馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中

本プロトコルの総合的な目的は、ガンマシンチグラフィを用いて、注入後の標識骨髄間葉系幹細胞の分布と運命を非侵襲的に追跡することである。注入後の幹細胞の運命については、十分に解明されていない。この手法の主な利点は、投与後の幹細胞を複数の臓器にわたって非侵襲的に追跡できることと、A osteoの半減期が短いため、48時間以内に消失することが保証されることである。

これにより、自然発生的な腱障害の治療における幹細胞利用への知見が得られましたが、骨疾患や心疾患の治療研究にも応用可能です。一般的に、この手法を初めて行う方が直面する課題は、細胞の調整、標識用アセットの準備、および患者のセットアップです。細胞を直ちに適用する場合、まず固定した四肢に超音波伝達ゲルを塗布し、リニアプローブを用いて掌側中手骨領域全体を体系的にスキャンし、連続的な横断像および縦断像を取得して、最大損傷部位を特定します。

局所麻酔剤の投与後、植え込み部位をクロルヘキシジン外科用スクラブ溶液で5分以上洗浄し、続いてエタノールを浸したガーゼで拭き取ります。動物の準備が整い、手袋を着用したら、骨髄間葉系幹細胞の1×10⁷個の細胞分画を、骨髄上清1 mL中で遠心分離によりペレット化します。次に、18または19ゲージの針を装着した2 mLシリンジで上清を吸引し、チューブ内に約100 µLの溶液を残します。

上清を氷上のマイクロ遠心チューブに移し、軽く指で弾くようにして、残りの100 microlitersの上清で細胞を再懸濁させます。細胞が完全に再懸濁され、目に見える組織の塊がないことを確認してください。その後、細胞を室温に置きます。

次に、1 mLのテクネチウム過テクネチウム酸塩をH-M-P-A-Oのバイアルに加えて混合します。5分後、1 mLのシリンジと針を用いて、TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-Oの全量を間葉系幹細胞に投与します。その後、チューブにキャップをし、軽く指で弾いて細胞を混合させ、鉛遮蔽体の背後の室温にチューブを置きます。

30分後、ピンセットでチューブを開け、21ゲージの針を装着した1mLシリンジを用いて、細胞に1mLのPBSを加えます。チューブにキャップをし、細胞を混合します。次に、細胞を遠心分離し、2mLシリンジを用いて上清を「wash one」とラベルした遮光チューブに慎重に移します。

次に、先ほど示した方法で、別の1 mLのPBSを用いてペレットを洗浄します。2回目の洗浄後、洗浄液をW2とラベル付けした遮蔽チューブに移します。残ったPBSで細胞を十分に再懸濁し、プローブを針と平行に保持しながら、氷冷した骨髄上清のアリコートを加えます。

1.5インチまたは2インチの20ゲージ針を、病変中心部の最大損傷部位に、長軸方向に沿ってゆっくりと刺入します。次に、適切な遮蔽を行い、20ゲージ針を装着した2mLのルアーロックシリンジで細胞を吸引し、液体を損なわないよう注意しながら針を廃棄します。その後、シリンジを腱に留置した針に接続し、組織内の針の軌跡が明確に見えるように超音波プローブを針の下に配置し、ゆっくりと一定の速度で細胞を病変部へ注入します。

すべての細胞の投与が完了し、病変部に注入される液体が、高エコーの気泡を含む低エコー液体として超音波画像で確認できたら、針を抜去します。解析ソフトウェアの「acquire study selection」および「bone static」オプションを使用して、それぞれ60秒間の静止画を取得します。次に、指定された時間に、病変部、手根骨から遠位端まで、対側肢の同等領域、左肺野、および左甲状腺の側方画像を取得します。

次に、関心領域（ROI）選択ツールと楕円ツールを選択し、病変部位に合わせて選択マスクの形状を適切に調整します。最後に、「2つの統計量を追加」オプションを選択し、関心領域内のカウント数を取得します。この際、異なる時点における各個体で、同一サイズの関心領域が記録されるように注意してください。

病変内投与後、細胞は局所的な信号領域として観察され、時間の経過とともに周囲の腱組織への細胞の広がりは限定的となります。対照的に、指掌静脈を介した局所灌流で細胞を投与した場合、注入部位で信号の緩やかな減少が観察されます。時間の経過とともに、病変内注入後の肺野は通常陰性となりますが、初期の時点では、時間の経過とともに汎化する非常に局所的な信号が検出されることがあります。

この投与経路においても、甲状腺は陰性のままです。局所灌流では肺に局所的なシグナルが認められ、時間の経過とともに拡散しますが、そのシグナルは病変内投与経路で観察されたものに比べて著しく強くなります。甲状腺においても局所的なシグナルがしばしば認められるため、投与前（時刻0）における細胞の総初期放射性同位体計数、および関心領域における初回ガンマグラムの計数を示します。

注入後0分時点の値を基準として、注入後の各タイムポイントにおけるカウントの減少率を算出することで、初期カウントからのTC 99 Mの予測減衰を決定できます。これにより、注入後の各時点において注入部位に留まっている細胞の生存率（持続性）を算出することも可能です。この手順に続き、他の細胞投与経路を適用することで、分化後の間葉系幹細胞のホーミング能に関するさらなる疑問を検討することができます。

この手法は、地域医療分野の研究者が腱損傷における細胞保持率を向上させる方法を模索するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、細胞を標識し、異なる器官系における分布と濃度を記録する方法について十分に理解できるはずです。電離放射線を取り扱うことは極めて危険であり、本手順の実施にあたっては、個人用保護具、放射線モニター、鉛遮蔽などの予防措置、および汚染廃棄物の適切な処理が不可欠であることに留意してください。