Name: ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8+T細胞応答の分析手法。マウスモデルを用いた全動物イメージングとフローサイトメトリーにより、リポソームベースのICMVナノ粒子が誘導する細胞性免疫応答を非侵襲的に可視化・定量化する方法を解説。

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この研究は、米国立衛生研究所が1K22AI097291-01を付与することにより支持され、受賞数UL1TR000433下で国立衛生研究所のトランスレーショナル科学を前進させるための国立センターによるましました。また、MITの教授ダレルアーバインとワクチンナノ粒子とOT-I /リュックトランスジェニックマウスの初期の作品の彼らの貢献のためのフレッド·ハッチンソンがんセンター教授マティアスステファンを認めます。

このプロトコルで説明されているすべての実験は、ミシガン大学で動物の使用およびケアに関する大学委員会（UCUCA）によって承認され、確立されたポリシーとガイドラインに従って行いました。 ICMVsの1の合成とキャラクタリゼーションタンパク質抗原およびアジュバント分子との共同ロード<ol><li> - [4-（p個の -maleimidophenyl）ブチルアミド] 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DOPC）および1,2- dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- Nのモル比1：1を混ぜますのクロロホルム（MPB）、バッチ当たり1.26マイクロモルで合計脂質量を維持する（ すなわち、DOPC500μgのとMPBの630μgの）20mlのガラスバイアル（直径= 28ミリメートル、高さ= 61ミリメートル）で。 </li><li>所望の濃度の脂質溶液に、モノホスホリルリピドA（MPLA）のような親油性薬物、または親油性染料（ 例えば、DID）を追加します。徹底的に余分な乾燥nitrogeでパージすることによって有機溶媒を除去Nガス及び真空O / Nの下でサンプルを置きます。 </li><li>水溶性薬剤（ 例えば、タンパク質抗原）を含有する10mMのビス-トリスプロパン（BTP、pH7.0）中の200μLを加えることによって脂質膜を水和。 10秒室温で1時間ごとに10分間ボルテックス。 </li><li> 1.5 mlのマイクロチューブにガラスバイアルから内容を転送氷水浴中で場所のサンプル、および125 W / 20 kHzのプローブ先端の超音波処理器に設定40％の強度を用いて5分間連続して超音波処理します。 </li><li>各バッチ（使用濃度2.4 mM）の、渦、および卓上マイクロ遠心を使用して簡単に遠心に150mMのジチオスレイトール（DTT）の4μlを添加します。 </li><li> 200 mMのCaCl 2を40μlを添加して、ピペット（使用濃度33 mM）のと混合。 DTTでの脂質層をMPB含有の架橋を可能にするために1時間37℃でサンプルをインキュベートします。 </li><li>遠心分離機15分間20,000×gでのサンプル、上清を除去し、ddiH 2 Oの200μl中に再懸濁</li><li>上清からのCaCl 2、未反応のDTT、およびカプセル化されていない貨物の物質を除去するための第2のddiH 2 O洗浄後の手順を繰り返し、再び1.7遠心操作します。 </li><li> ddiH 2 Oで2 kDaのポリエチレングリコールチオール（PEG-SH）の10 mg / mlでの準備PEG-SH溶液100μlで各ICMVサンプルを再懸濁し、30分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 2 ddiH 2 O回の洗浄（ステップ1.7）を実行し、4℃での最終的なICMVのPBSでペレットと店を懸濁します。粒子は、長期保存後に底に沈殿することができるように、使用ICMV懸濁液を混合する前に。 </li><li>粒子の特徴付けのために、各バッチからICMVs少量の（〜10％）を除去し、ddiH 2 Oの1ミリリットルの全容量で個別に希釈DLSと（製造業者のプロトコルに従って）ゼータ電位測定システムを使用して試料のゼータサイザーセルと測定粒子径、多分散性指数、およびゼータ電位に単一のサンプルを置きます。 </li></ol>共焦点顕微鏡で蛍光タグ付きICMVsのリンパ節排出する2.検討<ol><li>フルオロフォアタグ付き抗原と親油性蛍光色素を負荷しICMVsの調製<ol><li>オボアルブミンなどのフルオロフォア標識タンパク質を、準備製造元の指示に従って、アレクサフルオロ555 - スクシンイミジルエステルと反応させました。 </li><li>脂質シェルでフォアでタグ付けICMVsを製造するために、親油性蛍光色素（ 例えば、1,1&#39;-ジオクタデシル-3,3,3 &#39;、3&#39;- Tetramethylindodicarbocyanine、（）DID）（脂質フィルムの製造中にステップを追加します1.2）0.05％モル脂質量で。脂質フィルムの水和（ステップ1.3）、フルオロフォアタグ付き抗原を含む使用バッファ、および完全なICMV合成の工程1.4から1.11に概説されるように。 </li></ol></li><li>尾の基部のナノ粒子の皮下投与<ol><li>導入室Uを搭載した制御フロー気化器を用いてマウスを麻酔IACUCに応じて3％イソフルランと酸素流量の1.5 L /分をtilizingは、動物プロトコルを承認しました。マウスは無意識になると、注射部位への最適なアクセスを可能にし、動物に不快感を最小限に抑えるため、身に着けている麻酔に素早く前に次の手順を実行します。あるいは、麻酔を維持するために、適切なフィットノーズコーンを使用。マウスを、より長い5分間麻酔した場合は、手順後の刺激を最小限にするために必要な眼の潤滑を適用します。 </li><li>サニタイズと皮膚の下に針を視覚化するために使用することができます目に見える皮膚の小さなパッチを公開するために毛皮のパートに濡れた髪を濡らす70％エタノールで尾の付け根をスプレーします。 </li><li> PBSでワクチン接種量100μlのあたり抗原およびアジュバントの所望の量を含む粒子注入懸濁液（ 例えば、10μgのOVAと注入量100μlのあたり0.3μgのMPLAが過去6,9で使用されている）を準備します。 </li><li>粒子懸濁int型を描きます27-29 G針を有するOA注射器と上向きにベベルと尾（生え際から〜5ミリメートル）の基部に針を挿入し、粒子懸濁液22の50μLを注入します。 </li><li>過度の逆流を防止し、針を引き出すために均等に圧力を数秒待ちます。両方の排水鼠径LNををターゲットにするテールベースの​​反対側に注射を繰り返します。 </li></ol></li><li>リンパ節の凍結切片を、共焦点顕微鏡での検査の準備。 <ol><li>動物プロトコルを承認しIACUCに応じて誘導され気胸に続くCO 2窒息でマウスを安楽死させます。 Bedoya 23で実証プロトコルに従って鼠径のLNを抽出し、4℃で1mlのPBSに組織を配置することによって、血液を洗い流します。 </li><li>組織と組織からPBSを吸収し、組織cryomoldsで組織を置く（10×10×5ミリメートル3）10月は、媒体24を凍結してトップに予め充填されました。スナップTISを凍結します30秒間液体窒素中でブロックを訴えます。代わりに、30分間ドライアイス上で組織ブロックを配置します。 ℃の冷凍庫で-80凍結組織を保管してください。 </li><li> -20℃24に設定したクライオスタットに5〜10ミクロンの厚さの組織切片をカットします。 </li><li>必要に応じて、免疫蛍光標識を行い、以前に示さ24と共焦点顕微鏡を用いて組織を調べます。 </li></ol></li></ol>動物全体のイメージングとナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的、ルシフェラーゼを発現するCD8 + T細胞の3モニタリング拡張<ol><li> OT-I / LucをトランスジェニックマウスからのOVA特異的257-264、ルシフェラーゼを発現するCD8 + T細胞の単離<ol><li> CO 2窒息とOT-I /リュックトランスジェニックマウスを安楽死させると、動物のプロトコルを承認しIACUCに応じて気胸を誘発します。腹腔にアクセスし、慎重に膵臓23から組織を取り外して滅菌方法で脾臓を収穫し、組織培養フードに転送するために4℃でPBS + 2％FBS 5ml中の場所。 </li><li> （一度に3脾臓まで）50mlコニカル遠心分離管の上に70ミクロンのナイロンストレーナの脾臓を置きます。 3ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、ストレーナを介して細胞を粉砕​​。 </li><li> PBS + 2％FBSでプランジャとストレーナーを洗浄し、廃棄します。 300×gで10分間、10ミリリットル/ 50 mlチューブで脾臓に全量を血球計数器で計数するために、細胞懸濁液の少量のサンプルを取り、遠心。 </li><li>市販の磁気陰性選択キットを用い、製造者の指示に従って、CD8 + T細胞集団を単離します。 </li><li> PBSで細胞を洗浄した後、単離されたCD8 + T細胞の数を数えます。単離されたCD8 + T細胞の純度を評価するために、次にαCD8-APC抗体の20μlを添加、10分間マウスCD16 / 32抗体（0.025 mg / mlの）20μlに〜20,000〜30,000細胞をインキュベート（0.005 mg / mlの）そして30分間インキュベートします。ペーBSA w / vのrform PBS中4℃でのインキュベーションは全て+ 1％。フローサイトメトリー分析25を行います。 </li></ol></li><li>養子単離されたCD8 + T細胞の移動およびその拡張ワクチン接種後の可視化<ol><li>静脈尾静脈注射22（日-1）を介して、200μlのPBS体積で1-10×10 5個の細胞を投与することによって、ナイーブC57BL / 6マウスに、単離されたOT-I /リュックCD8 + T細胞の養子移入を行います。マウスは剃毛アルビノC57BL / 6、C57BL / 6マウスにおいて、毛皮、黒皮パッチは、生物発光信号を妨害する可能性があることを考慮すると、これらの研究に最適です。 </li><li>以前（2.2節）に記載のように1日（0日）後、ワクチンを投与します。 </li><li> 300μlのPBSの容量で腹腔内キロマウス体重あたりルシフェリン150mgのを管理します。 10分後、（ステップ2.2.1のように）をイソフルランでマウスを麻酔し、5〜10分間Wの生物発光シグナルを取得することによりOT-I / LucのCD8 + T細胞を可視化動物全体のイメージングシステムi番目（IVIS;詳細な指示のためにウィルソン26を参照）。長期的な研究のために必要に応じて繰り返します。 </li></ol></li></ol>抗原特異的CD8 + T細胞の分析のためのPBMCの4ペプチドMHCテトラマー染色注：以下のプロトコル手順は、養子養子移入することなく、OT-I / LucのCD8 + T細胞またはC57BL / 6マウスで転送C57BL / 6マウスのいずれかを用いて行うことができます。 <ol><li>ワクチン接種後の所望の時点で、K 2 EDTAでコーティングされたチューブに顎下出血法27を介してマウスからの血液の約100μLの（4-6滴）を採取し、凝固を防止するために数回転倒。 </li><li> 、マイクロ遠心チューブに血液の100μLを移すの溶解緩衝液1mlを添加し、赤血球（RBC）を除去するために、2〜3分間インキュベートします。 1,500×gで5分間遠心分離サンプル、上清を除去します。ペレットがまだの場合（RBCの不完全な除去を示す）赤ppearsは、溶解バッファーの短時間のインキュベーション（&lt;1分）で溶解工程を繰り返します。 </li><li> 5分間1,500×gで1（/ BSA V W PBS + 1％）のFACS緩衝液mlの遠心分離で、残りのPBMCを洗ってください。 </li><li>吸引し上清と非特異的結合とのFcR媒介性の抗体をブロックするために、マウスCD16 / 32抗体（0.025 mg / mlの）の20μlのサンプルを再懸濁します。 RTで10分間インキュベートします。 </li><li> 4ミリリットル丸底FACSチューブに微小遠心管から細胞を転送します。各サンプルに、製造業者の仕様書に従って、OVA四量-SIINFEKL-PEの溶液 B、H-2Kの20μlを添加して、氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>抗体カクテルを準備する（ 例えば、αCD8-APC、αCD44-FITC、およびαCD62L-PECy7抗体（それぞれ0.005、0.005、0.002 mg / mlの濃度、））。各実験サンプルに20μl加え、氷上で20分間インキュベートします。ラにより、単一の蛍光体のコントロールを準備します上に示した濃度の各蛍光団タグ付き四量体または抗体で細胞をbeling。 </li><li> FACS緩衝液で2回洗浄し、DAPIを2μg/ mlを含有するFACS緩衝液中に最終ペレットを再懸濁します。細胞は現在、フローサイトメトリー分析（詳細と例はScheffold 25に記載されています）の準備ができています。 </li></ol>

パーキンエルマーは、この資料の出版物中に発生し、生産コストを提供しました。

この資料に記載されているプロトコルは、新たな脂質ベースのナノ粒子系の合成および特徴付けを記載ICMVsと呼ばれる、抗原特異的CD8 + T細胞応答を誘導するために、ナノ粒子ベースのワクチン製剤の有効性を検証する方法を提供します。 ICMV合成は、典型的には、多くの場合の損失をもたらす、製造のための有機溶媒を必要とする他の一般的に使用されるポリマーナノ粒子システム（ 例えば 、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）酸 ​​粒子）に比べて大きな利点である、すべての水の状態で終了しますタンパク質抗原29,30における抗原性。また、大規模な安定性と能力からICMVsの利点は、このようなAPC 31,32内の同じ細胞内区画を標的とする抗原およびアジュバントの同時送達を可能にする、疎水性および親水性の両方の分子6をカプセル化します。モデルワクチンナノ粒子としてICMVsを使用して、ここでは、手順を概説しています（3）非侵襲的生物発光イメージング技術および（4）ペプチドMHCを用いて、（1）ナノ粒子の合成とキャラクタリゼーション、dLNsにナノ粒子排水の（2）の検証、および...

伝統的なワクチンの開発は、主に試行錯誤の経験的なアプローチを採用しています。しかし、生体材料および免疫活性化の分子決定の発見の広い配列の最近の開発と、それが合理的に病原体1,2に由来し、生物物理学的および生化学的な手がかりでワクチン製剤を設計することが可能になりました。具体的には、様々な粒子状薬物送達プラットフォームはリンパに存在する分解からワクチン成分を保護し、抗原提示細胞への抗原提示細胞（APC）を、それらの同時送達を増強、それらは、サブユニット抗原および免疫刺激剤と共ロードされるように、ワクチン担体として検討されていますノード（LNS）は、このように免疫刺激と活性化3-5を最大化します。以前に強力なワクチンplatforとして実証されている。この報告書では、我々は、「病原体模倣」ナノ粒子系の合成を記載呼ばれるinterbilayer架橋多層小胞（ICMVs）、強固な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）および全身および粘膜組織区画6-9両方における体液性免疫応答の誘発のために、M。特に、ICMVsでのワクチン接種は、従来のアジュバントを用いたワクチン接種（ 例えば、ミョウバンとモンタニド）7と比較して、マラリア抗原に対して実質的に強化された血清IgGレベルを達成し、また、マウス9中の腫瘍細胞とウイルス攻撃モデルに対して強力なCTL応答を誘発しました。ここでは、モデルのワクチンナノ粒子系としてICMVsを使用して、我々は凍結切片組織7の共焦点イメージングを利用するのLNを排出する粒子径とゼータ電位測定と粒子輸送の追跡（dLNs）を含むワクチンナノ製剤の特徴付けのための方法を記載しています。また、我々は、ルシフェラーゼ発現抗原特異的CD8 + T細胞9,10の養子移入後のマウスにおけるCTL応答の展開を分析する全動物イメージングベースの方法を提示します。最後に、デナノ粒子6,9をワクチン接種したマウスにおける内因性のT細胞応答の長手方向の定量化のための末梢血単核細胞（PBMC）のスクライブテトラマー染色。 ICMVsその後、化学的にジチオール架橋剤6と脂質層内の架橋マレイミド官能化リン脂質頭部基によって安定化されている多層構造の中に簡単なリポソームの制御融合することにより合成脂質ベースのナノ粒子製剤です。 ICMVsが合成されると、ナノ粒子の小部分は、粒子サイズとゼータ電位動的光散乱（DLS）システムとゼータ電位アナライザーでの（ すなわち 、粒子の表面電荷）を決定するために使用することができます。 DLSは、拡散係数および粒子11の流体力学的サイズの決定を可能にする、粒子懸濁液の光散乱の変化を測定します。バッチからバッチ合成に一貫性の粒子サイズを達成することは非常に重要です以来、粒子サイズはdLNsおよびAPC 12,13によるその後の細胞取り込みにワクチン粒子のリンパ排水に影響を与える主な要因の一つです。また、ゼータ電位は、粒子と粒子表面電荷11の電気泳動移動度を決定することができる電流が印加された粒子の速度を測定することによって得ることができます。粒子の表面電荷は、貯蔵中およびin vivo投与後の14,15粒子分散液に直接影響するコロイド安定性を決定するため、粒子の一貫したゼータ電位値を確保することが重要です。 dLNsに粒子の局在化を追跡するために、ICMVsは、親油性染料と共有結合的にタグ化抗原を含む、所望のフルオロフォアで標識することができます。免疫化の後、マウスは、種々の時点で切除dLNsを安楽死させ凍結切片、および共焦点顕微鏡を用いて分析することができます。この技術は、リンパのDraIの可視化を可能にdLNsへのナノ粒子ワクチン担体および抗原の両方の寧。組織切片は、さらに、蛍光標識抗体で染色し、そのような我々は以前に7を示しているように胚中心の抗原および形成に関連する細胞の種類として、より多くの情報を得るために利用することができます。 粒子合成が最適化され、dLNsへトラフィッキングが確認されると、それは、 インビボ CTL拡張の誘発を検証することが重要です。ナノ粒子ワクチン接種に応答して、抗原特異的CD8 + T細胞の誘発を分析するために、我々は、詳細な免疫学的な分析を可能にOVA 257-264ペプチド（SIINFEKL）免疫優性CD8 + T細胞エピトープと、モデル抗原、オボアルブミン（OVA）を利用しています初期ワクチン開発16,17のための抗原特異的T細胞応答の。具体的には、抗原特異的CD8 + T細胞の増殖および移動の動態を調べるために、我々が生成しました（H-2K bの関連で）SIINFEKLに特異的なT細胞受容体（TCR）とCD8 + T細胞を有するOT-Iトランスジェニックマウスを用いて、ホタルルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウス（リュック）を交配することによって、二重トランスジェニックマウスモデル。これらのOT-I / Lucのマウスから、ルシフェラーゼを発現する、OT-I CD8 + T細胞を単離し、ナイーブC57BL / 6マウスへの養子移入のために調製することができます。播種後、OVA含有ナノ粒子で成功免疫は、動物全体のイメージングシステム9,10で生物発光シグナルを監視することによって追跡することができる転送T細胞の拡大をもたらします。この非侵襲的な全身イメージング技術は、長手方向の様式で末梢組織へのT細胞のリンパ組織の拡大と普及に関与するプロセスを明らかに、過去18〜20の他のウイルスまたは腫瘍抗原で使用されてきました。 養子移入の抗原特異的CD8 + T細胞の分析に相補的なendogeno米国T細胞応答が使用される、ワクチン接種は、4つのフルオロフォアタグ化MHCクラスI分子からなるペプチド-MHC四量体複合体は、ペプチドエピトープを負荷したペプチド-主要組織適合遺伝子複合体（MHC）四量体アッセイ21を用いて検査することができるポスト抗原特異的にTCRとラベルCD8 + T細胞に結合します。ペプチド-MHC四量体アッセイは、リンパ系および末梢組織中の抗原特異的CD8 + T細胞を同定するための端子剖検研究にまたは連続採血から得られた末梢血単核細胞（PBMC）と縦断的研究のいずれかで行うことができます。ペプチドMHC四量体でリンパ球を染色した後、フローサイトメトリー分析CTLの表現型またはCD8 + T細胞のうち、その頻度の定量に詳細な分析を行います。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1.タンパク質抗原とアジュバント分子を共装填したICMVの合成とキャラクタリゼーション</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide](ナトリウム塩) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>モノホスホリル脂質A(合成)(PHAD&trade;)(MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>20 mlガラスバイアルウィ</td><td>ートン</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>シンプニー真空オーブン</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>オボアルブミン(OVA)</td><td>ワージントン</td><td>3054</td><td></td></tr>ビス<tr><td>トリスプロパン(BTP)</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125ソニケーター(125&nbsp;W/20&nbsp;kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa チオレートポリエチレングリコール (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>マルバーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼータサイザー キュベット</td><td>マルバーン</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2.共焦点顕微鏡による蛍光タグ付きICMVのリンパ節ドレナージの検査</td></tr><tr><td>1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン、4-クロロベンゼンスルホン酸塩 (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 凍結培地&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュクライオモールドVWR</td><td></td><td>25608-922<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">3。全動物イメージング</td></tr><tr><td>C57BL/6マウス</td><td>ジャクソン</td><td>000664</td>アルビノC57BL/6マウスジャクソン000058 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OT-1C57BL/6マウス</td>ジャ<td>クソン</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70&mu;mナイロンストレーナーBD</td><td></td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade;マウス CD8+ T 細胞単離キット</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; 全動物イメージングシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4.抗原特異的CD8+ T細胞のフローサイトメトリー分析のための末梢血単核細胞(PBMC)のペプチド-MHC四量体染色</strong</td></tr><tr><td>>K2EDTAチューブBD</td><td></td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK溶解バッファーLife</td><td>Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗CD16/32 FCブロック</td><td>エバイオサイエンス</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVAテトラマー</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031 抗</td><td></td></tr><tr><td>CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>抗CD62L-PECy7</td><td>エバイオサイエンス</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyan Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的cd8 + t細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

従来のワクチンアジュバント、例えばミョウバンは、最適ではないCD8+ T細胞反応を誘発します。ワクチン開発におけるこの大きな課題に対処するために、病原体の特徴を模倣して、ドレインリンパ節への抗原送達を改善し、抗原提示細胞による抗原取り込みを増加させるさまざまなナノ粒子システムが設計され、抗原特異的CD8+ T細胞応答の誘導に最適化された新しいワクチン製剤が生まれています。この記事では、サブユニット抗原と免疫刺激剤の共送達、および強力な細胞傷害性CD8+ Tリンパ球(CTL)応答の誘発に効果的なワクチンキャリアとして機能することができる、二層間架橋マルチラメラ小胞(ICMV)と呼ばれる「病原体模倣」ナノ粒子システムの合成について説明します。動的光散乱およびゼータ電位アナライザーを使用してワクチンナノ粒子の流体力学的サイズと表面電荷を特徴付ける方法を説明し、ナノ粒子を介したリンパ節への抗原送達を分析するための共焦点顕微鏡ベースの手順を紹介します。さらに、ルシフェラーゼを発現する抗原特異的CD8+ T細胞のレシピエントマウスへの養子導入と、それに続くナノ粒子ワクチン接種を利用した新しい生物発光全動物イメージング技術を示します。これにより、CTLの増殖パターンと輸送パターンをリアルタイムで非侵襲的に調査できます。また、ナノ粒子をワクチン接種したマウスの内因性T細胞応答の縦断的定量のための末梢血単核細胞の四量体染色とフローサイトメトリー解析についても説明します。

ICMVsの合成に関与するステップは、図1~6に示されている。簡単に言えば、任意の親油性薬剤または蛍光色素を含む脂質膜は、親水性薬物の存在下で水和します。例えばCa 2+などの二価カチオンは、多重膜小胞にアニオン性のリポソームの融合を駆動するために添加されます。例えば、DTTなどのチオール架橋剤は、脂質層を並置の「ステープル」マレイミド官能化脂質に添加し、最終的に残りの外部マレイミド基は、チオール化、PEG部分との反応で急冷されます。各バッチの小部分は、容易にDLSとゼータ電位分析システムを用いて粒子サイズ、多分散性指数、およびゼータ電位を測定することにより、品質管理測定に供することができます。得られた粒子は、OVA封入pの平均130±20nmのサイズ、0.22±0.02の多分散性指数、および-54±3 mVのゼータ電位を有する比較的均質です記事（ 図1Bおよび1C）。粒子の乾燥重量で測定された粒子の典型的な収率は、50％〜6です。 上記のプロトコ...

私たちは、ワクチン接種のマウスモデルにおいて、ナノ粒子による免疫に対する抗原特異的CD8+ T細胞の増殖を監視するための全動物イメージングおよびフローサイトメトリーベースの技術について説明します。

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

本実験の全体的な目的は、脂質ベースのワクチンナノ粒子を合成および特性評価し、生体内で抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球の増殖を誘導する能力を評価することです。これは、抗原とアジュバントを共封入し、病原体を模倣した層間架橋マルチラメラ小胞（I CMV）を構築し、ナイーブマウスにワクチン接種を行うことで達成されます。さらに、ルシフェラーゼを発現する抗原特異的CD8陽性T細胞を養親的に移入します。第2段階では、抗原特異的CD8陽性T細胞の増殖を、個体レベルのin vivoイメージングによって評価します。次に、ICMVを免疫した動物から採取した末梢血単核細胞を、蛍光標識テトラマーで染色し、フローサイトメトリーで解析することで、全身循環における内在性抗原特異的CD8陽性T細胞の頻度を定量化します。最終的に、生物発光イメージングを用いて、ナノ粒子ワクチン接種に応答して増殖する抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球を追跡することが可能です。これらの手法は、細胞障害性Tリンパ球の拡大範囲はどの程度か、またナノ粒子ワクチン接種に反応してこれらの細胞はどのようにさまざまな組織へ移動するか、といったワクチン設計における重要な予備的疑問に答えるのに役立ちます。組織壊死後のin situ T細胞解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、T細胞反応のin vivoイメージングが非侵襲的であることです。これにより、同一個体の縦断的なモニタリングが可能になります。まず、20 mLのガラスバイアル内で、DOPCとMPBをクロロホルム中で1:1のモル比で混合し、1バッチあたりの総脂質量を1.26 µmolに維持することから始めてください。次に、親油性貨物を目的の濃度で脂質溶液に加え、超乾燥窒素ガスでパージして有機溶媒を完全に除去します。サンプルを overnight で真空下に置き、翌朝、目的の水溶性貨物を含む 10 millimolar BTP を 200 microliters 加えて脂質膜を水和させます。得られた溶液を室温で 1 時間、10 分ごとに 10 秒間ボルテックスします。その後、内容物を 1.5 milliliter マイクロ遠心チューブに移します。次に、チューブを氷水浴に置き、125 W、20 kHzのプローブチップソニケーターを用いて、強度40%の設定で連続超音波処理を行います。5分後、150 mM DTTを4 µLチューブに加え、ボルテックスで混合し、マイクロ遠心機でサンプルをスピンダウンさせます。その後、200 mM 塩化カルシウムを40 µLサンプルに混ぜ、続いて37 °Cで1時間、DTTを用いて脂質層を含むMPBを架橋させます。インキュベーション終了後、溶液を3回遠心分離します。2回目と3回目の遠心分離では、200 µLの二回蒸留水を用い、上清から未反応の塩化カルシウム、DTT、および封入されなかったカーゴ物質を除去します。最後の遠心分離後、I CMVを100 µLの調製したばかりのペゴルに懸濁させ、37 °Cで30分間静置します。その後、小胞を二回蒸留水でさらに2回洗浄します。最終ペレットをPBSで再懸濁し、ICM VSを4°Cで保存します。粒子を特性解析するために、冷えたICMV懸濁液を混ぜた後、サンプルの少量を分注し、2回蒸留水を用いて全量を1 mLに希釈します。次に、ICMVをゼータサイザーセルに入れ、動的光散乱およびゼータ電位測定システムを用いて、製造者の指示に従い、サンプルの粒子径、多分散指数、およびゼータ電位を測定します。ova特異的ルシフェラーゼ発現CD8陽性T細胞を単離します。まず、OT-Iルシフェラーゼトランスジェニックマウスから脾臓を採取します。組織を5 mLの氷冷PBSおよび2% FBSに入れ、組織培養フード内へ移動させます。3 mLシリンジのプランジャーを使用して、最大3個の脾臓を同時に70 µmストレーナーで研磨し、15 mLコニカルチューブに回収します。プランジャーとストレーナーをPBSおよび2% FBSで洗浄します。その後、脾臓1個あたり10 mLとなるように細胞懸濁液の全量を調整します。総細胞数を測定し、細胞を遠心分離します。次に、市販の磁気陰性選択キットを用いて、製造者の指示に従ってCD8陽性脾細胞を分離します。その後、T細胞をPBSで洗浄します。細胞数をカウントし、2～3×10⁵個の細胞を20 µLのマウスCD1632ブロッキング抗体中でインキュベートします。10分後、20 µLの抗CD8-APC抗体を細胞に添加して30分間静置し、フローサイトメトリーによって磁気ビーズで分離したCD8陽性T細胞集団の純度を評価します。次に、1～10×10⁵個のOT-IルシフェラーゼCD8陽性T細胞を、200 µLのPBSに懸濁し、未処置で除毛したアルビノC57BL/6マウスの尾静脈に静脈内投与により養子移植します。24時間後、ワクチン接種後適切な日数にワクチンを投与します。10分後にLuciferを150 mg/kgで動物に注射し、全動物イメージングシステムを用いて5～10分間バイオルミネッセンス信号を取得してOT-I Lucifer CD8陽性T細胞を可視化し、適切なタイミングで抗原特異的CD8陽性T細胞数を決定します。ワクチン接種後、下顎下出血法によりワクチン接種マウスから約100 µLの血液をカリウムEDTAコートチューブに採取し、チューブを数回反転させて凝固を防ぎます。その後、100 µLの血液をマイクロ遠心チューブに移し、1 mLのACK溶血バッファーを加えます。2〜3分後、細胞を遠心分離し、上清を除去します。残ったpbmcを1 mLのfax bufferで洗浄し、先に示したようにCD 1632を用いて非特異的結合をブロックします。10分後、細胞懸濁液を4 mLの丸底faxチューブに分注し、製造元の指示に従い、各サンプルに20 µLのH two KB over tetramer syn fecal PE溶液を添加します。氷上で30分間静置した後、各実験サンプルに適切な抗体カクテルを20 µL加え、各コントロールサンプルには各fluoro fourタグテトラマーまたは抗体に対応するシングルfluoro fourコントロール抗体を加えます。最後に、さらに20分間インキュベートした後、すべてのサンプルをfax bufferで洗浄し、DPIを添加したfax bufferでペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーで解析します。fluoro fourタグタンパク質抗原と蛍光親油性色素を共負荷したCMVにより、抗原およびナノ粒子のin vivoでのデリバリーを可視化できます。例えば、共焦点顕微鏡イメージングにより、尾基部に皮下投与された可溶性抗原は、投与から4時間以内にドレナージリンパ節に到達し、24時間までに除去されることが示されています。対照的に、過負荷のI CMVは、投与後24時間までにまず排出リンパ節の周辺部で検出され、その後も蓄積が続くことで、排出リンパ組織内に大量のova I CMVが沈着します。実際、ワクチン接種当日にOT-I Luciferase CD8陽性T細胞を適応移入したC57BL/6マウスの生物発光イメージングでは、接種後4日目までにOT-I luciferase T細胞のバックグラウンドレベルは最小限まで低下することが示されています。しかし、ova MPI CMVを免疫したマウスでは、排出される鼠径リンパ節内に強力な生物発光シグナルが認められます。一方、可溶性OVAをワクチン接種したマウスでは、ドレナージリンパ節内におけるOT-I Lucifer CD8陽性T細胞の増殖が大幅に抑制されていることが示されました。さらに、抗原特異的T細胞を養子移入せずに可溶性OVAとMPLAで免疫したマウスでは、PBMCの週次モニタリングによって示されるように、OVA特異的CD8陽性T細胞の顕著な増殖は認められませんでした。しかしながら、ICMVワクチン接種は、より強力な内因性CD8陽性T cell応答を誘導し、41日目までにPBMC中のCD8陽性T細胞分画において、syn fecalテトラマー陽性T細胞がピーク時に28%に達しました。このビデオを視聴することで、脂質ベースのナノ粒子の合成方法、免疫の実施方法、および生体内でCTLの増殖を可視化および定量化する方法について十分に理解できるはずです。これらの手法をさらに修正することで、CTL応答に関する追加情報を明らかにすることができます。例えば、細胞のメモリー表現型を評価するために、CD 1 27、BCL two、K lrg oneなどの追加マーカーを用いてテエル染色アッセイを補完することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

このビデオでは、抗原性ペプチドをロードしたMHC-Igsと抗CD28抗体で機能化された磁性ナノ粒子ベースの人工抗原提示細胞(aAPC)を使用して、希少抗原特異的CD8+ T細胞を単離するためのプロトコルについて説明しています。抗原性ペプチド標的T細胞受容体を特異的に発現するCD8+ T細胞とaAPCsとの相互作用、およびその後のin vitroでの増殖により、このCD8+...

ナノ粒子による抗原特異的CD8+ T細胞の濃縮と増殖

このビデオでは、さまざまな細胞周期の段階で抗原特異的なCD8+...

抗原特異的CD8+ T細胞の細胞周期解析のためのアッセイ

このビデオは、in vivoアジュバント誘導性細胞傷害性Tリンパ球またはCTL産生をモニターする免疫学的方法を示しています。マウスに、遺伝子操作された増殖性色素染色ドナーCD8+ Tリンパ球を事前に注射します。オボアルブミンにアジュバントを皮下注射すると、細胞傷害性CD8+...

アジュバント媒介性細胞傷害性Tリンパ球の生成をモニターする免疫学的手法

フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。...

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

このプロトコルは、蛍光色素標識ナノボディおよび従来の抗体を使用して、マウスにおけるin vivo近赤外蛍光異種移植イメージング実験のex...

ナノボディ及び抗体ベースの検証<em&gt;インビボ</em使用してマウスにおける&gt;腫瘍異種移植NIRFイメージング実験<em&gt;エクスビボ</em&gt;フローサイトメトリーおよび顕微鏡

ここでは、主なヒト T 細胞と抗原提示細胞の間の免疫シナプスの定性・定量分析の完全なワークフローをについて説明します。メソッドは、取得および時間の比較的短い期間内に数千の細胞像の評価イメージング cytometry...

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

抗原特異的 T 細胞は特性またはその極低周波による治療を利用しにくい。本明細書で我々 はこれらの細胞を豊かにする抗原特異的 T 細胞に結合することができます磁性粒子を開発するためのプロトコルを提供し、それらをいくつか展開する特性評価および治療の両方の 100...

豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開

ここでは、元のプロトコルを提案生体内抗原特異的 CD8 の定性的検出+ T 細胞。分析は、単一細胞懸濁液の臓器や血液量が少ないからで可能です。広範な研究には、細胞傷害性 T 細胞の反応 (予防接種・癌免疫療法研究)...

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量+ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

クローン拡張は、抗原特異的T細胞応答の重要な特徴である。しかし、抗原応答性T細胞の細胞周期は、技術的な制限もあって、十分に調査されていない。ワクチン接種マウスの脾臓およびリンパ節におけるクローン膨張性抗原特異的CD8...

ワクチン接種マウスにおける抗原特異的CD8 T細胞の細胞周期解析のためのDNA/Ki67ベースのフローサイトメトリーアッセイ

このプロトコルは、ナノエマルジョンオフィオポゴニンDアジュバントが効果的な細胞性免疫応答を促進するかどうかを評価するための詳細な方法を提示する。...

インビトロ ナノエマルジョンワクチンアジュバントオフィオポゴニンDの細胞活性評価

学ぶナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8+T細胞応答の分析手法。マウスモデルを用いた全動物イメージングとフローサイトメトリーにより、リポソームベースのICMVナノ粒子が誘導する細胞性免疫応答を非侵襲的に可視化・定量化する方法を解説。

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

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