ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

この手順の全体的な目標は、このビデオの再生尾びれで示されているように、ゼブラフィッシュの組織特異的な遺伝子発現を条件付きで達成するための機能的なTEDオンシステムを設定することです。これは、まず、目的の組織でアムシアンでタグ付けされたテトラサイクリン誘導性転写活性化因子を発現するTetアクチベータートランスジェニック系統と、Tet応答要素の制御下で目的のypeタグ遺伝子を含むTetレスポンダー株を生成することによって達成されます。次に、テトアクチベーターテットレスポンダーダブルトランスジェニックフィッシュの特定の組み合わせが確立されます。

その後、組織特異的なTetレスポンダー導入遺伝子の発現がドキシサイクリンの投与により誘導されます。最後に、Tetレスポンダー導入遺伝子の発現は、ここでフィン再生の組織切片を調製することにより検証されます。最終的に、免疫蛍光法を使用して、組織特異的なTetレスポンダー導入遺伝子発現を可視化します。

熱ショック誘発性遺伝子発現などの他の方法に対するこの技術の主な利点は、システム上の証書により、組織特異的な方法で誘導性および可逆性の遺伝子発現が可能になることです。この方法は、個々の組織におけるシグナル伝達経路と遺伝子機能の解析を可能にするため、Sフィッシュフィンの再生を導く分子シグナル伝達ネットワークをより深く理解するのに役立ちます。この技術を用いてゼブラフィッシュのヒレの再生を研究していますが、遺伝子機能の組織特異的な操作を必要とする他の多くの状況にも役立つ可能性があります。

テキストプロトコルに従ってTetレスポンダーフィッシュラインを作製した後、個々のGゼロフィッシュを以前に確立されたTetアクチベーターラインと交配することにより、導入遺伝子の生殖細胞系の統合と誘導性を評価します。次に、胚を採取し、テトレスポンダー誘導を評価できる段階まで育てます。50%エタノールを使用してドックを溶解し、50ミリグラム/ミリリットルの濃度に到達して、2000 x ドキシサイクリンストック溶液を調製します。

マイナス20°Cの光から保護されたドックのアリコートを保管してください。次に、最終濃度が25マイクログラム/ミリリットルのドックを含むE 3つの胚培地を調製します。次に、胚からE 3培地の大部分をデカントします。

E 3培地を含むdosと交換し、胚を摂氏28.5度に最低6時間戻します。インキュベーション後、蛍光実体顕微鏡を使用して、Yペットの蛍光について胚をスクリーニングします。特定したばかりの創業者からいくつかの安定したトランスジェニックTetレスポンダーラインを確立します。

強く誘導し、予想される発現領域内でモザイク現象をほとんど示さず、個々の胚間の変動もほとんどない系統を選択してください。TEDアクチベーターとテトレスポンダーの魚の系統が確立されたら、テトアクチベーターキャリアとテトレスポンダーキャリアを作成して、ダブルトランスジェニックを生成します。魚は、実体顕微鏡でアムシアン蛍光をスクリーニングすることにより、テト活性化因子導入遺伝子を持つ胚を選択し、アムシアン陽性の胚を成体期に育てます。

PCRベースのジェノタイピングにより、または目的の組織でテトレスポンダーの発現を誘導する能力により、Tetアクチベーターに加えてTetレスポンダーを保有する二重トランスジェニック成魚を同定し、テールフィンテーションを実施しますトリカ1ミリリットルあたり160マイクログラムの魚水で満たされたビーカーで成魚の成魚を麻酔します。魚の動きが止まったら、ピンセットを使用して逆さのシャーレに慎重に移し、メスを使用して尾びれの部分的な切断を行い、ドキュメントで治療します。ドキシサイクリン1ミリリットルあたり25マイクログラムを含む1リットルの魚系水で飼育ボックスを準備します。

ネガティブコントロールとして、ドキシサイクリンの代わりに250マイクロリットルのエタノールを繁殖箱に追加し、1リットルの魚類システム水を使用して、各繁殖箱に最大10匹のダブルトランスジェニック魚を移し、ボックスを暗闇に置いてストレスを軽減します。最低6時間後、麻酔をかけ、処理した魚を濡れたアロスコーティングされた皿に移し、ピンセットを使用して尾を広げます。次に、蛍光顕微鏡下で、再生組織内のY PETの出現について魚をスクリーニングします。

その後、魚はさらなる治療に使用したり、魚の飼育システムに戻したりして、部分的なフィン切断後のレスポンダー導入遺伝子誘導を終了し、最初の切断面に近位の約4〜5つの骨セグメントで再切断フィンが再生し、このビデオで以前に説明したように、ピンセットを使用し、組織の切り株部分のみを処理する実験設定に応じて、 PBS中のPFAの体積あたり4%の重量を含む小さなペトリ皿で再生する組織を慎重に置き、翌日摂氏4度で一晩固定します。PBSを使用して再生物を2回洗浄してから、0.5モルのE-D-T-A-P-B-Sに移し、骨基質を摂氏4度で一晩で脱灰します。次に、再生したものをスクロースPBSシリーズで室温でそれぞれ30分間インキュベートし、最後に等量の30%スクロースPBSと組織凍結培地をさらに30分間インキュベー

フィンを組織凍結培地に移し、摂氏4度で少なくとも2時間インキュベートします。次に、クライオ型を顕微鏡スライドに置き、組織凍結培地を充填します。再生物をクライオ型に移し、組織を向き付けて縦断または横断面を取得します。

切片化を容易にするために、再生がまっすぐであることを確認してください。顕微鏡スライドと一緒に、クライオ型をドライアイスのベッドに置かれた金属ラックに移し、凍結プロセスを開始します。媒体が固体になったら、クライオ型を室温に戻して、媒体をプラスチック媒体界面で解凍します。

次に、ペンなどの器具を使用して、凍結したブロックをクライオ型から押し出し、クライオミクロトームで切片化するまでマイナス80°Cで保存します。接着顕微鏡スライドに10〜14マイクロメートルの切片を採取し、必要になるまでスライドをマイナス20°Cで保管します。フィン切片でのテットレスポンダー発現を特徴付けるには、切片を100%MEOHで摂氏マイナス20度に冷やした切片を30分間処理します。

ペーパータオルを使用して液体を慎重に取り除きます。次に、切片をPBTで2回、PBSで1回、それぞれ5分間洗浄します。切片をダッピーで10分間インキュベートしてから、PBSを使用してそれぞれ10分間2回洗浄します。

次に、Antifa封入剤とカバースリップを使用してサンプルをマウントし、共焦点顕微鏡または広視野蛍光顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュのシステム上に機能的なTETを確立したサンプルをイメージングします。このシステムは、個々の組織における遺伝子またはシグナル伝達経路の機能の試験に使用できます。ここに示すように、HER 4.3プロモーター駆動のテットアクチベーターは、再生YFPの組織のサブセットでのみTEDレスポンダーの発現を誘導し、増殖性の近位ブラサで蛍光が検出され、遠位ブラサと表皮は発現を欠

WINTβ-カテニン拮抗薬の発現は、ブラサの増殖細胞を含むHER4.3ドメインの1つで作用し、驚くべきことに再生細胞の増殖に影響を与えません。このことは、増殖性近位芽球における風ベタインとシグナル伝達が、芽球ML細胞増殖の調節に本質的な役割を果たさないことを示唆しています。これに対し、ユビキチンプロモーター駆動のTetアクチベーター系統を用いて、ヒレ再生の全組織でアキシン1の発現を誘導すると、再生細胞の増殖を強く阻害します。

さらに、骨芽細胞を含まないHER4.3ドメインにおける軸索1の発現は、再生における骨形成を強く妨げます。したがって、TE on システムを使用した風シグナル伝達に対する組織特異的な干渉は、細胞増殖と骨再生の調節における風シグナル伝達の予期しない間接的な機能を明らかにします。一度習得すると、この技術は、関心のある任意の組織で誘導可能な標的遺伝子発現に使用できます。

この手法を応用して、再生中のSフィッシュテールフィンにおける風床ニコチンシグナル伝達の組織特異的な機能を調べることに成功しました。この方法を使用すると、組織再生を制御する分子決定要因をより包括的に理解するのに役立ちます。