マウスナイーブCD4 ⁺ T細胞の単離とインビトロ T細胞サブセットへの分化

次の手順の全体的な目標は、マウスリンパ節および脾臓から単離されたナイーブCDの4つの陽性T細胞を分極して、異なるヘルパーTサブセットに分極することです。インビトロでは、これは最初に成体の野生型マウスから採取した脾臓とリンパ節を処理することによって達成されます。第2のステップでは、CD 4陽性細胞集団を磁気ビーズ分離によって濃縮し、さらにそれらのナイーブT細胞マーカー発現によって選別します。

最終ステップでは、細胞をT細胞受容体活性化因子と分極サイトカインで処理し、さまざまなヘルパーT系統への分化を誘導します。最終的にはフローサイトメトリーです。Elis AとリアルタイムPCRを使用して、ヘルパーT細胞の分化効率を評価します。

この方法は、特定の分子の発現や特定の薬物による治療がT細胞応答の性質にどのように影響するかなど、Tヘルパー細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、生後5〜10週齢のC 57ブラックシックスマウスの手足を解剖ボードに固定し、次に肛門からあごまでの縦方向に皮膚を切断します。次に、皮膚をピンで固定して開き、1組の鉗子を使用してリンパ節をつかみ、もう1組の鉗子を使用して、画像に示されている各位置から組織を分離します。

各リンパ節が採取されたら、1%FBSまたはPBSプラスを補充したPBSを含むコレクションディッシュに入れ、次に腹膜を慎重に開いて脾臓を取り出します。脾臓も収集皿に入れ、皿を氷の入ったバケツに移して、CDの4つの陽性細胞を濃縮します。脾臓のリンパ節を、3ミリリットルのPBSを含む2つの別々の60ミリメートル皿に分割し、それぞれを滅菌鉗子を使用します。

次に、脾臓の上に滅菌ナイロンメッシュの正方形を置き、シリンジプランジャーの親指側を使用して、組織のほとんどすべてが懸濁状態になるまでメッシュに優しく打ち付けます。懸濁液を数回上下に配管して残りの可溶性塊を分解し、15ミリリットルの円錐形チューブの開口部に新しいナイロンメッシュを置きます。サスペンションをチューブにろ過して、残っている破片を取り除きます。

次に、リンパ節の機械的解離を繰り返し、ろ過された細胞の両方のチューブにPBSプラスを充填します。次に、チューブを数回反転させ、細胞をスピンダウンします。リンパ節ペレットを2ミリリットルのPBSに懸濁します。

脾臓細胞ペレットに1ミリリットルの氷冷、マウス1匹あたりCK溶液を加えます。1分後、10ミリリットルのPBSプラスで赤血球の溶解を停止します。チューブを反転させ、細胞を再度スピンダウンします。

次に、脾臓ペレットをさらに10ミリリットルのPBSプラスに再懸濁し、リンパ節細胞を追加し、プールされた細胞懸濁液をスピンダウンします。今回は、ペレットを15マイクロリットルのCDに再懸濁し、4つの磁気ビーズを85マイクロリットルのPBSプラスで希釈し、マウスあたり4°Cで15〜30分間再懸濁します。次に、細胞を10ミリリットルのPBS plusで希釈します。

懸濁液をナイロンストレーナーでろ過し、新しい15ミリリットルチューブに入れ、細胞をスピンダウンします。再度、マウスごとに100マイクロリットルのPBSプラスでペレットを再回転させ、製造元の指示に従って磁気ビーズ選択によりCDの4つの陽性細胞を正に選択します。CD4陽性、陽性細胞画分を得た後、10ミリリットルのPBSプラスで細胞を洗浄し、CD4陽性T細胞画分を選別する。

次に、洗浄後、暗所で摂氏4度で15〜30分間、適切な蛍光抗体で細胞を標識します。ラベル付けされた細胞をろ過して破片を取り除き、氷上のファックスチューブに移し、光から保護します。CD 4 陽性、CD 25、陰性、CD 62 L、陽性 CD 44、陰性集団を完全な RPMI 培地に分類します。すべてのセルが収集されたとき。

ナイーブT細胞を新鮮で完全な培地で洗浄します。次に、ペレットを再懸濁し、RPMIを完了し、ナイーブT細胞をカウントし、濃度を10の10倍から1ミリリットルあたり6細胞に調整して、in vitroヘルパーTサブセットの分化を誘導します。次に、抗CD 3および抗CD28を予め被覆した細胞培養プレートの各ウェルを、1ミリリットルの滅菌FBSフリーPBSおよびプレートで洗浄する。

細胞は最終的に、表に概説されているように、適切なサイトカインとブロッキング抗体を培養培地に補充し、培養で4〜5日後、細胞を5%二酸化炭素で摂氏37度で4〜5日間インキュベートします。in vitro分化したTH1、TH2誘導性tregおよびTH17の培養物からCD陽性T細胞4種の細胞内サイトカイン染色を行うことができる。各T細胞サブセットが期待されるサイトカインプロファイルを示すことを確認するため。

実際、抗CDによる24時間の再刺激3つのEISの後、Aは、サブセットが細胞内で発現したサイトカインタンパク質の対応する細胞外産生も示すことを示しています。系統特異的な転写因子のリアルタイムPCRは、in vitro分化型CDの4つの陽性T細胞サブセットの適切な転写因子プロファイルをさらに検証します。このビデオを見た後、ミラーリングリンパ節細胞と脾臓細胞を分離して処理し、ナイーブCD 4つのポジティブTヘルパー細胞を取得する方法をよく理解しているはずです。

さらに、これらのT細胞をTH1、TH2、TH17、またはireg細胞に分化させることができます。