ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

本実験の全体的な目的は、脂質ベースのワクチンナノ粒子を合成および特性評価し、生体内で抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球の増殖を誘導する能力を評価することです。これは、抗原とアジュバントを共封入し、病原体を模倣した層間架橋マルチラメラ小胞（I CMV）を構築し、ナイーブマウスにワクチン接種を行うことで達成されます。さらに、ルシフェラーゼを発現する抗原特異的CD8陽性T細胞を養親的に移入します。

第2段階では、抗原特異的CD8陽性T細胞の増殖を、個体レベルのin vivoイメージングによって評価します。次に、ICMVを免疫した動物から採取した末梢血単核細胞を、蛍光標識テトラマーで染色し、フローサイトメトリーで解析することで、全身循環における内在性抗原特異的CD8陽性T細胞の頻度を定量化します。最終的に、生物発光イメージングを用いて、ナノ粒子ワクチン接種に応答して増殖する抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球を追跡することが可能です。

これらの手法は、細胞障害性Tリンパ球の拡大範囲はどの程度か、またナノ粒子ワクチン接種に反応してこれらの細胞はどのようにさまざまな組織へ移動するか、といったワクチン設計における重要な予備的疑問に答えるのに役立ちます。組織壊死後のin situ T細胞解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、T細胞反応のin vivoイメージングが非侵襲的であることです。これにより、同一個体の縦断的なモニタリングが可能になります。まず、20 mLのガラスバイアル内で、DOPCとMPBをクロロホルム中で1:1のモル比で混合し、1バッチあたりの総脂質量を1.26 µmolに維持することから始めてください。

次に、親油性貨物を目的の濃度で脂質溶液に加え、超乾燥窒素ガスでパージして有機溶媒を完全に除去します。サンプルを overnight で真空下に置き、翌朝、目的の水溶性貨物を含む 10 millimolar BTP を 200 microliters 加えて脂質膜を水和させます。得られた溶液を室温で 1 時間、10 分ごとに 10 秒間ボルテックスします。その後、内容物を 1.5 milliliter マイクロ遠心チューブに移します。

次に、チューブを氷水浴に置き、125 W、20 kHzのプローブチップソニケーターを用いて、強度40%の設定で連続超音波処理を行います。5分後、150 mM DTTを4 µLチューブに加え、ボルテックスで混合し、マイクロ遠心機でサンプルをスピンダウンさせます。その後、200 mM 塩化カルシウムを40 µLサンプルに混ぜ、続いて37 °Cで1時間、DTTを用いて脂質層を含むMPBを架橋させます。

インキュベーション終了後、溶液を3回遠心分離します。2回目と3回目の遠心分離では、200 µLの二回蒸留水を用い、上清から未反応の塩化カルシウム、DTT、および封入されなかったカーゴ物質を除去します。最後の遠心分離後、I CMVを100 µLの調製したばかりのペゴルに懸濁させ、37 °Cで30分間静置します。その後、小胞を二回蒸留水でさらに2回洗浄します。

最終ペレットをPBSで再懸濁し、ICM VSを4°Cで保存します。粒子を特性解析するために、冷えたICMV懸濁液を混ぜた後、サンプルの少量を分注し、2回蒸留水を用いて全量を1 mLに希釈します。次に、ICMVをゼータサイザーセルに入れ、動的光散乱およびゼータ電位測定システムを用いて、製造者の指示に従い、サンプルの粒子径、多分散指数、およびゼータ電位を測定します。

ova特異的ルシフェラーゼ発現CD8陽性T細胞を単離します。まず、OT-Iルシフェラーゼトランスジェニックマウスから脾臓を採取します。組織を5 mLの氷冷PBSおよび2% FBSに入れ、組織培養フード内へ移動させます。

3 mLシリンジのプランジャーを使用して、最大3個の脾臓を同時に70 µmストレーナーで研磨し、15 mLコニカルチューブに回収します。プランジャーとストレーナーをPBSおよび2% FBSで洗浄します。その後、脾臓1個あたり10 mLとなるように細胞懸濁液の全量を調整します。

総細胞数を測定し、細胞を遠心分離します。次に、市販の磁気陰性選択キットを用いて、製造者の指示に従ってCD8陽性脾細胞を分離します。その後、T細胞をPBSで洗浄します。

細胞数をカウントし、2～3×10⁵個の細胞を20 µLのマウスCD1632ブロッキング抗体中でインキュベートします。10分後、20 µLの抗CD8-APC抗体を細胞に添加して30分間静置し、フローサイトメトリーによって磁気ビーズで分離したCD8陽性T細胞集団の純度を評価します。次に、1～10×10⁵個のOT-IルシフェラーゼCD8陽性T細胞を、200 µLのPBSに懸濁し、未処置で除毛したアルビノC57BL/6マウスの尾静脈に静脈内投与により養子移植します。24時間後、ワクチン接種後適切な日数にワクチンを投与します。

10分後にLuciferを150 mg/kgで動物に注射し、全動物イメージングシステムを用いて5～10分間バイオルミネッセンス信号を取得してOT-I Lucifer CD8陽性T細胞を可視化し、適切なタイミングで抗原特異的CD8陽性T細胞数を決定します。ワクチン接種後、下顎下出血法によりワクチン接種マウスから約100 µLの血液をカリウムEDTAコートチューブに採取し、チューブを数回反転させて凝固を防ぎます。その後、100 µLの血液をマイクロ遠心チューブに移し、1 mLのACK溶血バッファーを加えます。

2〜3分後、細胞を遠心分離し、上清を除去します。残ったpbmcを1 mLのfax bufferで洗浄し、先に示したようにCD 1632を用いて非特異的結合をブロックします。10分後、細胞懸濁液を4 mLの丸底faxチューブに分注し、製造元の指示に従い、各サンプルに20 µLのH two KB over tetramer syn fecal PE溶液を添加します。

氷上で30分間静置した後、各実験サンプルに適切な抗体カクテルを20 µL加え、各コントロールサンプルには各fluoro fourタグテトラマーまたは抗体に対応するシングルfluoro fourコントロール抗体を加えます。最後に、さらに20分間インキュベートした後、すべてのサンプルをfax bufferで洗浄し、DPIを添加したfax bufferでペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーで解析します。fluoro fourタグタンパク質抗原と蛍光親油性色素を共負荷したCMVにより、抗原およびナノ粒子のin vivoでのデリバリーを可視化できます。例えば、共焦点顕微鏡イメージングにより、尾基部に皮下投与された可溶性抗原は、投与から4時間以内にドレナージリンパ節に到達し、24時間までに除去されることが示されています。

対照的に、過負荷のI CMVは、投与後24時間までにまず排出リンパ節の周辺部で検出され、その後も蓄積が続くことで、排出リンパ組織内に大量のova I CMVが沈着します。実際、ワクチン接種当日にOT-I Luciferase CD8陽性T細胞を適応移入したC57BL/6マウスの生物発光イメージングでは、接種後4日目までにOT-I luciferase T細胞のバックグラウンドレベルは最小限まで低下することが示されています。しかし、ova MPI CMVを免疫したマウスでは、排出される鼠径リンパ節内に強力な生物発光シグナルが認められます。

一方、可溶性OVAをワクチン接種したマウスでは、ドレナージリンパ節内におけるOT-I Lucifer CD8陽性T細胞の増殖が大幅に抑制されていることが示されました。さらに、抗原特異的T細胞を養子移入せずに可溶性OVAとMPLAで免疫したマウスでは、PBMCの週次モニタリングによって示されるように、OVA特異的CD8陽性T細胞の顕著な増殖は認められませんでした。しかしながら、ICMVワクチン接種は、より強力な内因性CD8陽性T cell応答を誘導し、41日目までにPBMC中のCD8陽性T細胞分画において、syn fecalテトラマー陽性T細胞がピーク時に28%に達しました。このビデオを視聴することで、脂質ベースのナノ粒子の合成方法、免疫の実施方法、および生体内でCTLの増殖を可視化および定量化する方法について十分に理解できるはずです。

これらの手法をさらに修正することで、CTL応答に関する追加情報を明らかにすることができます。例えば、細胞のメモリー表現型を評価するために、CD 1 27、BCL two、K lrg oneなどの追加マーカーを用いてテエル染色アッセイを補完することが可能です。