ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュにおいて機能的なTED-onシステムを構築し、本ビデオで示す再生尾鰭のような条件付き組織特異的遺伝子発現を実現することです。これは、まず、目的の組織でam cyanタグ付きテトラサイクリン誘導性転写活性化因子を発現するTetアクティベーター導入系統と、Tet応答エレメントの制御下でypeタグ付き目的遺伝子を持つTetレスポンダー導入系統を作製することで達成されます。次に、TetアクティベーターとTetレスポンダーを併せ持つ特定の組み合わせのダブルトランスジェニック魚を確立させます。

次に、ドキシサイクリンを投与することで、組織特異的なTetレスポンダー導入遺伝子の発現を誘導します。最後に、鰭の再生部位の組織切片を作製し、Tetレスポンダー導入遺伝子の発現を確認します。最終的に、免疫蛍光染色を用いて、組織特異的なTetレスポンダー導入遺伝子の発現を可視化します。

ヒートショック誘導性遺伝子発現などの他の手法に対する本手法の主な利点は、組織特異的な方法で誘導可能かつ可逆的な遺伝子発現が可能である点です。この手法により、個々の組織におけるシグナル伝達経路と遺伝子機能の解析が可能になるため、ゼブラフィッシュの鰭の再生を制御する分子シグナリングネットワークについて、より深い理解を得ることができます。本研究ではこの技術をゼブラフィッシュの鰭の再生研究に用いていますが、組織特異的な遺伝子機能の操作を必要とする他の多くの状況においても有用です。

テキストプロトコルに従ってTetレスポンダー魚ラインを構築した後、個々のG zero魚をあらかじめ確立したTetアクティベーターラインと交配させ、トランスジェンの生殖細胞系への組み込みと誘導能を評価します。次に、胚を回収し、Tetレスポンダーの誘導を確認できる段階まで育成します。50%エタノールを用いてドキシサイクリンを溶解し、濃度が50 mg/mLとなるように調製して、2000 x ドキシサイクリンストック溶液を作成します。

分注したdocksを遮光し-20°Cで保存します。次に、docksの最終濃度を25 µg/mLとしたE3胚培養液を調製します。その後、胚からE3培養液の大部分をデカンテーションにより除去します。

これをE3培地を含む溶液に交換し、胚を28.5 °Cで最低6時間戻します。インキュベーション後、蛍光実体顕微鏡を用いて、YFP蛍光を発する胚をスクリーニングします。特定されたファウンダー個体から、いくつかの安定したトランスジェニックTetレスポンダーラインを確立します。

期待される発現領域内で強く誘導され、モザイク現象が少なく、個々の胚間での個体差が小さい系統を選択してください。TEDアクティベーター魚系統とTetレスポンダー魚系統が確立されたら、TetアクティベーターキャリアとTetレスポンダーキャリアを交配させ、ダブルトランスジェニック個体を作製します。実体顕微鏡を用いてam cyan蛍光のスクリーニングを行い、Tetアクティベーター導入遺伝子を持つ胚を選択し、am cyan陽性の胚を成魚まで育成します。

PCRベースのジェノタイピング、または目的の組織においてTetレスポンダーの発現を誘導できる能力によって、Tetアクティベーターに加えてTetレスポンダーを保持している二重トランスジェニック成魚を特定し、尾鰭（びき）の処置を行います。160 µg/mLのトリカインを含む魚用飼育水を入れたビーカー内で、成ゼブラフィッシュを麻酔します。魚の動きが止まったら、ピンセットを用いて慎重に転倒させたペトリ皿へと移し、メスを用いて尾鰭の一部を切断し、ドキシサイクリンで処理します。25 µg/mLのドキシサイクリンを含む1 Lの魚用システム水で、繁殖ボックスを準備します。

陰性対照として、1 Lの魚用システム水が入った繁殖ボックスに、ドキシサイクリンの代わりに250 µLのエタノールを添加します。最大10匹のダブルトランスジェニック魚を各繁殖ボックスに移し、ストレスを軽減するためボックスを暗所に置きます。最低6時間後、処理した魚を麻酔し、濡らしたアロスコーティング済みのディッシュに移し、ピンセットで尾を広げます。次に、蛍光顕微鏡下で、再生組織内にY PETが出現しているかをスクリーニングします。

その後、魚をさらに別の処理に使用するか、あるいは魚の飼育システムに戻して、部分的な鰭の切断とドキシサイクリン処理に続くレスポンダー導入遺伝子の誘導を終了させます。ビデオで先に説明した通り、実験設定に応じた時点において、ピンセットを用いて組織の切り株部分のみを扱い、最初の切断面から近位に4〜5個の骨節がある状態で鰭の再生部を再切断します。再生組織を、PBSに含まれる4% (w/v) PFAが入った小型ペトリ皿の中に慎重に平らに置き、4°Cで一晩固定します。翌日、PBSで再生組織を2回洗浄した後、0.5 M EDTA-PBSに移し、4°Cで一晩かけて骨マトリックスを脱灰します。次に、再生組織を室温で、ショ糖PBS系列の各溶液に30分ずつインキュベートし、最後に30% ショ糖PBSと組織凍結剤を等量混合した溶液でさらに30分間インキュベートします。

鰭を組織凍結培地に移し、4 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。次に、クライオモールドを顕微鏡スライドガラス上に配置し、組織凍結培地を満たします。再生部位をクライオモールドに移し、縦断切片または横断切片が得られるように組織の方向を調整します。

切断しやすくするため、再生体が真っ直ぐであることを確認してください。顕微鏡スライドとともに、凍結プロセスを開始させるため、ドライアイスの上に置いたメタルラックにクライオモールドを移します。培地が固まったら、クライオモールドを室温に戻し、プラスチックと培地の界面で培地を融解させます。

次に、ペンなどの器具を用いて、凍結ブロックをクライオモールドから押し出し、クライオミクロトームで薄切するまで-80 °Cで保存します。10～14 µmの切片を密着スライドガラスに回収し、使用するまで-20 °Cで保存します。鰭の切片におけるTetレスポンダーの発現を特性評価するには、-20 °Cに冷却した100% MEOHで切片を30分間処理します。

ペーパータオルを用いて液体を注意深く除去します。その後、切片をPBTで2回、PBSで1回、それぞれ5分間ずつ洗浄します。切片をDAPIに10分間浸漬した後、PBSを用いて10分間ずつ2回洗浄します。

次に、Antifade封入剤とカバーガラスを用いてサンプルを封入し、ゼブラフィッシュにおける機能的なTET-onシステムが構築されていることを確認した後、共焦点顕微鏡または広視野蛍光顕微鏡を用いてサンプルの撮像を行います。このシステムは、個々の組織における遺伝子またはシグナル伝達経路の機能を検証するために利用できます。ここで示すように、HER 4.3プロモーターによって駆動されるtetアクティベーターは、再生組織の一部の組織においてのみTETレスポンダーの発現を誘導します。増殖性の近位基底細胞（proximal blastema）ではYFP蛍光が検出されますが、遠位基底細胞（distal blastema）および表皮では発現が見られません。

HER 4.3ドメイン内の増殖細胞においてWNT β-カテニンアンタゴニストであるaxin 1を発現させたところ、驚くべきことに再生細胞の増殖には影響を与えませんでした。このことは、増殖期の近位芽基におけるWnt β-カテニンシグナル伝達が、芽基の間質細胞の増殖調節において不可欠な役割を果たしていないことを示唆しています。対照的に、ユビキチンプロモーター駆動のTetアクティベーター系統を用いて鰭再生組織の全組織でaxin 1を発現させたところ、再生細胞の増殖が強く阻害されました。

さらに、骨芽細胞を含まないHER 4.3領域でのaxon oneの発現は、再生組織における骨形成を強く阻害します。したがって、Tet-onシステムを用いたWntシグナリングの組織特異的な干渉により、細胞増殖および骨再生の調節におけるWntシグナリングの予期せぬ間接的な機能が明らかになります。本手法を習得すれば、任意の標的組織において誘導的な遺伝子発現を行うことが可能です。

我々は、この手法を、再生中のゼブラフィッシュの尾鰭におけるwind bedニコチンシグナリングの組織特異的な機能を調べるために正常に適用しました。この手法を用いることで、組織再生を制御する分子的な決定要因について、より包括的な理解を得ることが可能になります。