Name: ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学ぶTetONシステムを用いたゼブラフィッシュ尾びれ再生における組織特異的遺伝子発現の制御法。ドキシサイクリン誘導と免疫蛍光法で可視化し、再生医療研究への応用可能性を示す。

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著者は、技術支援のためのクリスタハーゼ、ドリス·ウェーバーとブリジットKorteの感謝します。ワイディンガーラボでの仕事はドイツ学術協会WE 4223 / 3-1の補助金によってサポートされ、4223 / 4-1とドイツゲゼルシャフトエリーゼKardiologieオスカー·ラップ·Stipendiumを経由し、クラウス·ゲオルクウント·Sigrid-によりWE Hengstberger-Forschungsstipendium。

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<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
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<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

大人のゼブラフィッシュは、正常に多くの内臓や付属を再生する驚くべき能力を持っています。関与する分子·細胞メカニズムの完全な理解は、遺伝子の機能とシグナル伝達経路の組織特異的な分析が必要です。この方に、ティトンシステムは、胚および成体ゼブラフィッシュにおける時空間的制御遺伝子発現のための効率的なツールを提供します。この原稿に記載されテトン·システムの構成および方法論は成功し、我々の研究室3の最近の研究で使用されてきました。テトンシステムを確立するときに、次の追加の問題を考慮する必要があります。 TetActivator導入遺伝子の設計上の考慮事項 我々は以前、私は、単純ヘルペスウイルスのVP16トランス活性化ドメイン誘導体3F [irtTAM2（3F）と融合させ、逆TetリプレッサードメインのM2突然変異体からなるその単一の誘導性TetActivatorを示していますnは短いたTetA-M2]効率的な誘導を付与するが、低表示することができ、測定可能な漏出はいえ、それがドキシサイクリン<s...

ゼブラフィッシュは、開発、生理学、疾病、および再生の多くの側面を研究するための十分に確立された脊椎動物のモデル生物です。後胚生物学的プロセスのモデルとしてゼブラフィッシュの成長採用により、遺伝子発現またはシグナル伝達経路の誘導性、組織特異的な操作のための実験的なツールは、ますます重要になってきました。特に、成人のゼブラフィッシュにおける臓器や付属物の再生への研究は、これらの再生プロセスの間、シグナル伝達経路の時空間的な要件の解剖のためのツールの不足に苦しんでいます。 のCre-lox系、トランスポゾン媒介体形質転換を用いて、熱ショック誘導性導入遺伝子のモザイク発現、及びティシステム1：現在、三つの異なるシステムが成体ゼブラフィッシュの器官の再生の条件、組織特異的遺伝子発現を達成するために使用されています-3。ティトンはテトラサイクリン続きの変種を指します発現は、抗生物質テトラサイクリンまたはその誘導体、 例えば、ドキシサイクリンの存在下で活性化されたロール転写活性化システム。それまで成魚に使用されているようのCre-lox系は、その発現が空間的に組織特異的調節エレメントによって制限されているタモキシフェン制御Creリコンビナーゼ（CreERT2）に依存しています。 STOPカセットのCreドリブン除去は、全ての細胞型1でアクティブであるべきであるプロモーターによって駆動される目的の遺伝子の発現を促進します。モザイク状に発現体細胞導入遺伝子のトランスポゾン媒介性の作成は、個々の細胞系統における誘導性導入遺伝子発現のためのシステムを提供します。一般的にのみ再生臓器2の離散的な細胞系統に導入遺伝子を有するキメラ個体においてヒートショックプロモーター結果の転写制御下に目的の遺伝子を運ぶのTol2トランスポゾンとゼブラフィッシュ胚の注入。両方のシステムは、条件付き組織-SPEを可能にしながら、cific遺伝子発現、のCre-lox系は可逆的ではない、とトランスポゾンクローンの標識を使用しての戦略は、その確率的性質に苦しんでいます。このように、私たちと他の人は最近、時間的に容易に、ゼブラフィッシュで使用するためのトランスジェニックテトン·システム、および添加調整可能と可逆3-5にある空間的に制御された遺伝子発現を適応しています。 ここで使用されるティシステムは、ドキシサイクリン（DOX）誘導性転写活性化因子（改善されたリバーステトラサイクリントランスアクチベーター、irtTA、短いたTetA）は、トランスジェニックドライバ行（TetActivator）を含む組織特異的ゲノム調節配列の制御下にあります。 （ 図1A）;第二に、テトラサイクリンオペレーター（TetREのTet応答エレメント）の転写制御下で目的の遺伝子を保有するトランスジェニックレスポンダライン（TetResponder）が必要です。したがって、TetActivatorとTetResponderラインの特定の組み合わせの使用が条件付き組織特異することが可能遺伝子発現のFIC操作。 我々は最近、ゼブラフィッシュテールフィン3を再生成人におけるWnt /β-カテニンシグナル伝達の組織特異的機能を探索するためにテトンシステムを利用してきました。ここで説明したプロトコルでは、フィン再生の研究のために、特に、ゼブラフィッシュにおけるテトンシステムのセットアップおよび使用のための作業の流れを説明します。これは、安定したトランスジェニックTetActivatorとTetResponderラインと胚および成体ゼブラフィッシュにおける導入遺伝子の誘導のためのプロトコルを生成する方法の詳細な手順が含まれています。さらに、我々は、成体ゼブラフィッシュフィンの凍結切片の調製のためのプロトコルを含むフィン再生成における組織特異的遺伝子発現の検証のための技術を説明します。さらに、当社はTetActivator導入遺伝子の設計、遺伝子導入方法の選択、およびTetResponder発現の検出のための考慮事項について説明します。したがって、このプロトコルの全体的な目標は、設計図として機能しますセット·アップ機能ティシステムのゼブラフィッシュの関心の任意の組織に適用することができる条件組織特異的遺伝子発現を達成するために。 我々は、（エンハンサー断片;ワイディンガーラボのプラスミドデータベースはありません1247; 図1B）の短いゲノム調節配列を用いて、安定したTetActivatorラインのI-SceIでまたはTol2の媒介性の発生を可能にするTetActivatorベクトルを作成しました。この構築物は、単純ヘルペスウイルスのVP16トランス活性化ドメイン誘導体3F [irtTAM2（3F）]と融合リバースTetリプレッサードメインのM2突然変異体からなるTetActivatorカセットを含みます。それは、同じオープンリーディングフレームからフルオロフォアAmCyanと共発現されているのでTetActivatorエチレンテトラミン（TETA）の発現を容易に監視することができます。 1比5,6：P2Aペプチドは1で別々のタンパク質としてたTetAとAmCyanの産生をもたらすべきであるリボソームスキッピングを媒介します。構築物はまた、Tのpoylinker 5 &#39;を含みます従来のクローニング方法を用いて、対象のゲノム調節配列の挿入を容易にするetActivatorカセット。 、細菌人工染色体（BAC）に再結合することができる（大きなゲノム領域を含む;さらに、我々は、上記のTetActivatorカセットプラスカナマイシン選択カセットからなる構築物（ 図1C。ワイディンガーラボプラスミドデータベースなし1180）作成しました通常発現パターン）導入遺伝子によって模倣される遺伝子の開始コドンに。両方の構築物は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。

<table><tbody><tr><td>ブリーディングボックス</td><td>アクアシュワルツ</td><td>アクアボックス 1</td><td></td></tr><tr><td>化合物蛍光顕微鏡</td><td>(例:ライカ、ツァイス</td>) <td>蛍光組織切片を画像化するために</td><td>メーカーによって異なります</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>(例:ライカ、ツァイス</td>)は、<td>蛍光組織切片を画像化するために</td><td>メーカーによって異なります</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>(例:ライカ、サーモサイエンティフィック</td><td>)は、</td><td>クライオセクショニングの</td>メーカー</tr><tr><td>4', 6- ジアミジノ-2-フェニルイノドール (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>核の可視化に PBS で 1/5,000 を使用</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td> TetResponder 誘導パラホルムアルデヒド (PFA) Sigma-Aldrich P6148 <td>のために 50% EtOH で 50 mg/ml (97 mM) でストックを調製</td></tr>します。<tr><td></td><td></td><td></td><td>PBS中の4%(w / v)パラホルムアルデヒド、固定用pH 7.5 </td></tr><tr><td>1xホスファット緩衝生理食塩水(PBS)</td><td></td><td></td><td>1.7 mM KH2PO4、5.2 mM Na2HPO4、150 mM NaCl、 pH 7.5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS with 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus 接着顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>組織切片の収集のための</td><td>1014356190</td></tr><tr><td>実体蛍光顕微鏡</td><td>(例:ライカ、ツァイス</td>) <td>蛍光ベースのジェノタイピングについては</td><td>メーカーによって異なります</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>(例:Biorad、Applied Biosystems)</td>は<td>、PCRベースのジェノタイピングについては</td><td>メーカーによって異なります</td></tr><tr><td>組織凍結培地(TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td> 組織<td>埋め込み用サンプル</td></tr><tr><td>トリカイン(L-エチル-m-アミノ-安息香酸-メタンスルホン酸/ MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>麻酔用 E3胚培地で1 mg / mlで使用</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発達、生理学、病気、および組織再生を研究するための非常に重要なモデル生物となっています。関与する分子および細胞メカニズムを完全に理解するには、遺伝子発現またはシグナル伝達経路の組織特異的な操作を可能にする実験的ツールが必要です。そこで、私たちや他の人々は最近、テトラフィッシュで使用するためにTetONシステムを採用しました。TetONシステムは、時間的および空間的に制御された遺伝子発現を促進し、最近では、ゼブラフィッシュの尾びれ再生中のWnt/β-カテニンシグナル伝達の組織特異的な機能を調べるためにこのツールを使用しました。ここでは、TetONシステムを使用して、成体の再生ゼブラフィッシュ尾びれに組織特異的な遺伝子発現を誘導するためのワークフローについて説明します。これには、安定したトランスジェニックTetActivatorおよびTetResponder系統の作製、導入遺伝子の導入、およびフィン再生における組織特異的遺伝子発現の検証技術が含まれます。したがって、このプロトコルは、ゼブラフィッシュに機能的なTetONシステムを設定し、その後の使用、特にヒレの再生を研究するための青写真として機能します。

組織特異的な誘導性遺伝子発現、トランスジェニックTetActivatorとTetResponderラインのための機能テトンシステムを確立するために生成された（ 図1A）する必要があります。初期のゼブラフィッシュ胚およびその後の生殖系列の統合に構築またはTetResponder（ 図1E） -これはTetActivator（C図1B）を微量注入することによって達成されます。機能TetActivator構築物のいずれか、または目的の遺伝子（ 図1C）の調節エレメントを含むBACにTetActivatorカセットを再結合することによってTetActivatorカセット（ 図1B）の上流の短い調節配列（エンハンサーエレメント）をクローニングすることによって生成することができます。 TetActivator構築物の生殖細胞系列の統合は、個人が予想される発現パターン（ 図1D）にG0魚とF1胚におけるAmCyan蛍光の出現を注入異系交雑することによ...

ここでは、TetONシステムを使用して、再生する成体のゼブラフィッシュの尾びれに組織特異的な遺伝子発現を達成するためのワークフローを概説します。

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュにおいて機能的なTED-onシステムを構築し、本ビデオで示す再生尾鰭のような条件付き組織特異的遺伝子発現を実現することです。これは、まず、目的の組織でam cyanタグ付きテトラサイクリン誘導性転写活性化因子を発現するTetアクティベーター導入系統と、Tet応答エレメントの制御下でypeタグ付き目的遺伝子を持つTetレスポンダー導入系統を作製することで達成されます。次に、TetアクティベーターとTetレスポンダーを併せ持つ特定の組み合わせのダブルトランスジェニック魚を確立させます。次に、ドキシサイクリンを投与することで、組織特異的なTetレスポンダー導入遺伝子の発現を誘導します。最後に、鰭の再生部位の組織切片を作製し、Tetレスポンダー導入遺伝子の発現を確認します。最終的に、免疫蛍光染色を用いて、組織特異的なTetレスポンダー導入遺伝子の発現を可視化します。ヒートショック誘導性遺伝子発現などの他の手法に対する本手法の主な利点は、組織特異的な方法で誘導可能かつ可逆的な遺伝子発現が可能である点です。この手法により、個々の組織におけるシグナル伝達経路と遺伝子機能の解析が可能になるため、ゼブラフィッシュの鰭の再生を制御する分子シグナリングネットワークについて、より深い理解を得ることができます。本研究ではこの技術をゼブラフィッシュの鰭の再生研究に用いていますが、組織特異的な遺伝子機能の操作を必要とする他の多くの状況においても有用です。テキストプロトコルに従ってTetレスポンダー魚ラインを構築した後、個々のG zero魚をあらかじめ確立したTetアクティベーターラインと交配させ、トランスジェンの生殖細胞系への組み込みと誘導能を評価します。次に、胚を回収し、Tetレスポンダーの誘導を確認できる段階まで育成します。50%エタノールを用いてドキシサイクリンを溶解し、濃度が50 mg/mLとなるように調製して、2000 x ドキシサイクリンストック溶液を作成します。分注したdocksを遮光し-20°Cで保存します。次に、docksの最終濃度を25 µg/mLとしたE3胚培養液を調製します。その後、胚からE3培養液の大部分をデカンテーションにより除去します。これをE3培地を含む溶液に交換し、胚を28.5 °Cで最低6時間戻します。インキュベーション後、蛍光実体顕微鏡を用いて、YFP蛍光を発する胚をスクリーニングします。特定されたファウンダー個体から、いくつかの安定したトランスジェニックTetレスポンダーラインを確立します。期待される発現領域内で強く誘導され、モザイク現象が少なく、個々の胚間での個体差が小さい系統を選択してください。TEDアクティベーター魚系統とTetレスポンダー魚系統が確立されたら、TetアクティベーターキャリアとTetレ

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は条件付きで大人のゼブラフィッシュヒレ再生時の標的タンパク質の発現をノックダウンする方法を説明します。この手法は、マイクロ注入と創傷治癒、芽の形成、再生伸長を含むフィン再生の様々な段階におけるタンパク質の役割をテストすることができ、フィン組織にアンチセンスオリゴヌクレオチドmorpholinosをelectroporatingが含まれます。...

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

脊髄切断後、大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって機能回復を持っている。幼虫の透明性と迅速な復旧を活用するために、我々は、幼虫の脊髄を離断するための方法を提示する。切断後、我々は、3日後に傷害によって2日後の傷害、およびC-曲がり動きで始まる感覚の回復を観察します。...

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

そのような遺伝子特異モルホリノの脳室内注射を用いた組織再生などの開発および生理学的恒常性の後期段階の間に遺伝子機能を評価するためのゼブラフィッシュに適応逆遺伝学的方法。...

ゼブラフィッシュの幼虫の複数の困難な標的組織をトランスフェクションするために心室インジェクションを用いた遺伝子モルホリノアプローチを逆転

ゼブラフィッシュの成体の神経新生と再生の細胞的および分子的メカニズムを明らかにするために、ゼブラフィッシュの成体終脳に機械的損傷を引き起こす侵襲的手術と、その後の免疫組織化学またはin...

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

ここでは、ゲンタマイシン注射による急性腎障害を誘発することにより、成人の腎臓再生を研究するための信頼性の高い方法を紹介します。損傷はゲンタマイシンの投与量と環境温度に依存することを示し、in situハイブリダイゼーションを使用してlhx1a...

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

私たちは、明視野ベースの立体顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の尾びれの再生のダイナミクスを全組織スケールで捉えるためのプロトコルを提示します。この技術により、単一細胞の分解能で再生ダイナミクスを捉えることができます。この方法は、CCDカメラとタイムラプスソフトウェアを搭載したあらゆる実体顕微鏡に適用できます。...

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。...

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

成体ゼブラフィッシュの機械的脳損傷モデルを用いて、ゼブラフィッシュの高い再生能力を調節する分子機構を調べることが記載されている。この方法は、蛍光免疫染色を用いて再生応答を評価するために、複数の種の小魚の視蓋に刺創損傷を作り出すことを説明している。...

ゼブラフィッシュとメダカを用いた成体視神経筋の刺創損傷モデルによる再生能力の比較解析

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。...

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

学ぶTetONシステムを用いたゼブラフィッシュ尾びれ再生における組織特異的遺伝子発現の制御法。ドキシサイクリン誘導と免疫蛍光法で可視化し、再生医療研究への応用可能性を示す。

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

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