Name: 胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 学ぶメチルグリーンを用いた胚の蛍光標識法。DNA特異的染色によりレーザー共焦点顕微鏡で厚い生物試料の核可視化が可能。光漂白耐性と深部イメージング能力で発生生物学研究に有用です。

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著者は、ビデオの制作に携わったPatxi Jaso氏、部分的な資金提供を提供してくださったPEDECIBAとAgencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII)に感謝したいと思います。

色素の1精製<ol><li> 10mlの蒸留水で汚れ粉末0.4グラムを溶解することにより、メチルグリーンの4％水溶液を調製します。それを完全に溶解するまで十分に混合します。 </li><li>ヒュームフードの下で、クロロホルムの少なくとも2部とそれを混ぜます。これは、チューブがクロロホルム耐性があるかどうかを事前に確認することが重要です。 </li><li>十分に混合し、相分離を促進するために2,000×gで1分間遠心します。 </li><li>遠心分離後、メチルグリーンと上部の水相、クロロホルム、通常汚染物質クリスタルバイオレットと下層の有機相が得られます。 </li><li>上相を回収し、下相は、クリスタルバイオレットを完全に欠い表示されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>終了時に、上相を回収し、2％のメチルグリーンの最終濃度まで水で希釈しました。このストック溶液を、ヶ月間作業台の上に安定であり、光から保護される必要がありません。 </li></ol><ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の（パラホルムアルデヒドから）4％ホルムアルデヒド中で一晩胚を修正しました。 注：これは一晩胚の厚さに応じてするのに数時間かかることがあります。例では、一晩の48時間後に受精（HPF）ゼブラフィッシュの胚を固定しました。 </li><li> 5分間、PBS-T（PBS中1％のTriton X-100）中で胚を3回洗浄します。界面活性剤の高濃度は、キューティクルを透過性に。 </li><li> 5,000-1：PBS-T（2％ストック溶液から）メチルグリーン10,000溶液1を調製します。インキュベーション中の界面活性剤の存在は、ゼブラフィッシュの胚および幼生のような厚い標本のために有用です。 </li><li>緩やかに揺り動かしながら、4℃で少なくとも6時間溶液中で胚を培養します。ここでも、胚の厚さは、培養時間の長さのための校正パラメータです。 </li><li>胚3ティムを洗います洗剤過剰を取り除くために30分間、PBSでES。 DNAに結合した場合にメチルグリーン蛍光は、したがって、非結合分子からのバックグラウンドは無視できる、唯一のは明白です。 </li><li>出土したスライドや実装溶液と自家製室（75％グリセロール、0.1Mトリス·塩酸pHは8）にマウント。 注：核染色は免疫標識後に行われる場合、メチルグリーン、それを洗い流す必要なしに、使用濃度に取り付け溶液に組み込むことができます。 </li><li>ストアは、冷蔵またはすぐに撮影を開始します。レーザー走査共焦点（または他の蛍光）メチルグリーン発光は677 nmで最大となることを考慮して650〜750 nmに登録するように設定さ633 nmおよび発光フィルターで励起し顕微鏡で撮影を行います。 注：私たちは、補足資料として、取得ソフトウェアにロードされるメチルグリーン発光プロファイルの測定データを、提供します。 </li></ol> 3.蛍光原子力セントメチルグリーンを用いた全ニワトリ胚のaining <ol><li>興味のあるステージに受精鶏卵をインキュベートします。 4℃で一晩、PBS中（パラホルムアルデヒドから）4％ホルムアルデヒド中で胚を修正しました。 2時間の胚をPBS-Tで3回洗浄します。 </li><li> 5,000-1：PBS-T（2％ストック溶液から）メチルグリーン10,000溶液1を調製します。 4℃で一晩染色液中の胚を培養します。胚をPBSで3回、1時間ごとに洗浄します。 75％グリセロール、0.1Mトリス、pHが8と、チャンバ内のマウント。 </li></ol> 4.イメージング蛍光が全体に取り付けられた胚中の核を標識<ol><li>顕微鏡スライド上に電気テープのいくつかの層を貼り合わせて画像化チャンバを準備し、慎重内の胚を配置するメスでそれに穴をカット。これは、撮像中に破砕から胚を防ぐことができます。 </li><li>慎重に75％グリセロール、0.1 Mトリス-HCl、pH値= 8でトップにチャンバーを撮像チャンバーに胚を移し、フィルボイドバブル形成。 </li><li>メディア溢れを回避または除去する＃0カバーガラスでカバーしています。マニキュアでそれを封印。 </li><li> 633励起フィルターやレーザーラインを装備した蛍光顕微鏡で標本の画像を取得します。 注：発光フィルタは、メチルグリーンの677発光極大をカバーする必要があります。 </li></ol>

<ol><li>Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+imaging+in+three+dimensions%3A+a+unique+tool+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research.</a> Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Latt, S. A., Stetten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+studies+on+33258+Hoechst+and+related+bisbenzimidazole+dyes+useful+for+fluorescent+detection+of+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+a+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
<li>Kim, S. K., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+green.+A+DNA+major-groove+binding+drug%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Methyl green. A DNA major-groove binding drug.</a> FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).</li>
<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

蛍光顕微鏡のバリエーションに特に焦点を当てた、過去数十年にわたる顕微鏡技術の進歩的な発展により、胚全体を含む無傷の組織サンプルのダイナミクスと構造を調査する可能性がもたらされました10,11。しかし、大きな制限の1つは、細胞内構造を直接かつ迅速に染色するために使用できる高品質の蛍光色素が入手できることです。 
DAPIやHoechstなど、最も頻繁に使用される蛍光DNA染色は、UV光で励起され、可視スペクトル2,3の青色領域で放出されるため、組織全体の深部構造のイメージングには不十分です。赤色光は生体サンプルへの浸透性がはるかに優れているため、赤色発光蛍光色素はこれらの研究により適しています12。自家蛍光は胚組織における一般的な問題であり、赤色発光蛍光色素を使用することによっても克服できます5。
我々は、非常に一般的な組織学的染色メチルグリーンが、DNAに結合すると非常に効率的な赤色発光蛍光色素であり、顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定...

DNAの蛍光染色は、核および染色体構造の詳細な研究、組織および細胞の対比染色、または細胞周期パラメータの研究のために、生物学的研究および臨床診断の両方で広く日常的に使用されています。いくつかのDNA染色剤が利用可能ですが、最も広く使用されているのは、UV光によって励起され青色で発光するもので、蛍光タンパク質や抗体に付着した低分子などの緑色およびオレンジ赤色を放出する蛍光色素と組み合わせると、従来のほとんどの落射蛍光顕微鏡で使用される通常の3フィルターシステムに適合します。これらの青色を放出するDNA染色の中で、最も一般的なのはDAPIおよびHoechstマイナーグルーブ結合剤2,3です。それにもかかわらず、レーザー走査型顕微鏡に多種多様なレーザー輝線とスペクトル検出を組み込むことで、研究者はヨウ化プロピジウム(PI)やTO-PRO 34などの遠赤色発光核染色の使用を選択できるようになりました。これらの染色剤の利点は、多くの細胞や組織、特に胚5に見られる自家蛍光の問題を克服することであるが、それらの多くは、発光プロファイルが広い、または光退色に対して非常に敏感であるなど、異なる問題を抱えている6。
スイスの研究者フリードリッヒ・ミーシャーは、1869年に膿の白血球の核からDNAを抽出して発見しました。彼はそれをヌクレインと呼び、数年後に比較的新しい染色メチルグリーンで沈殿物を形成することを示しました。メチルグリーンは、メチル化の程度が異なる3つのアニリン環で構成され、DNA7,8の主要な溝に強く結合することを可能にする2つの正電荷を持っています。メチルグリーンによるDNA染色は、非常に早い段階で特異的であることが示され、UnnaとPappenheimは、RNAを特異的に標識するピロニンとの複合染色を開発しました。それ以来、メチルグリーンピロニンは日常的な組織学的手法で広く使用されてきました9。
最近まで、メチルグリーンの蛍光特性についてはほとんど知られていませんでした。しかし、私たちの以前の研究では、633 nmでの励起、便利なストークスシフト、電磁スペクトルの近赤外部分での発光、同様のスペクトル特性を持つ市販のDNA染色よりも高い光安定性、および非常に低コストでのメチルグリーンスペクトルの利点6がいくつか明らかになりました。そのため、胚組織や全胚のDNAの非常に高い親和性および特異的な蛍光標識として使用されることを試験することにしました。さらに、これまでメチルグリーン核染色は低pHで行われていたため、抗体染色との組み合わせが困難でした。ここで詳述する方法の目標は、生理学的pHで染色手順を行うことにより前述の不便さを克服する蛍光核DNA染色のプロトコルを持つことであり、したがって、切片および組織全体に対する免疫標識に適した対比染色となる。

<table><tbody><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>メチルグリーン</td><td>Dr. G. Gr&uuml;bler</td><td></td><td>また、クリスタルバイオレットフリー</td></tr>の<tr><td>パラホルムアルデヒド</td>である<td>Sigma-Aldrich 323829をテストしました Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡 Leica TCS-SP5 Leica</td><td>Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash;テトラメチルローダミンBイソチオシアネート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>cover slips</td><td>Esco optics</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

胚の蛍光標識でdna特異的染色メチルグリーンの応用

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Methyl greenは、DNAに対して特異的な親和性を持つ組織学的染色として長い間知られていましたが、その蛍光特性は最近まで未開拓のままでした。この記事では、メチルグリーン水溶液の調製方法を示し、希釈すると固定細胞や組織の非常に便利な蛍光核標識として使用できます。ゼブラフィッシュやニワトリの胚を丸ごと標識する簡単な手順が詳細に説明されており、得られた画像の例が示されています。メチルグリーンは、633 nmの赤色光によって最大に励起され、677 nmでピークに達する比較的鋭いスペクトルで放出されます。非常に安価で、毒性がなく、溶液中で非常に安定しており、DNAに結合すると光退色に対して非常に耐性があります。その赤色発光により、厚い試料中の核の高分解能走査型共焦点イメージングが可能です。最後に、このメチルグリーン染色プロトコールは、抗体標識や蛍光色素標識ファロイジンによるアクチンフィラメント標識など、他の細胞染色手順に適合します。

厚い試料の核染色。本明細書に説明されたプロトコルは、全胚における深部構造の均一な染色を達成することができます。レンズの開発48 HPFのゼブラフィッシュ胚が均一に標識されている核の形態（ 図1）。 メチルグリーンDNA染色は、有糸分裂像やアポトーシス核の識別（ 図2A）のような、細胞周期依存性の形態学的な違いの識別を可能にします。ゼブラフィッシュ胚（ 図2B）の表皮核のために示したように、高解像度の核内構造も明らかです。 メチルグリーンは、長期間にわたって高強度の照射下で光退色に対して耐性があります。同じ強度で633nmのレーザー光を照射するとき、それは同様のスペクトル特性を共有する別のDNA特異的染色の場合のように、メチルグリーン核染色は、TO-PRO-3、アウト漂白しません4。全体に取り付けられたゼブラフィッシュ胚の網膜の共焦点面を選択し、高い照射を実現するために63X 1.4NA目的でズームしました。ズームアウトするとメ...

特定のDNA標識であるメチルグリーンで固定された生物学的物質を蛍光染色する方法が説明されています。メチルグリーンは希釈水溶液中で使用され、光退色に対して非常に耐性があります。その遠赤色発光により、深い標本イメージングが可能となり、特に全胚に適しています。

胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

このビデオでは、非常に一般的な組織学的染色剤であるメチルグリーンを、蛍光顕微鏡における極めて便利な核標識として使用する方法、および胚全体のような厚い生物学的試料の共焦点レーザー走査顕微鏡観察における特殊な応用方法について解説します。まず、DNA特異的染色剤としてのメチルグリーンについて簡単に紹介し、次に蛍光染色のためのストック溶液および作業溶液の調製方法について説明します。その後、核染色を行うための実験手順を示し、いくつかの魚類胚と、得られた共焦点画像の見本を提示します。最後に、メチルグリーンの優れた物理化学的特性について実演し、考察します。1869年にフレディ・ミシャがDNAを発見し、その数年後、当時比較的新しい染料であったメチルグリーンを用いてDNAが沈殿を形成することを示しました。メチルグリーンは2つの正電荷を持っており、これによりDNAの主溝と強く相互作用し、特にATリッチな領域に優先的に結合します。メチルグリーンの最も広範な用途は、20世紀初頭にUNAとPoppen Heimによって開発されたRNA染色剤であるピクロ酸（pyronine）と配合した鼻腔用溶液としての利用です。しかしながら、メチルグリーンの蛍光特性に関する分析はほとんど行われておらず、そのため、我々はこれが非常に親和性の高い特異的な蛍光ラベルとして細胞内のDNAに使用できる可能性を検討することにしました。メチルグリーンは、7つのメチル基を持つメタン染色剤です。この7番目の基は脱落しやすく、容易にクリスタルバイオレットへと戻ります。そのため、クリスタルバイオレットの形成を防ぐ目的で、少量のクリスタルバイオレットがメチルグリーンに混入されています。クリスタルバイオレットを抽出するために、バイオレットメチルグリーン溶液をクロロホルムで洗浄することがあります。この目的のために、まずドラフトチャンバー内で4% ACU溶液を調製します。これを少なくとも2倍量のクロロホルムと混合し、遠心分離して相分離を促進させます。遠心分離後、メチルグリーンの含有する水相と、クロロホルムおよびクリスタルバイオレットを含む下層の有機相が得られます。上層を回収し、下層が透明になるまでこの操作を繰り返します。最後に、回収した上層を希釈します。この溶液は、ワークベンチ上で数ヶ月間安定して保存可能です。次に、胚の層全体をメチルグリーンで染色して、すべてのMOを標識する方法を説明します。共焦点顕微鏡観察には、高透過性の魚類胚を使用します。例として、ゼブラフィッシュの胚を回収し、ストレーナーを用いてゴミを洗い流します。魚類飼育水または胚培養液中で、目的の段階までインキュベートします。精細ピンセットで卵膜を除去し、4% ホルムアルデヒドで数時間または一晩固定します。その後、胚をPBSTで数回洗浄します。ストック溶液をPBSTで5,000倍から10,000倍に希釈して、メチルグリーンの作業溶液を調製します。胚をこの溶液に浸し、室温で少なくとも3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。この例では、スペクトル検出器を搭載した共焦点顕微鏡を用いて共焦点画像を取得します。633 nmのレーザーで最大励起を行い、検出器は可視スペクトルの赤色領域の広範囲に設定します。メチルグリーンレッドの放出により、個体全体の胚のような深い検体からでも、信号の損失を最小限に抑えて高品質な核イメージングを得ることが可能になります。この最初のシリーズでは、確立されたDNA染色剤で核を染色したゼブラフィッシュの網膜をプロ三で示しています。1分後、ズームアウトします。メチルグリーンを用いて同様の実験を行った場合、ABLスキャン領域が明確になりますが、明らかな退色は見られません。以下のシリーズでは、本プロトコルを用いて得られた代表的な結果を示します。まず、分裂像が観察されるゼブラフィッシュ表皮の有糸分裂細胞、次に、核構造が確認できる同一個体からのIIC核を示します。メチルグリーンアマリンで標識したゼブラフィッシュ幼魚の表皮細胞の一部の3D再構成図。受精後48時間のゼブラフィッシュ網膜内における、さまざまな核形状のより広範な視野を示しています。ここでは、核標識に使用できる極めて安価な蛍光DNA染色の簡便な調製方法を示しましたが、例として提示した以外にもいくつかの方法があります。この手法は、ホールマウントまたは切片のいずれにおいても、胚や組織に適用可能です。また、ゲル中のDNA染色や、光度法を用いた溶液中のDNA定量にも使用できます。

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