固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

この次世代シーケンシングターゲットAmplicon Assayの全体的な目標は、診断、予後、標的療法への反応など、治療用途のために患者腫瘍の病原性変異を検出することです。この方法は、患者が標的療法または代替療法の恩恵を受けることができる遺伝子に突然変異があるかどうかなどの重要な質問に答えます。この手法の主な利点は、多くの遺伝子にわたる一般的な変異とまれな変異の両方を、単一のアッセイを使用して任意の腫瘍組織で検出できることです。

手法と技術は非常に複雑で、手順を学ぶのが非常に難しいため、この方法を視覚的に示すことが重要です。これは、腫瘍内科の進歩における決定的な瞬間です。次世代のシーケンシングを臨床に採用することで、患者さんのためにより多くのより良いがん治療を提供できるようになります。

CPDの技術者であるBarentt Li氏、Patrick Candrea氏、Karthik Ganapathy氏、Joe Grubb氏がこの手順を実演します。また、このプロセスを支援して、アッセイのより複雑な部分を示します。テキストプロトコルに従ってゲノムDNAを抽出した後、製造元のプロトコルに従って、抽出したDNAの2マイクロリットルを蛍光光度計で分析し、サンプルの使用濃度を取得します。

Amplicon Libraryを作成するには、Hyb Plateと呼ばれるセミスカートの96ウェルプレートに、必要な量の低EDTA TEとパネルのオリゴチューブの5ミリリットルを加え、対応する各ウェルに100〜250ナノグラムのゲノムDNAを加えます。これは最も重要なステップであり、ここでの取り違えは深刻な結果を招くからです。Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1を添加し、テキストプロトコールに従って回転させた後、Hyb Plateを予熱したハイブリダイゼーションインキュベーターで摂氏95度で1分間インキュベートします。

インキュベーターを摂氏40度までゆっくりと冷却した後、プレートをインキュベーターから取り外し、各サンプルの全容積をHybプレートから、事前に準備した対応する予備洗浄済みフィルタープレートユニット(FPU)の中心に移します。FPUを覆い、2、250倍G、摂氏20度で3分間遠心分離します。次に、45マイクロリットルのSW1を加え、再度遠心分離します。

SW1で2回目の洗浄とUB1で洗浄した後、各サンプルウェルに45マイクロリットルのExtension Ligation Mix 3を加え、3回上下にパイプで混合します。接着性アルミホイルを使用してプレートをシールし、FPUアセンブリ全体を予熱した摂氏37度のインキュベーターで45分間インキュベートします。PCR増幅のインデックスを作成するには、プライマーをインデックス増幅プレートまたはIAPフィクスチャに配置し、プレート内の対応するウェルに使用されているインデックスを分注し、22マイクロリットルのPCRマスターミックス、2E12を追加し、3回上下にパイプします。

次に、テキストプロトコルに従って45分間のExtension Ligation Reactionをスピンダウンした後、FPUの各サンプルウェルに25マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを加え、ピペットチップがメンブレンに接触するように、少なくとも6回上下にパイプします。次に、プレートを少し傾け、マルチチャンネルピペットを20マイクロリットルに設定して、FPUプレート内の水酸化ナトリウムを少なくとも6回上下にピペッティングします。FPUからの溶出液をIAPの対応するカラムに移します。

テキストプロトコルに記載されているPCRプログラムを実行する前に、DNAをPCRマスターミックスと完全に結合するために、静かにピペットで上下させます。ライブラリの収量を確認し、テキストプロトコルに従ってサンプルを磁気精製ビーズでインキュベートした後、洗浄したビーズの各ウェルに30マイクロリットルのEBTを添加します。ピペットを数回上下させて、ビーズがチューブの側面から外れるようにします。

プレートを振とうせずにインキュベートしたら、プレートを磁気スタンドに置き、上清の20マイクロリットルをLibrary Normalization Plate(LNP)と呼ばれるまったく新しいプレートに移します。断続的な反転と溶液のボルテックスを伴ったノーマライゼーションミックスの調製に続いて、LNPの各サンプルに45マイクロリットルを追加します。次に、透明な粘着フィルムを使用してプレートを密封し、1, 800 RPMで30分間振とうします。

ビーズを洗浄した後、LNPを磁気スタンドから取り出し、サンプルを溶出するために、各ウェルに30マイクロリットルの新鮮な0.1ノーマル水酸化ナトリウムを加えます。次に、LNPを1, 800 RMPで5分間振とうします。LNPを磁気スタンドに戻し、上清が除去された後、溶出液の30マイクロリットルを、あらかじめ調製したStorage Plate内のLibrary Normalization Storage Buffer 1に移します。

プレートを曲げてから、各サンプルの5マイクロリットルをシーケンシングする、標識されたPooled Amplicon Library(PAL)1.5ミリリットルチューブに加えます。使用されているシーケンシングケミストリーに応じて、PALの4〜10マイクロリットルを590〜596マイクロリットルのバッファーHT1に追加します。フローセルを清掃してロードします。

試薬をロードします。そして、画面の指示に従ってシーケンシングランを開始します。シーケンシングの実行が完了したら、Bioinfomatics Pipelineを実行します。

ラン統計を解析して、シーケンシングされたライブラリがラボで決定された品質管理メトリクスに合格していることを確認します。最後に、Genomic Data Viewer で、BAM ファイルを表示して各バリアントを手動で確認します。これは、ライブラリ調製サンプルが合格したかどうかを判断するために使用される最も重要なラン統計(平均カバレッジを含まない)の要約です QC.As、ケース1、バイオインフォマティクスで検出された4つの報告可能なAML関連変異

FLT3のミスセンスの必須性、IDH2のミスセンス変異、NPM1のフレームシフト変異。FLT3の変異は、AMLの成人患者の約25%で観察されます。このAML患者に見られるFLT3キナーゼドメイン点変異の予後的意義は、予後には不明の影響を及ぼします。

イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2(IDH2)は、AMLで一般的に変異するエピジェネティックな修飾因子をコードしています。ヌクレオホスミン(NPM1)の遺伝子の変異は、AMLで最も一般的に獲得される変異の1つです。この表は、ケース2のすべてのエクソニックバリアントを示しています。

2つの疾患関連変異が検出されました。ERBB2のエクソン20のインフレーム挿入、およびTP53のミスセンス変異。HER2/neu(ERBB2)は、チロシンキナーゼ受容体をコードしています。

活性化HER2/neuエクソン20の挿入は、肺腺がんの2〜4%で観察され、肺がんで観察されるHER2/neu変異の大部分を占めています。TP53の変化は、がんでもよく見られます。抽出されたDNAの質と量には細心の注意を払う必要があります。

これは、FFPEサンプルでは特に重要です。私たちは、DNA収量を変数にして非常に劣化させることがよくあります。臨床アッセイの検証プロセスでは、DNAをライブラリ調製に進む前に、各サンプルのDNAの品質と量の指標を確立する必要があります。

ライブラリ調製に加えて、シーケンシングランのカットオフ値、品質管理統計、ライブラリ調製統計、Ampliconの勇気の深さ、および報告可能な最小対立遺伝子頻度を決定することにより、Bioinfomatic Spy Planを検証することが重要です。マスターすれば、ライブラリの準備は営業日で行うことができます。しかし、アッセイワークフロー全体では、DNA抽出、シーケンシング、データ処理、バリアントレビューにより多くの時間が必要です。

この手順は、特定の主要なホットスポットのゲノムDNA変異のみを調べるように設計されています。RNAを使用する他の腫瘤は、遺伝子の差次的発現、リスク腫瘍の関連付け、構造再配列などの追加の質問に答えるために実行できます。大きな進歩が間近に迫っています。

自動化の採用と独自の分子バーコードの組み込みにより、ラボはターンアラウンドタイムを短縮し、サンプル投入量を減らし、非常に低い対立遺伝子頻度でバリアントを検出できるようになります。がん検体における疾患関連変異の検出は、何十年にもわたって標準治療となってきました。NGSは、多くのがんに関連する複数の遺伝子を並行してシーケンシングするための偏りの少ないアプローチであり、複数の突然変異の特定と患者にとってより良い治療につながります。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。