2015年5月30日
ELISAが新しい定量的アプローチを提供することが説明されています。それは、シヌクレイノパシーのマウスモデル(M83)において、Ser129リン酸化されたα-シヌクレイン(αSD)またはタンパク質のC末端部分に対する抗体を用いて、疾患に関連するα-シヌクレインを特異的に検出します。
以下の実験の全体的な目標は、パーキンソン病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、定量的Elizaアプローチを使用して、疾患に関連するアルファシヌクレインの蓄積をモニターすることです。これは、まず、接種されていないマウスに通常に老化を許可するか、またはM 83の病気のマウスから脳の抽出物を脳内に接種することによって達成されます。マウスが臨床疾患を発症し、犠牲にされた後、マウスの脳領域を解剖します。
次に、各脳領域から均一物を高塩バッファーで調製し、均一物に対してElizaを行い、各脳領域における疾患に関連するアルファシヌクレインを定量化します。Elizaの結果は、アルファシヌクレインタンパク質の疾患に関連した形態が主に脳幹領域、中脳、脳幹、およびマウスの脊髄に蓄積していることを示しています。ウェスタンブロットや免疫組織化学など、以前から利用可能だった方法と比較して、このEliza技術の主な利点は、疾患に関連するアルファスレを迅速かつ信頼性高く定量化できることです。
この実験モデルでは、この方法は、このMA三マウスの中央神経系におけるこのタンパク質の蓄積と伝播をモニターするのに役立ちます。これは、臨床科学の発展まで脳のようなメカニズムが関与していることを示唆しています。この方法のさらなる開発は、将来的に、脳脊髄液や血液などの様々な生物学的サンプルの研究に考慮される可能性があります。この手順は、私たちの研究室の技術者によって実行されるでしょう。
動物に関わるすべての手順とプロトコルは、EC指令86 6 0 9 EECに従い、フランス国立委員会によって承認されました。倫理と動物実験に関する考慮事項として、動物は、マウスの安楽死と脳および脊髄の回収後、Leon YoungのA and S'Sが承認した実験施設で飼育され、世話を受けました。テキストプロトコルに従って、氷の上で低倍率の拡大下、ペトリ皿に全脳を置きます。
まず、一つの嗅球を分離するために、嗅球のすぐ後ろに鉗子を置きます。下方向に動かして脳から剥がし、同様の方法で二つ目の嗅球を除去します。次に、鉗子で脳を固定しながら、左右の皮質の間に鉗子を軽く差し込み、前方へ動かして二つの半分を分離します。
次に、脳を固定し続けながら、皮質を二ミリメートル後ろに配置し、上方向に圧力をかけ、皮質を海馬から持ち上げます。次に、海馬から前方へ向かって、皮質の最初の部分をはがします。
次に、二つ目の半分についても繰り返します。次に、一つの海馬の周りに鉗子を配置し、器官の底部で鉗子をゆっくりと閉じ、それを取り除きます。
次に、二つ目の海馬についても繰り返します。鉗子を一つの条状体の後ろに配置し、それを脳から軽く分離します。鉗子を使用して、条状体から残りの皮質を除去した後、二つ目の条状体を除去します。鉗子を使用して、小脳を残りの脳から分離します。鉗子を小脳の後ろに置き、鉗子の幅広い部分を持ち上げて、小脳の輪郭を優しく押し下げます。
次に、鉗子を小脳の後ろに置き、鉗子を前方へ動かして取り除きます。頭脳は四つの丸い構造で構成されており、脳幹が接続している場所を明確に見るのに役立ちます。次に、接続部の垂直切開を行い、脳幹を取り除きます。中脳の背後に鉗子を配置し、サイズを垂直にし、残りの脳から完全に分離します。脳の均一物を準備するために、解剖した脳領域に十分な量のHSバッファーを加えて、下記の表に示す予想される均一物パーセントに達するようにします。
シリカガラス管と管用ピストンAとBで構成された組織グラインダーを使用して、破砕する脳領域を管に注ぎます。次に、ピストンAで組織を10回ホモジナイズして分離します。次に、ピストンBに切り替えてさらに20回ホモジナイズします。
移送ピペットを使用して、ホモジネートの1.5ミリリットル管に転送し、残りの脳サンプルでホモジナイズを繰り返します。4度のセルシウスで5分間1000Gでサンプルを遠心分離し、その後、スナットを集めて200マイクロリットルのアリワットに分割します。後続のエライザ分析のために、マイナス80度のセルシウスで保存します。脳のホモジネートでエライザを実行します。
まず、50マイクロモーラーの炭酸塩バッファーを使用して、コーティング抗アルファシヌクレイン、ウサギのポリクローナルまたはモノクローナルクローン42抗体を0.01ナノグラム/ミリリットルに希釈し、100マイクロリットルの抗体コーティング溶液で、96ウェルのマイクロプレートのウェルをコーティングし、4度のセルシウスで一晩インキュベートします。翌日、各ウェルに300マイクロリットルのPBSTを加え、プレートウォッシャーを使用して室温で5回洗浄します。
次に、各ウェルに200マイクロリットルのT 20 PBSブロッキングバッファーを加え、プレートを150RPMで1時間振とうし、その後、PBSTを使用してプレートを5回洗浄します。PBST 1%BSAで脳のホモジネートを希釈し、ここにリストされているガイドラインに従って、各ウェルに100マイクロリットルを加えます。次に、室温で150RPMで2時間インキュベートし、その後、PBSTを使用してプレートを5回洗浄します。最後の洗浄の後、必要なアルファシヌクレイン検出抗体をPBS BSTと1%BSAで希釈し、テキストプロトコルの表2にリストされている通り、室温で150RPMで1時間インキュベートし、その後、PBSTを使用してプレートを5回洗浄します。
次に、マウスまたはウサギのIgG HRPコンジュゲートを1対8,000に希釈し、PBST 1%BSAに加え、150RPMで1時間インキュベートし、その後、PBSTを使用してプレートを5回洗浄します。次に、各ウェルに100マイクロリットルのTMB溶液を加え、150RPMで15分間暗所でインキュベートします。反応を停止するために、各ウェルに100マイクロリットルの1ノルマル塩酸を加えます。
次に、マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルでの吸光度を測定し、データ分析を行います。ブランクのウェルに含まれる光密度値を光密度から差し引いてください。バッファーと試薬のみが含まれています。
この研究における脳サンプルから得られた値は、テキストプロトコルに従って統計分析を行いました。エライザは、老齢のM 83の脳のホモジネートにおいて、若齢のM 83のマウスでは存在しない、疾患に関連するpSer 1 29アルファシヌクレインを特定して識別しました。追加の抗体テスト、例えばLB 5 0
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本研究では、シヌクレイノパチーの導入マウスモデルにおいて、疾患に関連するα-synucleinを検出するための新しい定量的なELISA法を提示します。この手法により、疾患の進行に伴うさまざまな脳領域におけるα-synucleinの蓄積をモニタリングすることが可能になります。
疾患に関連するα-synucleinの定量的な検出は、シヌクレイノパチーの創薬におけるターゲットバリデーションのリスク低減において極めて重要です。ELISAベースのアプローチにより、脳の各領域における迅速かつ信頼性の高い定量が可能となり、前臨床プログラムにおけるgo/no-go判断を支援します。本手法は、メカニズム研究や治療介入の追跡のためのスケーラブルで再現性のあるリードアウトを提供することで、予測の信頼性を向上させます。
ELISA法は、ターゲットの検証から前臨床段階での有効性試験に至る創薬の連続的なプロセスに組み込むことができ、α-synucleinを調節する化合物の反復的な評価を可能にします。