Name: の酸化ストレス抵抗を測定線虫（Caenorhabditis elegans） 96ウェルのマイクロタイタープレート中 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶ酸化ストレス抵抗性測定法をCaenorhabditis elegansで。96ウェルマイクロタイタープレートを用いた液体アッセイにより、線虫の生存率を評価し、細胞生存メカニズムの理解に貢献します。

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我々は、Cの線虫遺伝学センターを認めますエレガンス株 。資金援助は、テリー·フォックス·研究所から提供されました。また、RolandeとマルセルGosselin大学院学生の身分とマギル統合がん研究研修プログラムのがん研究FRN53888でCIHR / FRSQ訓練助成金からEPに付与されたサポートを認めます。

試薬の調製<ol><li> C.のためのメディアの準備エレガンスの成長（ここでは、野生型動物とflcn-1（ok975）変異動物）。 <ol><li>トリスHCl、トリス塩基、Bactopetoneの31グラム、塩化ナトリウムを20gとコレステロールの0.08グラムの2.4グラムの5.5グラムを含有する修飾Youngren唯一バクトペプトン（MYOB）ドライミックスを準備します。振とうしながらよく混ぜます。 注：この混合物は、MYOB培地10 Lを調製するのに十分です。 注：通常の増殖培地（NGM）プレートはMYOB板27の代わりに使用することができます。しかし、同じタイプのプレートは、系統間の独立した反復間有効な比較のために使用されるべきです。このプロトコルでは、我々は唯一のMYOBのプレートを使用していました。 </li><li> MYOB乾燥混合物の6グラム、寒天の17グラムを追加することで、MYOB媒体の1 Lを調製し、122℃で45分間、H 2 O、オートクレーブで1 Lに構成しています。プレートを注ぎ、室温で2日間乾燥させてください。 </li><li>無菌技術を用いて、cultu 100mlの接種E.とLBブロス培地の再大腸菌 OP50細菌と37℃でO / Nを成長させます。 </li><li> E.と種子MYOBプレート大腸菌 OP50細菌。それは48時間室温で成長できるようにします。 </li></ol></li><li> RNAiを用いて遺伝子のダウンレギュレーションのための準備<ol><li> MYOBのRNAi送りプレートを準備します。ステップ1.1.1と1.1.2のように進みます。オートクレーブ処理後、培地を約55℃まで冷却し、1ミリリットルM 1のイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）および1ミリリットルの100mMアンピシリンを追加することができます。 </li><li>ストリークE.大腸菌 HT115制御EVまたはプレート寒天アンピシリン上flcn-1特異的RNAi（50μg/ mlの）/テトラサイクリン（15μgの/ ml）のいずれかを発現するプラスミドで形質転換された細菌。 37℃で培養O / Nを成長させます。 </li><li>コロニーを選択し、Eを接種制御EVまたはflcn-1特異的RNAiのいずれかを発現し、37＆＃でLB /アンピシリン（50μg/ ml）中、O / Nでの培養を成長させるプラスミドで形質転換した大腸菌 HT115細菌176; C。 </li><li> E.によるシード·プレート大腸菌 HT115 EV細菌やHT115 flcn-1のRNAi細菌。 注：使用前にRTでプレートを48時間にしてください。給電によるのRNAiノックダウンが有効になっている場合は、DS-RNA 28の送達の他の方法を使用します。 </li></ol></li><li>パラコート（PQ）を使用して酸化ストレスを誘導します。 <ol><li> 7 H 2 O·KH 2 PO 4、のNa 2 HPO 4、5gのNaClをし、MgSO 4 0.25gの6gの3gを混合することによってM9バッファーを調製します蒸留水で1リットルに起動します。 RTで122℃、店舗ボトルで45分間オートクレーブソリューション。 </li><li>アッセイの日に、M9 / PQを含む溶液を準備します。このプロトコルは、100 mMのPQを使用します（M9バッファーの4ミリリットルに溶解PQの0.1028グラムを、ウェル当たりM9 / PQの40μlの全96ウェルプレートを埋めます）。 注意：PQが危険と毒性の高い化合物です。適切なガイドラインに従って処理します。 注：最初に新しいのを実行しています電車や新たな条件、それは7-10時間以内に動物を殺すために使用するのに最適な濃度を決定するためにPQの濃度を増加さに生存をアッセイすることをお勧めします。 </li></ol></li></ol>年齢同期L4人口の調製<ol><li> E.を接種した新鮮なMYOBプレートに20妊娠大人の雌雄同体を転送大腸菌 OP50細菌。アッセイの間に必要な虫の数に基づいて、いくつかのプレートを準備します。 </li><li>彼らは6時間産卵することを可能にした後、白金線虫を用いて、母親を削除選びます。産卵数を評価するために顕微鏡下でプレートを確認してください。 </li><li>卵が孵化し、48時間、20℃で成長させます。この時点で、動物が後期L4 /若年成人の段階にあります。同じステージの動物を選択し、PQ液含有ウェルに移します。 注：48時間のインキュベーションが唯一の野生型動物と同様に成長する突然変異体に適用されるので、それが発達監視することが重要ですそれはそうでなければ、他のタイムラインを使用する必要があり、野生型の現像速度に準拠を保証するために、新たにテストされた変異体の割合。 </li><li>あるいは、同期技術​​を使用しています。次亜塩素酸溶液を用いて、L1幼虫ワームの同期人口を（;光から分離するためにアルミホイルで瓶を包む水25ml、5.25％の次亜塩素酸ナトリウムの125ミリリットル、4 M NaOHを50ミリリットル）を生成します。強烈な漂白がアッセイ中に動物の行動に影響を与える可能性があるので、このアッセイのために、それは、推奨されません。 注意：ガイドラインに従って次亜塩素酸溶液を処理します。 注：ダウン、目的の遺伝子を調節する特異的RNAi細菌を播種したRNAiプレートに母親の転送を除いて、セクション2で説明したように雌雄同体を同期させるためにRNAiを使用する場合。 RNAiのでノックダウンが弱い場合には、複数の世代のための給紙を推奨します。 </li></ol> 3.酸化ストレス抵抗性アッセイを&lt;実行/ P&gt; <ol><li> 96ウェルプレートの各ウェルに100 mMのPQ溶液をピペット40μL（新しく調製）。すべての条件（処理、突然変異体など ）を複製するように、少なくとも12のウェルを使用してください。白金線虫ピックを使用して、十分に開始時刻と終了時刻を示すあらゆるに5-8 L4幼虫動物を転送します。 </li><li>別の条件を開始すると、開始時刻と終了時刻を確認します。ワームを転送し、開始時刻から時間後に死亡した動物の得点間のインキュベーション時間で2​​0℃でプレートを置きます。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して、生存時間ごとにカウント。ゆっくりカウントを開始する前に、プレートを振ります。死んだ動物として、あっても高強度の光をスポットした後、移動しないワームを示しています。また、生きている動物の数を示しています。 注：高倍率でワーム形状、尾と頭の動きを見ると、生きているから死んだ虫を決定するのに役立ちます。 </li><li>ほとんどのワームは死んでいるまで、この手順を時間ごとに繰り返します。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。毎回ポイントでの生存割合の決意<ol><li>すべてのウェルに移した動物の数を追加することによって、条件あたりの動物の数を計算します。破損または転送時に殺される動物を無視します。 </li><li>すべての時点について、条件ごとに死んだ動物の合計数（12ウェル中の死んだ動物の合計）を計算します。すべての時点について、死亡率（死亡した動物の数の動物の総数で割り、100を掛けた）及び生存率（100パーセントマイナス死）を計算します。 </li><li>このアッセイを、少なくとも3つの独立した回を繰り返します。 </li></ol>

<ol><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).</li>
<li>Alfadda, A. A., Sallam, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in health and disease.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 936486(2012).</li>
<li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidants%2C+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li>
<li>Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+the+key+players+in+the+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases.</a> Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).</li>
<li>Gandhi, S., Abramov, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+oxidative+stress+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration.</a> Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010(2012).</li>
<li>Trushina, E., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases.</a> Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).</li>
<li>Touyz, R. M., Briones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+vascular+biology%3A+implications+in+human+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension.</a> Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Sosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+cancer%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and cancer: an overview.</a> Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+Causal+or+Casual+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).</li>
<li>Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+controls+stress+response+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity.</a> J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).</li>
<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).</li>
<li>Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+under+stress%3A+C.+elegans+stress+response+and+its+relevance+to+complex+human+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging.</a> Trends Genet. 29, 367-374 (2013).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22Practical+approach+series%22">Practical approach series</a>. , Oxford University Press. 282(1999).</li>
<li>C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn+to+the+worm%21%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Turn to the worm!</a> Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).</li>
<li>Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+nematode+orthologs--lessons+from+the+analysis+of+1800+human+genes+and+the+proteome+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 238, 163-170 (1999).</li>
<li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+in+Caenorhabditis+elegans%3A+impact+on+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research.</a> Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).</li>
<li>Moreno-Arriola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+A+Useful+Model+for+Studying+Metabolic+Disorders+in+Which+Oxidative+Stress+Is+a+Contributing+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor.</a> Oxid Med Cell Longev. , 705253(2014).</li>
<li>Possik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folliculin+regulates+ampk-dependent+autophagy+and+metabolic+stress+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival.</a> PLoS Genet. 10, e1004273(2014).</li>
<li>Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+cytotoxicity+of+paraquat%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Prev+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanism of cytotoxicity of paraquat.</a> Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+is+dispensable+for+normal+animal+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metab. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Timmons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+methods+for+RNA+interference+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Delivery methods for RNA interference in.</a> C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).</li>
<li>Wang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Eyes+Absent+Ortholog+EYA-1+Is+Required+for+Stress+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance.</a> Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).</li>
<li>Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAD+Box+RNA+helicase+VBH-1+is+a+new+player+in+the+stress+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans.</a> PLoS One. 9, 97924(2014).</li>
<li>Ward, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+the+C.+elegans+acyl-CoA+synthase%2C+acs-3%2C+and+nuclear+hormone+receptor%2C+nhr-25%2C+cause+sensitivity+to+distinct%2C+but+overlapping+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses.</a> PLoS One. 9, 92552(2014).</li>
<li>Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+synaptic+nlg-1%2Fneuroligin+abundance+by+the+skn-1%2FNrf+stress+response+pathway+protects+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress.</a> PLoS Genet. 10, e1004100(2014).</li>
<li>Greer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in.</a> C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
<li>Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brivanib%2C+a+dual+FGF%2FVEGF+inhibitor%2C+is+active+both+first+and+second+line+against+mouse+pancreatic+neuroendocrine+tumors+developing+adaptive%2Fevasive+resistance+to+VEGF+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition.</a> Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).</li>
<li>Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+links+energy+levels+and+insulin-like+signals+to+lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans.</a> Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+is+phosphorylated+by+LKB1+and+is+required+for+resistance+to+oxidative+stress+and+for+normal+motility+and+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior.</a> J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).</li>
<li>Honda, Y., Honda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+daf-2+gene+network+for+longevity+regulates+oxidative+stress+resistance+and+Mn-superoxide+dismutase+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).</li>
<li>Restif, C., Metaxas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+swimming+motions+of+C.+elegans+worms+with+applications+in+aging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Comput+Comput+Assist+Interv%22%5BJournal%5D)">Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies.</a> Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).</li>
<li>Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+automated+measurement+of+nematode+swimming+%28thrashing%29+without+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry.</a> BMC Neurosci. 10, 84(2009).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

C.エレガンスは、それが容易に培養することができるので、 生体内での遺伝的に酸化ストレス耐性を研究するための魅力的なモデル生物であり、急速に遺伝的に同一の子孫の多くをもたらします。酸化ストレス抵抗性を測定するための複数の方法は、以前に記載されており、それらは、PQ、ロテノン、H 2 O 2、及びジュグロン25,26,29-32などの種々のROS光源と培養プレートの補充に基づいています。ここでは、100 mMのPQを用いて96ウェルプレート中の液体中の酸​​化ストレス耐性を測定するプロトコルを説明します。同様のアッセイは、グリアら 33によって行われました。このアッセイは、他のROS源を用いて、液体中の酸​​化ストレスを研究するために適合させることができます。例えば、我々としても23数個のH 2 O 2濃度にflcn-1が増加する抵抗の損失を示しました。 この...

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Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

真核生物では、ミトコンドリアの電子伝達系で起こる酸化的リン酸化は、ATPの形でエネルギー生産の主な要因です。活性酸素種（ROS）は、このプロセスの自然な副産物です。シグナル伝達分子としての重要な役割にもかかわらず、過剰なROSは、DNA損傷、タンパク質のカルボニル化、および脂質酸化につながることができます。 ROS産生と解毒の間の不均衡は、エネルギーの枯渇につながる酸化ストレス、細胞の損傷を引き起こし、細胞死1,2をトリガします。酸化ストレスは老化および癌、糖尿病、心血管および神経変性疾患3-9を含む多くの生命を脅かす疾患の発展に貢献しています。 細胞は適切なROSレベルを維持し、酸化的損傷1,2に対してその成分を保護するために酵素的および非酵素的防御戦略を進化させてきました。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の酵素はconveに第一幕RTスーパーオキシド後カタラーゼまたはペルオキシダーゼ酵素によって水に変換されるH 2 O 2へ。非酵素的な防衛戦略は、主に必須の細胞成分を保護する細胞高分子と比較して、ROSと速く反応する分子を含みます。 ROS解毒酵素の保護の役割にもかかわらず、いくつかのROS分子は、抗酸化防御機構を脱出し、酸化的損傷につながります。検出、修復、および損傷した細胞成分の分解は、酸化ストレス1,2間に本質的な防御戦略です。 ストレス耐性、特に酸化ストレスに関与するシグナル伝達経路は、進化的に高度10,11に保存されています。生物の条件が部分的にしか再現されている細胞培養実験とは異なり、モデル生物における酸化ストレスの研究12,13は、大きな意義を持っている。C.エレガンスは、CUL、容易かつ安価にすることができます自由生活線虫であります寒天培地上の細菌叢上tured。それは、（長さ約1mm）小型で、通常の遺伝子操作を容易に自己受精ふたなり、として成長します。それは大規模な遺伝子スクリーニング14を実行するための強力なツール作り、世代あたり約300の子孫を生成する、迅速なライフサイクルと高い生殖能力を有しています。 C.エレガンスゲノムが完全に配列決定され、遺伝子の40〜50％は、ヒトの疾患関連遺伝子15〜18の相同体であると予測されます。 RNAiを用いて、目的の遺伝子のノックダウンは、迅速かつCで簡単です。 エレガンス。遺伝子のダウンレギュレーションはE.動物に供給することによって達成することができます関心19のmRNAを標的とする二本鎖RNAを発現するプラスミドを保有する大腸菌細菌。そのため、大規模なRNAiスクリーニングを使用して、遺伝子機能の決意は、癌20,21を含むヒトの疾患を理解する上で大きな影響を与えています。 Oの研究Cでxidativeストレス耐性エレガンスは、酸化ストレスに対する抵抗13,22の保存されたメカニズムの同定につながりました。同定されたいくつかの経路は、低酸素、熱、および浸透圧ストレスなど、他のストレスに長寿と抵抗を調節する一般的な経路です。これらの経路は、インスリンシグナル伝達、TORシグナリング、およびオートファジーを含みます。その他の主な経路は、そのような、または損傷修復におけるこのような熱ショックタンパク質とシャペロン11,13,22としてスーパーオキシドジスムターゼ酵素とカタラーゼ酵素としてROSの解毒を伴います。 このプロトコルは、Cの酸化ストレスに対する抵抗性を決定する方法について説明します液体中のエレガンス 。我々は以前Cでflcn-1（ok975）の喪失時の酸化ストレスに対する抵抗性の増加を示しているので、私たちはプロトコルを示すためにflcn-1（ok975）と野生型動物を使用しましたエレガンス 23。また、この増加した抵抗性が依存することを示していますAMPKとオートファジーは、細胞生体エネルギーを改善し、ストレス耐性23を促進するシグナル伝達軸上。 PQは、反応性酸素種24を生成するために電子伝達系を妨害する酸化的ストレッサーです。同じアッセイを適合させることができ、他のROS源またはROSの生成化合物は、H 2 O 2およびロテノンとして使用することができます。同様のアッセイは、PQの低濃度は25,26を使用しているプレート上で開発されています。このアッセイの利点は、非常に高速であり、結果は、一日で得られることがあります。さらに、96ウェルプレート中の酸化ストレス耐性アッセイを行うために使用される液体の総体積はPQ含有プレートを調製するために使用される量に比べて低いです。したがって、使用PQの量は、液体アッセイであり、安価なアッセイをレンダリングし、有害廃棄物の生産を制限する、低いです。しかし、プレートアッセイと比較して、このアッセイの制限はラを含みます液体アッセイにおける食品のCKと空気と比較して、液体中の酸​​素濃度が低いです。これらは、いくつかのケースでは、結果に影響を与える可能性がある重要な要因です。したがって、このアッセイで得られた結果を支持することが推奨される酸化ストレス耐性の他の方法を使用して再現性を確認しました。

<table><tbody><tr><td>寒天細菌学グレード</td><td>マルチセル</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>細菌学ペプトン</td><td>オキソイド</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム バイオテクノロジーグレード</td><td>バイオショップ</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>シグマ</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラピュアトリス 塩酸塩</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>トリスアミノメタン</td><td>バイオベーシックカナダ株式会社</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>サンタクルーズ</td><td>バイオテクノロジーsc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>バイオショップ</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>バイオベーシック株式会社</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>メチル ビオロゲン二塩化物水和物</td><td>Aldrich 化学</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 60 x15 mm</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>ピペット 10 ml</td><td>フィッシャー</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>シグマ</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>ディスカバリーv8ステレオツァイス顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルクリアマイクロタイタープレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flcn-1RNAiソース</td><td>アーリンガーライブラリ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

活性酸素種の産生と解​​毒の間の不均衡の結果である酸化ストレスは、心血管および神経変性疾患、糖尿病、老化、および癌を含む慢性ヒトの疾患、の主要な原因です。したがって、細胞系においても全生物を使用していないだけで酸化ストレスを研究することが重要である。C.エレガンスは、高度に進化的に保存されている酸化ストレスシグナル伝達経路の遺伝学を研究するための魅力的なモデル生物です。 ここでは、Cの酸化ストレス耐性を測定するためのプロトコルを提供します液体中のエレガンス 。簡単に言えば、そのようなパラコート（PQ）およびH 2 O 2などのROS誘導試薬はM9緩衝液に溶解され、溶液は、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに等分されます。シンクロナイズドL4 /若年成人C.エレガンス動物をウェルに転送される（5~8匹/ウェル）、生存率が測定されますほとんどのワームは死んでいるまで、毎時間。プレート内のストレッサーの低濃度を使用して、酸化ストレス耐性アッセイを行う場合には、高齢化は、データの誤った解釈につながる可能性が酸化ストレス、時に動物の行動に影響を与える可能性があります。しかしながら、本明細書に記載のアッセイで、この問題は、L4 /若い成体動物を使用しているので、発生しにくいです。また、このプロトコルは、安価であり、その結果、遺伝的スクリーニングのための魅力的なこの技術をレンダリング一日で得られます。全体的に、これは、酸化ストレスに関連するヒト疾患のより良好な特徴付けに変換することができ、酸化ストレスシグナル伝達経路を理解するのに役立ちます。

比較すると、野生型C.エレガンスはflcn-1（ok975）変異動物をここでは、野生型Cの抵抗を決定するために、100 mMのPQを使用しました酸化ストレス、熱、および無酸素23に抵抗することが示されているflcn-1（ok975）動物と比較してエレガンス 。処理の4時間後、野生型の48.3パーセントはflcn-1で77.8パーセント生存率（ok975）動物と比較して生存しました。予想されるように、flcn-1（ok975）変異動物は、野生型（ 図2および表1）と比較して、100mMのPQに対してより耐性でした。 制御EVまたはflcn-1のRNAi細菌を与えた野生型動物を比較します RNAiを用いflcn-1のダウンレギュ...

C. elegansは、酸化ストレス耐性に関与するシグナル伝達経路を研究するための魅力的なモデル生物です。ここでは、96ウェルプレートにいくつかの酸化剤を使用して、C.エレガンス動物の液相の酸化ストレス耐性を測定するためのプロトコルを提供します。

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

この手順の全体的な目的は、液体中のC. elegans（線虫）における酸化ストレスおよび耐性を測定することです。まず、パラコートなどのROS誘導剤をM9バッファーに溶解し、その溶液を96ウェルマイクロタイタープレートに分注します。次に、条件ごとに少なくとも12ウェルを使用し、同期させたL4後期線虫を各ウェルに5〜8匹ずつ移します。次に、解剖顕微鏡を用いて、ほとんどの個体が死亡するまで、1時間ごとに生存個体数と死亡個体数を測定します。最終ステップとして、酸化ストレス耐性試験を実施する少なくとも6日前までに、各条件における各タイムポイントでの生存個体率を算出します。MYOB培地を作成するため、modified young grins only bact PEPIN または MYOB dry mix を準備し、振盪して十分に混合してください。1リットルのMYOB培地を調製するには、6gのMYOB乾燥ミックスと17gのアガーを合わせ、H2Oで1リットルまでメスアップし、122°Cで45分間オートクレーブで滅菌します。滅菌操作を用いて、MYOB培地をプレートに分注し、室温で2日間乾燥させます。100mLのLB液体培地にe coliおよびOP 50細菌を接種し、37°Cで一晩培養します。その後、翌日に使用します。MYOBプレートにE coli OP 50細菌を播種し、室温で48時間培養します。RNA干渉によって遺伝子のダウンレギュレーションを行う場合は、まずM-Y-O-B-R-N-A-Iフィーディングプレートを調製して手順を開始してください。オートクレーブ後、MYOB培地を約55 °Cまで冷却します。次に、MYOB培地にイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）およびアンピシリンを添加します。プレートに分注し、室温で2日間乾燥させます。その後、アンピシリンとテトラサイクリンを含むアガープレートにE coli HT115菌をストリークします。一方の株には、コントロール空ベクター（ev）を発現するプラスミドを導入しています。もう一方の株には、FOLLINを標的とする二本鎖RNAを発現するプラスミドを導入しています。Mr.NAを37 °Cで一晩培養し、翌日に回収します。コロニーをピックアップし、アンピシリンを含むLB培地に接種します。培養物を37 °Cで一晩培養します。e coli HT one 15 EV菌またはHT one 15 Collin one RNAi菌を含むMYOB RNAiプレートを確認してください。プレートは使用前に室温で48時間保存してください。アッセイに必要な線虫の数に応じて数枚のプレートを準備し、20 °Cで6時間、線虫に産卵させます。次に、白金線ピックを用いて親虫を除去します。顕微鏡下でプレートを確認し、産卵数を評価します。卵を孵化

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルでは、測定する手法を提案...

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の酸化ストレス抵抗を測定

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