Name: 固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶ次世代シーケンス法による固体腫瘍と血液悪性腫瘍のアクショナブル変異検出プロトコル。FLT3、IDH2、NPM1などの変異を検出し、標的治療選択に有用な情報を提供する。

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著者は、生産の原稿と支援の読み取りのためにダニエル・ワイルドの支援を感謝したいです。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

<html>この原稿で説明する2つのNGSの試験が臨床的に提供されているように、最も重要な実用的な考慮事項は、品質管理です。具体的には、密接な考慮事項は、抽出したDNAの質と量に支払わなければなりません。これは、多くの場合、変数のDNA収率で高度に分解されFFPEサンプルのために特に重要です。イソプロパノール沈殿法、カラムベースの方法は時々制限された溶出体積を有するDNAの剪断をもたらすことが見出されたようFFPEサンプルからのDNAの収量を最大化するために開発されました。したがって、試料が低すぎる濃度を与えるまたはアッセイのためにあまりにも低下している時間のほとんどは、それが原因で、組織の大きさ、種類、または固定ではなく、抽出プロセスに最も可能性が高いです。抽出の失敗がある場合、血液/骨髄標本のために、それが原因hemodilute又は化学切除（ すなわち 、不十分その抽選で白血球又は腫瘍細胞の数を有する）であるサンプルに通常です。 DNAの品質が良好であればしかし、その後、低入力量は、成功することができ; 250 ngの多くの場合、アッセイで使用されている - NT &quot;&gt;検証中に、DNAの質と量の受容のためのカットオフは、100の推奨入力を確立すべきです。 DNAの品質（ すなわち 、増幅可能なDNAの量が100未満である- 250 ngの）悪い場合に加えて、（増幅可能なDNAの量が推奨される入力に到達するため）、次に高い入力量は、シーケンシング結果の品質を向上させることができ。DNAの質と量のためのメトリクスは、ライブラリの準備にDNAを進める前に、各サンプルに適用する必要があります。これらのサンプルを「グレーゾーン」（ 図2参照）には、実験室のディレクターまたは指名の裁量で実行する必要があります。現時点でのベストDNAは、塩基配列決定の際に十分に機能していないかどうかを予測する方法は、入力DNAの定量および品質評価が可能になる定量PCRベースのアッセイを行うことである。このアプローチは、bioavailabに対処します異なるサイズのフラグメント（ 例えば、100塩基対、150塩基対、200 bpおよび300 bp）の比較収量の増幅を経て、検体中の異なるサイズのフラグメントのility。 現在、ライブラリの準備にはいくつかの節目の1に失策が失敗した場合や低品質のものであるとのいずれかにライブラリを引き起こす可能性が手動手順が多数含まれます。マイクロ流体ゲル分析を、配列決定の前に、ライブラリの準備の問題をチェックするための唯一のQC工程です。したがって、余分なマインドフルネスは、反応の成功の確率を高めることができますいくつかの重要なステップがあります。正確なサンプルとオリゴヌクレオチドプールを、各試料のために使用されることを保証することが不可欠です。確実かつ適切に各サンプルは二重インデックスPCRプライマー対の96のユニークな組み合わせのいずれかがサンプルミックスアップするための機会を減少させる含まれていることを記録します。また、正しくフィルタープレート（FPU）ドレインを確保することが重要です。それが適切に排水しない場合、これはエクステを引き起こす可能性がありますライブラリの準備のnsion-ライゲーション工程は、次善行い、質の悪い配列決定データをリードします。ライブラリQC後、LNB1ビーズを完全に再懸濁し、LNB1 / LNA1溶液をこの混合物の濃度は、ライブラリーのモル濃度を決定するために使用されるように、サンプルに追加する前に十分に混合することをされていることを確認することが重要です。ビーズ溶出工程は、ビーズをオフに溶出するライブラリの次善の量につながる場合最後に、クラスタリングの密度を減少させ、場合によっては適切な平均カバレッジを取得しないように、ライブラリの原因となります。逆に、ライブラリーの過剰は、貧しい品質が読み込みにつながります。したがって、シーケンサ上のライブラリの最適なプーリングとクラスタリングを確保するためのビーズベースの正規化ステップで一致することが重要です。 ライブラリーの調製に加えて、生の、逆多重化FASTQファイルから正確な変異コールを生成するバイオインフォマティクスパイプラインを検証することが重要です。選択1を取捨選択しなければならない多くのオープンソースと市販のアライナ、バリアント発信者、およびNGSソフトウェアパッケージがあるので、カスタムソリューションは、時間がかかる場合があります。カスタムアルゴリズムは、本質的なパフォーマンス統計を抽出し、ほとんどのオープンソースツールを逃れたユニークな定期的な変異を同定し、遺伝子座の各々の上にコピー数の状態を決定するように設計する必要があります。バイオインフォマティクスパイプラインの検証プロセス中に、満たす、または品質のフィルタリング後のカバレッジの最小深さ（ 例えば 、250の最小読み取り）と最小対立遺伝子頻度の両方を超える変異体についての報告義務のカットオフ値を決定することが重要である（ 例えば 、4 ％）。この多重化されたアンプリコンベースのアッセイので、カバレッジの最小平均深さ（ 例えば 、1,000倍）ライブラリの読み込みの最小深さを最低実行アンプリコンを得ることができるようにするために達成する必要があることを決定することが重要です。また、検定の多重化の性質は、cを行いますauseオフターゲット効果とこれらの「成果物」を発見し、完全に起動する前に吟味する必要があります。記載されたアッセイの別の重要な制限は、検証最小対立遺伝子頻度を達成するために、10％を超える腫瘍を含有する試料について必要です。 低周波数の検出は、1％、FLT3の挿入は手動レビューがこの過程でまだ望ましいことの証拠です。でも5％の対立遺伝子頻度カットオフを有する、いくつかの重要な突然変異は多分逃したので、マニュアルレビューは、これらの変異体を確認することが不可欠となります。 FLT3-ITDSについては、エクソン14の目視検査は見過ごさない低レベルまたは大規模な挿入/複製を確保するために、すべてのAML患者に対して行われます。また、一般的にプライマー配列の隣にあるHER2エクソン20の挿入は、手動による介入が必要です。堅牢なバイオインフォマティクスパイプラインを持つにもかかわらず、いくつかの変異体は、ハードカットを持つだけの性質である見落とさ行くことができます上記のほとんどの統計のためにオフ。より良いライブラリーの調製および/または配列決定の方法論が意志として少ないアーティファクトや偽陽性が含まれていても低いカットオフで質の良いデータを持っている方が有利であるため、より良いバイオインフォマティクスは、この問題を軽減するために必要とされるであろう。 対立遺伝子頻度の検出および解釈は、腫瘍の割合の決意とゲノムの一部の領域の増幅バイアスの困難に困難な場合があります。ケース2において観察されるように加えて、50％を超える対立遺伝子頻度は、これは、ヘテロ接合性の消失（LOH）正常な対立遺伝子の喪失に起因する場合、いずれかの変異体読み出しの見かけの増加をもたらす、Aとして解釈され、検出され得ます変異対立遺伝子（ 例えば 、2変異体および1通常のコピー）または他のメカニズムのゲイン。これらのメカニズムは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（のaCGH 19）および/ ​​またはSNP遺伝子型決定のアレイを利用することによって明らかにすることができる。20。 現在のターゲット濃縮方法は、非効率なハイブリッドキャプチャまたは単一のサンプルとターゲットシーケンシング読み取りオフ以上の複数の配列決定の報道のための必要性をもたらす多重PCR技術のいずれかの完全日の手続きに依存しています。近い将来に予想されるNGS分子腫瘍学のための追加のアプリケーションは、完全に自動化することが、非常に低い入力DNA（ すなわち 、1未満NG）の量だけでなく、高度に分解した試料でサンプルを処理することができることができます簡単にライブラリー調製方法が含まれますDNA。これらの課題に対処するために、ほとんどのメソッドは、おそらく、PCRベースのいずれかになります多段階のPCR法や超並列シングルプレックスPCRアプローチです。また、個々のアンプリコンの分子バーコードは劇的背景シーケンシングノイズを低減し、より低い対立遺伝子頻度を達成するために、腫瘍細胞の低い割合を有するサンプルの検査を可能にし、circulatを取り込むに向かって移動することが示されています腫瘍細胞る。 癌標本における疾患関連変異の検出は、数十年の治療の標準となっています。歴史的には、遺伝子は、多くの場合、試験配列の末端に導く変異の同定と、一度に連続して、一つの遺伝子/エキソンを試験しました。 NGSの出現は、腫瘍形成に関連付けられている複数の変異の同定につながる並列に多くの癌に関連した複数の遺伝子の配列を決定するに偏りの少ないアプローチを可能にしました。癌における体細胞変異の検出のためのNGSの臨床的有用​​性がますます明らかです。実際、腫瘍サンプルのNGSベースの分析では、伝統的な、単一の遺伝子検査に挑戦する新しいパラダイムを表すが、臨床的有用​​性は非常にはっきりしています。臨床検査室は本日、この強力な技術を適用して慎重な方法の検証とテストの解釈を結婚するエキサイティングな機会を持っています。

臨床腫瘍学の標本の次世代シーケンシング（NGS）は、ターゲッティング遺伝的変化および予測/予後分子マーカーを同定することの重要性に科学文献点を成長させるように、過去数年間でより広く利用可能になりました。マルチ遺伝子パネルは、分析し、病気が進行し、再発の両方の上皮1,2および血液3悪性腫瘍における全体exomeシーケンシング研究では、腫瘍の不均一性およびクローン進化の概念を固めてきました。さらに、そのようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはサンガー配列決定のような競合する技術とは異なり、NGSは、単一のアッセイ4内のすべての臨床的に関連する癌遺伝子における最もゲノム変化を検出することができます。 当初は2臨床NGSパネル、カスタム血液学パネル（ヘム-NGSパネル）および既製FFPE標本のためのがんパネル（ソリッドNGSパネル）で起動パーソナライズ診断センター（参照<strong&gt;図1）。これらのパネルは、選択された遺伝子の臨床的に関連または高い関心領域をカバーします。すべての遺伝子またはエキソンが完全に覆われていません。アンプリコンを延長し、ライゲーションに続いてプローブハイブリダイゼーションによって生成されます。対象地域はさらに、配列決定のためにプールされる96サンプルまで可能、ユニバーサルデュアルインデックスプライマーを用いてPCRを用いて増幅しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> 図1：パネルで覆われた遺伝子のリストライブラリ調製は33の遺伝子または既製のアンプリコンがんパネル（ソリッド-NGS）47遺伝子ののカスタム血液学パネル（ヘム-NGSパネル）のいずれかを使用して行われます。いくつかのアンプリコンは唯一の特定のホットスポットをカバーすることができるようにすべてではない遺伝子またはエキソンのは、完全に覆われている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。&lt;</a>/ A&gt; ヘム-NGSパネルのコンテンツは、複数のソースから派生しますが、以前の臨床的有用性5の高さを実証するものとして説明急性骨髄性白血病（AML）に変異した16の遺伝子を中心としました。ソリッドNGSパネルは、商業的に（COSMIC）データベース6癌における体細胞突然変異のカタログで報告されているように癌で一般的に変異した遺伝子に基づいて対象地域で生産されています。 いくつかの重要なステップは、臨床NGSのためのワークフロー全体を特徴づけます。臨床医が検査を注文した後、病理医は腫瘍の割合とサンプルボリュームの分析を以下の試料の妥当性を判断します。我々の施設では、技術の背景配列決定エラー率（「騒音」）と標的アプローチの効率のために、少なくとも10％の腫瘍を必要とします。組織検査のために十分である場合には、ゲノムDNAを抽出します。このDNAは、次いで、（複数の品質管理にかけられますQC）の手順。 DNAは、QCに合格した場合、アンプリコンライブラリーが生成され、配列決定されます。得られたデータを、社内のバイオインフォマティクスパイプラインを介して分析されます。バイオインフォマティクス解析に続いて、変異体は、手動で見直され、臨床報告に組み込む前に、病原性のために解釈しました。下に私たちは、この厳格なワークフローを経て、最終的には臨床管理の変化につながった2例を説明します。 ケース1 -急性骨髄性白血病 患者Aからの骨髄生検は成熟せず、AMLのための診断でした。細胞遺伝学的研究は、骨髄標本に送信され、正常な女性核型を示しました。 95％の循環芽細胞は、そのように、末梢血試料はヘム-NGSパネルのパーソナライズされた診断テストのために送られた、存在がありました。 急性骨髄性白血病（AML）は、白血球の骨髄系統の血液学的な悪性腫瘍です。検出AMLにおける遺伝子変異の病因と予後7に重要と認識再発性遺伝子の変異と、予後および治療 ​​のためにますます重要になってきています。 FLT3内部タンデム重複（ITDS）が少なく良好な治療成績8に関連付けられてきたがNPM1とCEBPAの変異は、良好な予後のリスクと関連しています。証拠の成長体は、AML 9におけるこれらおよび他の変異のための病原性の役割をサポートしています。 ケース2 -肺腺癌 患者Bから左鎖骨上の質量の生検は、肺腺癌を実証しました。 50％を超える腫瘍を有するロール/カールは、変異が標的治療的介入のために存在していたかどうかを識別するためにとして、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）リンパ節塊から生検材料は、ゲノムテスト（ソリッドNGSパネル）のために送られました。 肺CANCERは、米国における癌関連死亡の主要な原因であり、2つの主要なタイプの非小細胞肺癌（NSCLC）および小細胞肺癌（SCLC）に分割されています。 NSCLCはさらに、病変の組織学に基づいて、腺癌または扁平上皮癌のいずれかとして定義することができます。肺腺癌は喫煙者と非喫煙者の両方で見られる肺癌の最も一般的なサブタイプであり、かつ非喫煙者10のための肺癌の最も一般的な形式です。肺腺癌の分子の研究では、複数の癌遺伝子11の変異を同定しました。喫煙者で同定された最も一般的なドライバの変異は、KRASおよびBRAFにおける突然変異です。非喫煙者の中で最も一般的な変異は、EGFRにおける変異、および遺伝子ALK、RETとROS1を伴う再編成されています。肺腫瘍は、遺伝子ERBB2（HER2 / neuの ）におけるインフレームエクソン20挿入に記載されています。 HEで最も一般的な異常R2 / neuが標的治療は、（：HER2 / neuのに対するヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブ）使用可能な乳癌におけるこの遺伝子座の増幅です。 2で観察されたHER2 / neuのエクソン 20挿入-肺の4％が12（それぞれ、ネラチニブとテムシロリムス）13 HER2 / neuおよびmTOR阻害剤との併用療法に部分的な応答を示しているadenocarcimomas。

<table><tbody><tr><td>ゲノムDNAスクリーンテープ</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>ゲノムDNA試薬</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>高感度 D1000 スクリーンテープ</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>高感度 D1000試薬</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>G2965A</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 解析ソフトウェア</td><td>Agilent Technology</td><td>A.01.04 以上</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル チューブ収納ラック</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 ml チューブラック</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレートラック</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、シングルチャンネル、0.5&ndash;2.5 &mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、シングルチャンネル、1&ndash;10 &mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、シングルチャンネル、2&ndash;20 &mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、シングルチャンネル、10&ndash;100 &mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、シングルチャンネル、20&ndash;200 &mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、シングルチャンネル、100&ndash;1,000 &MU;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清ピペッター</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテクサー</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機(チューブおよびストリップチューブ用)</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フリーザー、-20 &deg;C</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C冷蔵庫</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の水またはビーズバス</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター(37°C;c)</td><td>任意のベンダー血清</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、1&nbsp;ml</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、5&nbsp;ml</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、10&nbsp;ml</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、25&nbsp;ml</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手袋</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃/スカプル</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200プルーフエタノール</td>可燃性<td>キャビネット内の</td><td>任意のベンダー</td><td></td>ストア</tr><tr><td>2-プロパノール(イソプロパノール)</td>可燃性<td>キャビネット内の</td><td>任意のベンダー</td><td></td>ストア</tr><tr><td>25 mlリザーバー</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、8チャンネル、1 &ndash; 10 & mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、8チャンネル、10 &ndash; 100 &mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット、8チャンネル、20 &ndash; 300 &mu;l</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイス バケツ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水噴出ボトル</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルコール 噴出ボトル</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レンズ クリーニング ペーパー</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレート、96 ウェル PCR、セミスカート付き</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ ストリップ、8 ウェル、0.2&nbsp;ml</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ または 3000-T ニレ</td><td>ブルドッグ Bio/Q.Instruments</td><td>1808-0506/ 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>キャリパー</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>キャリパー</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>DropSense96</td><td>キャリパー (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant ソフトウェア</td><td>キャリパー (トリニアン)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートシーリングフィルム</td><td>デンビル</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>アルミシール箔</td><td>デンビル</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー、純水システム</td><td>EMD ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>22623508</td><td>15mlチューブとプレートの両方のローテーター、できれば2,500 x gまで使用できる遠心分離機</td></tr>。<tr><td>セーフロックチューブ 1.5 ml、ナチュラル</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>5 ml チューブ、DNA LoBind チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>022620645</td><td>どのプレート回転遠心分離機でも機能します</td></tr><tr><td>ハイベックス マイクロサンプルインキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>ハイベックス 0.2 ml チューブブロック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeqアンプリコン&ndash;がんパネル</td><td>イルミナ</td><td>FC-130-1008</td><td>96 反応</td></tr><tr><td>TruSeq カスタム アンプリコン</td><td>イルミナ</td><td>PE-940-1011</td><td>96 反応</td></tr><tr><td>TruSeq カスタム アンプリコン インデックス キット</td><td>イルミナ</td><td>FC-130-1003</td><td>96 インデックス、384 サンプル</td></tr><tr><td>MiSeq 試薬キット v3、500 サイクル</td><td>イルミナ</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 試薬キット v2、300 サイクル</td><td>イルミナ</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager</td><td>Illumina</td><td>1.3 以上</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 以上</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Analysis Viewer</td><td>Illumina</td><td>1.8 以上</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Filter Plate</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>Index Adapter 交換用キャップ</td><td>Illumina</td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 ml Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96 マグネティックスタンド、サイドスカート</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 (金/銀ブロック)</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>158489</td><td></td></tr><tr><td>Deparaaffinization Solution (16 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>Buffer ATL (4 x 50ml)</td><td>Qiagen</td><td>939011</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質沈殿液(50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA水和液(100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン溶液(500&nbsp;&mu;l)</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>Rnase (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (10 x 50 ml)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>乳棒</td><td>USA Scientific</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 &#181;l 滅菌済みラックの細長いフィルターピペットチップ、96チップ(960チップ)の10ラック。</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 &#181;l 滅菌ラックの天然、斜めフィルターピペットチップ、96チップ(960チップ)の10ラックUSA</td><td>サイエンティフィック</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &mu;lラック、滅菌ラック、96チップ(960チップ)の10ラックの天然、斜めフィルターピペットチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 &mu;l ナチュラル、斜めフィルターピペットチップ、ラック、滅菌ラック、96チップ(960チップ)の10ラック</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1,000 &mu;l ナチュラル、目盛り付きXLフィルターピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

癌の開始と進行に必要なドライバー変異についての理解が進むにつれて、腫瘍の特定の分子プロファイルが治療薬への反応性をどのように予測するか、または予後についての知識を提供するかについての重要な情報を得ることができます。当施設では、日常的な臨床ケアの一環として腫瘍ジェノタイピングプログラムを確立し、末梢血および骨髄で使用するためのカスタム33遺伝子血液悪性腫瘍パネルと、がんで一般的に変異する47遺伝子を標的とするホルマリン固定パラフィン包埋組織で使用する市販の固形腫瘍パネルという2つの次世代シーケンシング(NGS)パネルを使用して、血液腫瘍と固形腫瘍の両方の幅広い変異をスクリーニングしています。私たちのワークフローには、アッセイに十分な量の腫瘍があることを確認するための生検の病理医レビューと、それに続くカスタマイズされたDNA抽出が検体に対して行われることが含まれます。検体の品質管理には、量、品質、完全性のステップが含まれ、抽出されたDNAがこれらのメトリクスを通過した後にのみ、アンプリコンライブラリが生成され、配列決定されます。得られたデータは、社内のバイオインフォマティクスパイプラインを通じて分析され、バリアントの病原性がレビューおよび解釈されます。ここでは、2つの臨床例を使用して各パネルの有用性のスナップショットを提供し、適切に設計されたNGSワークフローが臨床結果の最適化にどのように貢献できるかについての洞察を提供します。

ケース1 -ヘム-NGSパネル 白血病末梢血から抽出したDNAは、ヘムNGSパネルのための十分な質と量（176 NG /μl）をありました。カバレッジの全体の平均深さは（最小値を超える1,000倍のカバレッジの深さを意味する）4,933xました。追加の実行統計が表3である。250×カバレッジ以下の8つの領域のうち、3は（ すなわち 、プライマー配列が正しくにより配列決定エラーに除去されなかった）によるプライマーの不適切なトリミングにあったが、1は、アッセイの既知のアーティファクトでしたそして他の4なし報告義務のバリアントと異なる遺伝子のエクソンの部分領域でした。私たちの臨床プロトコルのみ、少なくとも250の読み取りによってカバー報告バリアントが含まれていますが、少なくとも100の読み取りを持つすべてのデータは、レビューのためにデータベースにインポートされます。 データ処理FROMバイオインフォマティクスパイプラインは3つの報告、疾患関連変異を検出しました。 FLT3におけるミスセンス変異、IDH2におけるミスセンス変異、およびNPM1でフレームシフト突然変異。彼らの対立遺伝子頻度とエクソン変異体は、表4に記載されている。FLT3における共通の変異は、自動的に私たちのパイプラインによって呼び出され、エクソン14のエクソン14目視検査の目視検査を必要とされていないFLT3 -internal縦列重複（ITD）でありますFLT3の提出検体内に挿入または重複を示しませんでした。 FLT3 I836delは1％の対立遺伝子頻度にあった、それは5％の検証最小対立遺伝子頻度を下回ったため、最終報告書には含まれていませんでした。この変異はFLT3の D835Yの変更と同じDNA分子上に存在しない（ すなわち 、同じアンプリコン領域で観察されたが、ない「シス」シーケンシングのいずれかが読み込み中に）、それが唯一の.bam Fi接続の手動で確認することによって観察されましたレp.D835Yの変化を検証するとき。 2 FLT3変異の低い対立遺伝子頻度は、これらの変異は異質および/ ​​またはクローン進化を表すことが示唆しています。しかし、違いは、アンプリコンまたは一塩基多型（SNP）の近く又はこの対立遺伝子の増幅に影響を与えプライマー配列と重複するためのアッセイの性能に起因する可能性があります。 ヘム-NGSのFLT3、IDH2、およびNPM1におけるAML同定された変異を持つケース1のためのパネルの結果、FLT3におけるAML。突然変異で3一般的に変異した遺伝子は、AML（COSMICデータベース17）の成人患者の〜25％で観察されたとされているか、されていますチロシンキナーゼドメインの内部直列重複（ITD）またはミスセンス変異。 FLT3-ITDSは、より一般的な変異であり、標準的な化学療法に反応不良に関連付けられている一方、FLT3キナーゼ dの予後的意義omain点突然変異は、このAML患者に見られるように、予後14に不明瞭な影響を有しています。イソクエン酸脱水素酵素2（NADP +）、ミトコンドリア（IDH2）は、一般に 、AMLにおいて変異されたエピジェネティックな修飾子をコードする遺伝子です。エピジェネティックな修飾子の変異はIDH1とDNMT3Aの変異は、遺伝子の調節不全につながる遺伝子のこのクラスの他の突然変異を表すと、AMLでは比較的一般的です。ヌ（NPM1）のための遺伝子の変異は、AMLの中で最も一般的な取得突然変異の一つであり、一般的に（FLT3の不在下で- ITD）は、良好な予後因子であると考えられています。 NPM1とIDH2の共変異は、89％の3年全生存率と、良好な予後指標5として文献に記載されています。全体の3年生存率と比較した場合、これは、有意な生存利益を示し31％の野生型NPM1とIDH2。例えば、標準のケアの実践は、NPM 1およびFLT3-ITD変異のための変異解析が含まれています。二次変異が良好なものとすることができるように、このシナリオでは、唯一のNPM1変異の検出は、リスクに対する適切に階層化患者に失敗するだろう（ 例えば、IDH2）（ 例えば 、TET2）または不利な、骨髄移植を緩和するための自信を減少させます。 ケース2 -ソリッドNGSパネル FFPE組織から抽出したDNAは、252 ngの/μlの濃度と千塩基対（bp）以下のDNAのわずか4％で、ソリッドNGSパネルのための十分な質と量でした。データ分析の後カバレッジの平均深さは9167が250読み取り深度以下なしの領域と（よく千読み込みの私たちの最小深さカットオフより上）を読み込みました。追加のQCメトリックがshoあります表3のWN。 ERBB2（HER2 / neuの ）のエキソン20におけるインフレームの挿入とTP53におけるミスセンス変異：バイオインフォマティクスパイプラインを介して処理されたデータは、二つの疾患関連変異を検出しました。彼らの対立遺伝子頻度を持つすべてのエクソン変異体は、表5に示されている。命名法に反映されるようにERBB2での挿入は、実際に、重複したタンデム（HER2 / neuの ）配列を表します。同定および配列のインフレーム挿入が必要な手動審査の確認はIGVを介して読み取ります。 TP53とHER2 / neuの変異の両方に見られるように、50％を超えるの突然変異頻度の検出は、ヘテロ接合性の消失（LOH）イベント（説明を参照）を示唆する。 肺腺癌検出変異を有する症例2のための固体-NGSパネルの結果IERBB2（HER2 / NEU）およびTP53、一般的に現在の標準のケア肺癌患者のための一環としてのためにテストされていない二つの遺伝子。HER2 / neuのは、肺癌における他の一般的に突然変異した遺伝子に類似チロシンキナーゼ受容体をコードし、EGFRのn 。 20挿入が2で観察されるHER2 / NEUエクソン活性化-肺腺癌の4％を、肺癌で観察されたHER2 / neuの変異の大部分を占め、典型的には、EGFR及びALK 12のような他のドライバ遺伝子の変異なしに腫瘍に見られます。 HER2 / neuおよびmTOR阻害剤13と化学療法15と一緒にモノクローナル抗体トラスツズマブとの重大な疾患の制御との併用療法に部分的な応答を含むHER2 / neuの挿入を、活性化した患者のための様々な治療の選択肢のための証拠を示す可能性のあるいくつかの系統があります。 TP53の変化を発見することは異様なではありません癌におけるMMONが、この時点で何のアクション治療法はありません。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> ケース1 </td><td> ケース2 </td></tr><tr><td> 総開始読み込み </td><td> 2215926 </td><td> 2129110 </td></tr><tr><td> 割合は、マッピングを読み取り </td><td> 98.42パーセント</td><td> 98.29パーセント</td></tr><tr><td> 割合は、ターゲットに読み込み </td><td> 99.01パーセント</td><td> 97.29パーセント</td></tr><tr><td> 割合は、フィルター後、ターゲットで読み込み </td><td> 97.60パーセント</td><td> 95.45パーセント</td></tr><tr><td> 使用可能なの割合は、読み込み </td><td> 94.87パーセント</td><td> 91.79パーセント</td></tr><tr><td> 250Xカバレッジ上記拠点の割合 </td><td> 98.40パーセント</td><td> 100％ </td></tr><tr><td> 拠点aの割合BOVE 1000倍カバレッジ</td><td> 95.90パーセント</td><td> 99.70パーセント</td></tr><tr><td> 250倍以下カバレッジ-アンプリコン数 </td><td> 8 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> 表3： シーケンシングを実行しQCメトリックこれは、ライブラリの準備サンプルはQCを通過したかどうかを判断するために、データレビューのために使用されている平均カバレッジを含まない最も重要な実行統計の要約です。 80の範囲で低い「ターゲット上のパーセント」を持つために、FPUの洗浄工程またはプライマーのクロストークでSW1またはUB1のキャリーオーバーで、全てのパーセンテージは90％を超えている場合は、全体のプロセスが成功したが、それは可能です - 90％。 「パーセントマップされた &#39;が低すぎると、すべてのサンプルがヒトに揃えなければならないとして、それは、細菌または他のDNAの混入を示すことになります。これらの仕様のいずれかが80％以下である場合には、サンプルがどのようにpまでの決定を助けるためにさらなる検討のためにフラグが立てられますroceedとプロセスを改善。 <img alt="表4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> 表4：ケース1の結果は、未知の重要性の病原体、疾患関連、バリアント（VUS）を検出し、5％の対立遺伝子頻度の報告基準以上の可能性が高い良性のエクソン変異体が記載されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> 表5：。。ケース2の結果 、未知の重要性の病原体、疾患関連、バリアント（VUS）を検出し、おそらく5％の対立遺伝子頻度の報告基準以上の良性のエクソン変異体が記載されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください</a>。 補足図1：アンプリコンベースSampleSheet.csvの例。 このシート（この場合、アンプリコン）を実行するためにどのような化学シーケンサに伝え、どのようなワークフロー（ 例えば、GenerateFastq）、どのようなアプリケーションおよびアッセイ（ 例えば、FastqOnly）、どのように多くの塩基（または読み込み）の配列（この場合は186 bpのX 186 bp）の、およびサンプルが）この場合、デュアルインデックス作成には（特定のインデックスに関連付けられている最後に何を。黄色で強調表示されている部品は、実験者が望むものは何でも変更することができますが、この場合、ラボでは、これらのパラメータを使用しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">この図をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

この原稿は、2つの次世代シーケンシングパネルの臨床プロトコルについて説明しています。1つのパネルは血液悪性腫瘍を調査し、もう1つのパネルは固形腫瘍で一般的に変異した遺伝子を対象としています。ヒト悪性腫瘍におけるドライバー変異の分子分類は、貴重な予後および予測情報を提供します。

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

この次世代シーケンシング標的アンプリコンアッセイの全体的な目的は、診断、予後判定、および標的治療への反応を含む治療上の利用を目的として、患者の腫瘍における病原性変異を検出することです。本手法は、患者が標的療法または代替療法の恩恵を受けられる遺伝子に変異を有しているかなど、重要な疑問に答えるものです。この技術の主な利点は、単一のアッセイを用いて、あらゆる腫瘍組織から多くの遺伝子にわたる一般的および稀な治療標的となる変異を検出できることです。手法や技術が非常に複雑であり、各工程の習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。これは腫瘍内科学を前進させる決定的な瞬間です。次世代シーケンシングが臨床に導入されることで、患者様にとってより多くの、そしてより優れたがん治療が提供できるようになります。当社のCPDテクノロジストであるBarentt Li、Patrick Candrea、Karthik Ganapathy、およびJoe Grubbが本手順を実演します。また、アッセイのより複雑な部分を示すため、私がこのプロセスを補助します。テキストおよびメーカーのプロトコルに従ってゲノムDNAを抽出した後、抽出したDNA 2 µLをフルオロメーターで測定し、サンプルの作業濃度を求めます。アンプリコンライブラリを作成するために、Hybプレートと呼ばれるセミスカート付き96ウェルプレートに、必要量の低EDTA TEとパネルのOligo Tubeから5 µLを加え、各対応するウェルに100〜250 ngのゲノムDNAを加えます。ここでの取り違えは深刻な結果を招くため、これが最も重要なステップとなります。Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1を添加し、テキストプロトコルに従って遠心分離した後、あらかじめ加熱したハイブリダイゼーションインキュベーター内でHybプレートを95 °Cで1分間インキュベートします。インキュベーターをゆっくりと40°Cまで冷却した後、プレートをインキュベーターから取り出し、Hyb Plateの各サンプルの全量を、あらかじめ準備して洗浄済みの対応するフィルタープレートユニット（FPU）の中央に転送します。FPUに蓋をし、2,250 ×g、20°Cで3分間遠心分離します。その後、45 µLのSW1を加え、再度遠心分離します。SW1で2回目の洗浄を行い、続いてUB1で洗浄した後、各サンプルウェルにExtension Ligation Mix 3を45 µL加え、ピペッティングを3回繰り返して混合します。粘着剤付きアルミ箔でプレートを密閉し、FPUアセンブリ全体をあらかじめ37 °Cに予熱したインキュベーターで45分間インキュベートします。PCR増幅のインデックス付けを行うため、Index Amplification Plate（またはIAP Fixture）にプライマーを配置し、使用するインデックスをプレートの対応するウェルに分注します。その後、PCR Master Mix（2E12）を22 µL加え、ピペッティングを3回繰り返します。テキストプロトコルに従って45分間の伸長ライゲーション反応を遠心分離した後、FPUの各サンプルウェルに50 millimolar 水酸化ナトリウムを25 microliters加え、ピペットチップがメンブレンに接触するようにして、少なくとも6回ピペッティングします。次に、プレートをわずかに傾け、マルチチャンネルピペットを20 microlitersに設定し、FPUプレート内の水酸化ナトリウムを少なくとも6回ピペッティングします。FPUからの溶出液をIAPの対応するカラムに転移させます。テキストプロトコルに記載されているPCRプログラムを実行する前に、ピペッティングでDNAとPCRマスターミックスを十分に混合させます。ライブラリーの収量を検証し、テキストプロトコルに従ってサンプルを磁性精製ビーズとともにインキュベートした後、洗浄済みビーズが入った各ウェルに30 µLのEBTを加えます。ビーズがチューブの壁面から離れるように、数回ピペッティングを行います。プレートを振盪ありおよび振盪なしの条件でインキュベートした後、プレートをマグネットスタンドに設置し、上清を20 µLずつ、Library Normalization Plate（LNP）と呼ばれる新しいプレートに分注します。ノーマライゼーションミックスを調製し、溶液を時々転倒混和およびボルテックスした後、LNPの各サンプルに45 µLずつ添加します。次に、透明な粘着フィルムでプレートを密閉し、1,800 RPMで30分間振盪します。ビーズを洗浄した後、LNPをマグネットスタンドから取り出し、サンプルを溶出させるために、各ウェルに0.1 normal 水酸化ナトリウム溶液を30 µL加えます。次に、LNPを1,800 RPMで5分間振盪します。LNPを再びマグネットスタンドに戻し、上清が透明になった後、溶出液30 µLをストレージプレート内のあらかじめ調製したLibrary Normalization Storage Buffer 1に移します。プレートを傾け、シーケンシングを行う各サンプルを5 µLずつ、ラベルを貼ったPooled Amplicon Library（PAL）用1.5 mLチューブに加えます。使用するシーケンシング化学合成法に応じて、PALを4～10 µL、Buffer HT1を590～596 µL加えます。フローセルを洗浄し、ロードします。試薬をロードします。次に、画面上の指示に従ってシーケンシングランを開始してください。シーケンシングランが完了した後、バイオインフォマティクスパイプラインを実行します。ラン統計を分析し、シーケンシングされたライブラリがラボで規定された品質管理（QC）指標に合格しているかを確認します。最後に、ゲノムデータビューアを用いてBAMファイルを確認し、各バリアントを手動でレビューします。これは、ライブラリ調製サンプルがQCに合格したかを判断するために使用される、平均カバレッジを除いた最も重要なラン統計の要約です。ケース1で示されているように、バイオインフォマティクス解析により、報告可能なAML関連変異が4つ検出されました。FLT3のミスセンス変異、IDH2のミスセンス変異、およびNPM1のフレームシフト変異が認められます。FLT3の変異は、成人AML患者の約25%に観察されます。本AML患者に見られるようなFLT3キナーゼドメインの点変異の予後的意義については、予後への影響が不明確です。Isocitrate Dehydrogenase 2（IDH2）は、AMLで頻繁に突然変異が見られるエピジェネティック修飾因子をコードしています。Nucleophosmin（NPM1）遺伝子の変異は、AMLにおいて最も一般的に獲得される変異の一つです。この表には、症例2におけるすべてのエクソンバリアントが記載されています。2つの疾患関連変異が検出されました。ERBB2のエキソン20におけるインフレーム挿入、およびTP53におけるミスセンス変異です。HER2/neu（またはERBB2）は、チロシンキナーゼ受容体をコードしています。活性型HER2/neuエクソン20挿入は、肺腺癌の2〜4%に認められ、肺癌で観察されるHER2/neu変異の大部分を占めています。TP53の変化も癌において一般的です。抽出したDNAの質と量に細心の注意を払う必要があります。これは特にFFPE検体において重要です。FFPE検体は高度に分解していることが多く、DNA収量も変動します。臨床アッセイのバリデーションプロセスでは、DNAをライブラリ調製に進める前に、各検体のDNAの質と量に関する指標を確立する必要があります。ライブラリ調製に加えて、シーケンシングランのカットオフ値、品質管理統計、ライブラリ調製統計、アンプリコンのカバーレンジ深度、および最小報告可能アレル頻度を決定することにより、バイオインフォマティクス計画を検証することが極めて重要です。習得すれば、ライブラリ調製は1営業日で完了させることができます。しかし、アッセイ全体のワークフローでは、DNA抽出、シーケンシング、データ処理、およびバリアントレビューにさらに時間を要します。本手順は、特定の主要なホットスポットにおけるゲノムDNA変異のみを調べるように設計されています。遺伝子の差分的発現や、腫瘍のリスクとの関連付け、構造的な再編などの追加的な疑問を解決するためには、RNAを用いた他のアッセイを実施することが可能です。さらなる大きな進展が期待されています。オートメーションの導入と独自の分子バーコーディングの組み込みにより、研究室ではターンアラウンドタイムの短縮、サンプル投入量の削減、および非常に低いアレル頻度でのバリアント検出が可能になります。がん検体における疾患関連変異の検出は、数十年にわたり標準的な治療法となってきました。NGSは、多くのがんに関連する複数の遺伝子を並行してシーケンシングするためのバイアスの少ないアプローチであり、複数の変異の同定と、患者へのより適切な治療へとつながります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Cancer Research

がん研究

我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載し​​ている。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提供しています。...

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド...

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

腫瘍組織から高品質 DNA を取得は、次世代シーケンシングによる遺伝子の変異を分析するための重要な第一歩です。この記事では腫瘍細胞を豊かにし、押印細胞診標本のタッチから無傷の DNA を取得する簡単かつ迅速な方法を提案する.

タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

リボ核酸 (cRNA) 血液からを循環の検出は、臨床診断で満たされていない必要性です。ここで我々 は非小細胞肺癌患者特異的かつ高感度デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してから cRNA を特徴付ける方法を説明します。テストは、72...

血液ベース ROS1 の検出のためのテストし、デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してリボ核酸を循環から融合の成績証明書を RET

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

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目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

この記事では、アンカーされた多重ポリメラーゼ連鎖反応ベースのライブラリー調製キットの使用について詳しく述べたり、臨床固形腫瘍サンプルにおける発生遺伝子融合を評価するための次世代シーケンシングが続きます。ウェットベンチとデータ分析の両方の手順について説明します。...

アンカー多重ポリメラーゼ連鎖反応を用いた腫瘍性遺伝子融合検出、次世代シーケンシング

本論文では、非侵襲的な液体生検法の詳細なプロトコルを紹介し、血液採取、血漿およびバフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量、cfDNA断片濃縮分析を含む。...

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非扁平上皮非小細胞肺がん(NS-NSCLC)のケア管理のために検査される分子バイオマーカーの増加は、迅速で信頼性の高い分子検出法の開発を促しています。超高速次世代シーケンシング(NGS)アプローチを使用したNS-NSCLC患者のゲノム変化評価のワークフローについて説明します。...

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次世代シーケンシングを用いた非小細胞肺がんにおける標的変化の検出

学ぶ次世代シーケンス法による固体腫瘍と血液悪性腫瘍のアクショナブル変異検出プロトコル。FLT3、IDH2、NPM1などの変異を検出し、標的治療選択に有用な情報を提供する。

固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

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