アップを適用するために円周方向に配置された6つの等間隔のクランプを使用しています。モータ（ 図1C）がインキュベータの外 ​​部に配置され、モータ供給業者によって提供される独自のソフトウェアによって制御される作動装置は、長期間の細胞培養インキュベーターに置くことができます。モータは、緊張と弛緩中に均一6ストレッ​​チャクランプを駆動する、内部カムを回転させるリニアドライバに接続されています。 機械装置に加えて、カスタマイズされた柔軟な膜は、機械的なシステムで使用される市販の細胞培養準備膜から作成されました。およその直径そして円形壁（28ミリメートル）を作製し、細胞にのみ十分に記載ひずみプロフィールのこの領域中で培養することができるように、可撓性膜上に付着させました。作動装置内のこれらの膜の配置は、可撓性膜の中心部に均一で等方性の歪みを提供するかどうかを決定するために、有限要素解析は、市販のソフトウェア（ 図1E-F）を用いて行きました。フレキシブル膜は、対称境界条件でモデル化し、メッシュのすべての四角形要素を利用しました。 図1Fに示す最大主ひずみの等高線図に見られる同心リングは、歪みの等方性の分布を示しています。 膜によって受ける歪みがローディング（ 図2）を介してマーキングの画像を記録することによって測定した。 図2Dは ​​、半径方向及び軸方向に測定された平均膜株がほぼ直線であったことを示します適用モータに対して20％の最大線形歪みにカウントアップします。バック休止位置へ後退時に測定されたものと比較して膨張時に測定された歪みのレベルの間に有意差はなかったです。次に、カスタム可撓性膜上で培養したヒト気管支上皮細胞（16HBE）及びそれらの核の変位を測定しました。全細胞の変位は、デジタルマイクロスコープを用いて記録位相コントラスト画像を用いて測定したのに対し16HBE細胞の蛍光標識（DAPI）核は、共焦点顕微鏡下で20X対物レンズを用いて画像化しました。 図3に見られるように20％の線形歪み〜まで、核の変位によって測定ひずみは、膜上のマーキングの変位によって測定されたものと同様でした。これは、膜に加わる歪みを接着細胞に伝達されたことを確認します。従来の顕微鏡のカスタムデバイスの使用を記述プロトコルおよび原子間力microscopeは、以下のステップで提供されます。

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34: 3400 シリーズ</td><td>MOOG アニマティクス</td><td>SM3416D</td><td>統合モーター、コントローラー、アンプ、エンコーダー、通信バス</td></tr><tr><td>Flexcell 膜 (コラーゲン I コーティング)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3.5"&nbsp;x&nbsp;5.25インチ&nbsp;x&nbsp;0.020"</td></tr><tr><td>シルガード184</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td></td><td>10:1</td></tr>ヘ<tr><td>キスト33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td>DAPI染色</td></tr><tr><td>MitoSOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Tiron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7389&nbsp;</td><td>ミトコンドリアスーパーオキシド標識</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td>スーパーオキシド阻害剤</td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mlチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-443-19</td><td>任意の遠心チューブを使用して、イメージング用の領域を作成することができます。</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>マウス肺上皮細胞&nbsp;</td></tr><tr><td>16HBE細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2741</td><td>ヒト気管支上皮細胞</td></tr><tr><td colspan="4">AFM Indentation Experiments</td></tr><tr><td>Cantilever Beams for Nano-indentation</td><td>Budget Sensors</td><td>Si-Ni30</td><td></td></tr><tr><td>AFM&nbsp;</td><td>アサイラムリサーチ</td><td>MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>オリンパスの顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX-71</td><td>20倍と40倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡。</td></tr><tr><td>AFM レッグエクステンダー</td><td>アサイラムリサーチ</td><td>利用できません</td><td>AFM顕微鏡</td></tr><tr><td colspan="4">Finite Element Analyses</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</strong</td></tr><tr><td>>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscopes</strong</td></tr><tr><td>>Digital顕微鏡</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS XL Core</td><td>当初は自立型企業でしたが、現在はLife Technologiesが所有しています。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>2光子直立顕微鏡</td></tr></tbody></table>

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

現在、細胞や組織が機械的刺激にどのように反応するかを理解することに大きな関心が寄せられていますが、現在のアプローチは、生細胞や生存組織での反応をリアルタイムで測定する能力に限界があります。プロトコルは、細胞アクチュエータを使用して、共焦点顕微鏡および原子間力顕微鏡(AFM)でイメージングしながら、弾性基板上に成長した生細胞または弾性基板に付着した組織を膨張させるために開発されました。予備的な研究では、ヒト気管支上皮細胞の強直性伸張がミトコンドリアスーパーオキシドの産生の有意な増加を引き起こしたことが示されています。さらに、このプロトコルを使用して、肺胞上皮細胞を伸ばして画像化し、in vitroで肺損傷の1つの形態をシミュレートする過剰膨張による上皮細胞への直接的な損傷を示しました。また、伸ばした細胞上でAFMナノインデンテーションを行うためのプロトコールも提供されています。

活性酸素種と変形 以前の研究は、環状のストレッチ21に応答して、気道及び肺胞上皮細胞における活性酸素種（ROS）の増加を示しました。活性酸素種は、分子及び脂質、タンパク質、多糖、および核酸22-24に対して高い反応性を有する分子酸素由来のフリーラジカルを含みます。 ROSは、一般的な細胞内のイオンチャネルの機能を調節するための信号、プロテインキナーゼ/ホスファターゼ活性化、および遺伝子発現としての役割を果たすが、過剰又は無秩序な産生は、アポトーシスおよび壊死性細胞死、神経変性、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および癌24,25に寄与することができます。電子は電子伝達鎖から漏れたときにスーパーオキシド、ROSの他の形態のためのプレカーソルは、ミトコンドリア呼吸の副産物として生成することができます。以前の研究では、力学的サイクルのストレッチは、スーパーの産生を刺激したことを示唆しましたNADPHオキシダーゼ系（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ）、およびミトコンドリアの電子伝達鎖（...

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

本実験の全体的な目的は、細胞のメカノバイオロジーにおける機械的歪みの役割を、ほぼリアルタイムで観察することです。まず、細胞を培養し伸展させるための柔軟なメンブレンを備えたシステムを構築します。次に、メンブレンを伸展させ、モーターカウントとメンブレン歪みのキャリブレーションを行います。次に、マウス肺上皮細胞を伸展させ、核をイメージングします。膜の歪みが細胞に伝達されることを示すため、伸展装置をAFMに組み込み、ナノインデンテーション法を用いて伸展前後の個々の細胞の剛性を測定しました。その結果、負荷された伸展によって細胞に直接的な損傷が生じていることが示されました。また、蛍光イメージングに基づき、ストレッチに伴って活性酸素種の産生が増加することが示されています。本手法は、機械的換気によって上皮細胞が損傷を受けるか否かなど、肺の機械生物学分野における重要な疑問に答えることができます。本手法は肺細胞の機械生物学に知見を提供できるほか、肝臓や成長板のスライスなどの他の軟組織にも適用可能です。一般的に、原子間力顕微鏡などの本実験で使用される非定型的なツールの組み合わせにより、この手法に不慣れな方は習得に苦労することがあります。まず、付属のテキストプロトコルに従い、細胞培養用に改変されたコラーゲンコーティングPDMSメンブレンを準備します。次に、滅菌済みの柔軟なコラーゲンコーティングメンブレン上に、マウス肺上皮細胞を1ウェルあたり2.5 million cellsの密度で播種します。細胞を37°C、5%CO2条件下で2日間インキュベートし、コンフルエントになるまで培養します。次に、プリテンション（事前張力）が不要な場合は、コンストラクトの中心から20.5 mmの位置で、1.5 mmのバイオプシーパンチを用いて6つのクランプタブそれぞれに2つの穴を開けます。その後、細胞培養培地を除去します。メカニカルアクチュエータがゼロ歪みの位置にあることを確認し、パンチ穴がピンおよびクランプと一致するように、ストレッチャー上にメンブレンを配置します。上部クランプを取り付け、その後、異なる側を交互に、ネジを1本ずつ締め付けます。デバイスを顕微鏡ステージに置く前に、細胞培養液を1 mL加えます。デバイスを光路の中心に合わせます。次に、デバイスをステージに固定します。目的の入力ブロックにある顕微鏡のステージコントローラーを用いて、メカニカルデバイスの面内位置および垂直位置を調整し、膜に焦点を合わせます。適用したい歪みレベルに対応するモーターカウント値を入力します。次に、伸展前後で同じ視野を観察するため（伸展によって顕微鏡対物レンズに対して視野がずれる可能性があり、伸展中に顕微鏡ステージの調整が必要になる場合があるため）、速度入力ブロックの値を10 RPM以下に設定します。すべての設定が完了したら、「go」をクリックします。まず、原子間力顕微鏡の調整を行います。AFMヘッドをZ方向に最大高さまで上げます。次に、脚にエクステンダーを取り付け、AFMカンチレバーが試料に接触する平面を高くします。次に、AFMスキャナープレートと目的の対物レンズを顕微鏡から取り外します。対物レンズにスペーサーを追加し、再び顕微鏡に取り付けます。その後、スキャナープレートをAFMに元通りに取り付けます。スペーサーの高さは、対物レンズや特定のAFMの設定によって異なりますが、光学イメージングを行う場合は、観察面がZ方向にシフトするため、スペーサーの使用が必須となります。次に、AFMソフトウェア、光学顕微鏡ソフトウェア、および蛍光測定用光源を含むすべての必要な光源を起動します。生細胞の弾性率を測定するため、ばね定数が200 pN/nm以下のカンチレバービームを備えたチップをAFMに装着します。続いてレーザーの光軸調整を行い、デバイスにガラスカバースリップを装着して、メーカーの推奨に従ってカンチレバーのばね定数を校正します。膜をストレッチデバイスに装着する直前に、壁の高さを約1 mmにカットします。これにより、メンブレン壁とロードセルとの間で発生する干渉が軽減されます。次に、細胞培養液を除去し、メンブレンを機械装置に取り付けます。ソフトウェアを使用して、アダプターを装着した機械装置をスキャナーに配置します。ナノインデンテーションを行う前に、メンブレンを目的の引張ひずみレベルまで伸長させます。細胞を水和状態に保つため、培地を 0.5 mL 以下添加しますが、FMスキャナーや顕微鏡を損傷させる可能性があるため、液漏れしないよう注意してください。その後、カンチレバービームをメンブレンに接触させます。使用するAFM装置のプロトコルに従い、関心領域をスキャンします。メンブレン上に播種した細胞に20%の歪みを加えた際、細胞はここに示す通り20%変位しました。活性酸素種の産生に対する細胞の影響は、付属のテキストプロトコルに記載されている通り、累積的ミトコンドリアスーパーオキシドセンサーを用いて気管支上皮細胞で測定しました。機械的伸展がない場合、17%の単一伸展を加えて維持しても、60分間でROS産生に有意な増加は見られませんでした。原子間力顕微鏡にメカニカルストレッチャーを組み込んだことで、ミトコンドリアROSの増加がさらに60分間持続しました。10%の引張ひずみを加える前後のマウス肺上皮細胞の弾性率マップを、ここに概説する領域から取得しました。40×40 µmの領域にわたって300本の個別の強制変位曲線を記録したところ、ひずみの適用に伴い、高弾性率領域の局在が変化することが示されました。習熟すれば、細胞ストレッチングは15分で完了できます。一方、FMナノインデンテーションを適切に行うには2時間かかる場合があります。本手順を実施する際は、データ報告前の撹拌や室温空気にさらされる時間の延長が結果に悪影響を及ぼす可能性があるため、細胞を慎重かつ迅速に取り扱うことが重要です。FMの操作は非常に困難であることに留意してください。本手順の実施中は、すべての液体をスキャナーから遠ざけるなどの注意を払う必要があります。

live-cell-imaging-during-mechanical-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

それは広く体内に機械的な力が細胞の分化と増殖に影響を与えることができることが理解される。ここでは、柔軟なマイクロパターン基板上に培養した細胞を食い止めるために一軸周期引っ張り歪みを配信するための特注のバイオリアクターの使用方法を示すビデオプロトコルを提示する。...

繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激

本論文では、培養中の生細胞の機械的刺激のための統合された原子間力光学イメージング顕微鏡の操作で、リーダーに指示することを目指しています。ステップバイステップのプロトコルが表示されます。機械的な刺激に生細胞の応答を示す代表的なデータセットが表示されます。...

集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる

機械的な力は、肺の開発と肺傷害において重要な役割を果たしています。ここでは、げっ歯類の胎児の肺II型上皮細胞と線維芽細胞を分離するとを使用して機械的刺激にそれらを公開する方法について説明します。...

胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム

この原稿は、単方向ストレッチを使用して接着細胞または組織に力を適用したり、解放する手法を提示します。...

PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。...

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

このペーパーでは、以前に設計したデバイスを使用して接着細胞に機械的ひずみを適用し、再設計された基層ジオメトリと、100x...

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。...

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)を単離および培養するためのプロトコルについて述べる。また、hSVECの機械的応力を研究するために、せん断応力と伸張を生成するための詳細な方法も提供しています。...

ヒト伏在静脈内皮細胞の単離と制御されたレベルのせん断応力および伸張への曝露

ここでは、空気圧で作動し、高解像度顕微鏡法と互換性のある汎用性の高い等二軸ストレッチデバイスを紹介します。...

高倍率生細胞共焦点蛍光顕微鏡用等二軸延伸装置

ここでは、細胞に対して等方的および一軸のひずみ波形を適用しつつ、基質上で培養を支持し、剛性を調整可能かつタンパク質行列をカスタマイズ可能な新しい装置として紹介します。このシンプルで経済的なプラットフォームにより、研究者は基礎研究から疾患関連の文脈において、機械的な手がかりがどのように細胞機能を調節するかを調査できます。...

in vitro 細胞の伸縮および画像診断のための新しいプラットフォーム

学ぶメカニカルストレッチ中のライブセルイメージング法。マウス肺上皮細胞を用いて、原子間力顕微鏡によるナノインデンテーションで細胞硬さを測定し、機械的ストレス応答をリアルタイムで観察する革新的アプローチです。

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

さらに動画を探す