胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用

このビデオでは、非常に一般的な組織学的染色メチルグリーンを蛍光顕微鏡で非常に便利な核標識として使用する方法を示し、全胚などの厚い生体試料のレーザー共焦点顕微鏡での特別なアプリケーションを示します。DNA特異的染色剤としてメチルグリーンをまもなく紹介した後、蛍光染色用のストック溶液と作業溶液の調製方法について説明します。次に、核染色を達成し、いくつかの魚の胚を保持するための実験手順と、得られた共焦点画像の例を示します。

最後に、メチルグリーンの優れた物理的化学的特性が実証され、議論されます。フレディ・ミーシャは1869年にDNAを発見し、数年後にDNAが比較的新しい年代と染色メチルグリーンの沈殿物を形成することを示しました。メチルグリーンは、その主要なグループでDNAと強く相互作用し、リーチ領域に優先的に結合することを可能にする2つの正電荷を持っています。

メチルグリーンの最も広範な使用は、20世紀初頭にUNAとポッペンハイムによって開発されたメチルであるRNA染色ペリンと鼻溶液での組み合わせでした。しかし、メチルグリーンの蛍光特性についてはほとんど分析されていないため、非常に親和性が高く、特異的な蛍光標識として使用できる可能性をテストすることにしました。細胞上のDNA用。

メチルグリーンは、7つのメチル根を持つアルメタン染色です。この7番目のグループは簡単に失われ、クリスタルバイオレットに戻ります。このため、クリスタルを除去するためにメチルグリーンにクリスタルバイオレットを混ぜたものが入荷します。

バイオレットメチルグリーン溶液は、クロロホルムで洗浄してクリスタルバイオレットを抽出することができます。この目的のためにすぐに示すように、ドラフトの下に4%ACU溶液を準備します。それを少なくとも2つの部分のクロロホルムと遠心分離機と混合して、相分離を促進します。

セントリフィケーション後、メチルグリーンの水相とクロロホルムとクリスタルバイオレットの低級有機相が得られます。上期を回復し、下期がはっきり見えるまで繰り返しました。最後に、上相を回収し、希釈します。

これは、作業台で数ヶ月間安定したソリューションです。次に、メスグリーンで胚層のMO全体を手入れする方法を示します。共焦点マイクロ化には、高移植魚胚を使用します。

例として、ゼブラフィッシュの胚を入手し、ストレーナーで破片を洗い流します。それらを水槽の水または胚培地で所望の段階までインキュベートします。細いピンセットで真皮を取り除き、胚をホルムアルデヒドの4%で固定します。

次に、PBSTで胚を数回洗います。ストック溶液をPBSTで5〜10, 000倍希釈することにより、メチルグリーンワーキング溶液を調製します。胚を溶液中で室温で少なくとも3時間、または摂氏4度低下させて一晩インキュベートします。

この例では、共焦点画像は、スペクトル検出器を備えたより低い共焦点顕微鏡で取得されます。最大励起は633ナノメートルレーザーで達成され、検出器は広範囲に設定されています。可視スペクトルの赤い領域。

メチルグリーンレッド発光により、全胚のような深部標本からでも、信号損失を最小限に抑えながら、高品質な核イメージングを得ることができます。この最初のシリーズは、ゼブラフィッシュの網膜を示しており、その核はプロ3の確立されたDNA染色で染色されています。1 分後、ズームアウトします。

ABLスキャン領域は、メチルグリーンで同じ実験を行うと明らかになりますが、明らかな漂白は見られません。次のシリーズでは、ここで説明するプロトコルを使用して取得できるものの代表的な結果を示します、ゼブラフィッシュ表皮からの有糸分裂細胞で、有糸分裂の数値を観察できます。原子核の構造が見られるのと同じ試料からのIIC原子核。

メチルグリーンアマリンで標識されたゼブラフィッシュの幼虫の表皮細胞の一部の3D再構築、48時間のポート受精、シルバーフィッシュ、br網膜内のさまざまな核形状のよりパノラマビュー。ここでは、核標識に使用できる非常に安価な蛍光DNA染色剤を調製する簡単な方法を示しましたが、例として示しただけですが、いくつか保持しています。この技術は、胚または組織に、ホールマウントまたはセクショナルに適用できます。

また、ゲル中のDNA染色や、測光法を用いた溶液中のDNA測定にも使用できます。