の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系マラリア原虫 Rhoptryタンパク質

次の実験の全体的な目標は、helaベースの無細胞発現システムを使用してマラリア原虫タンパク質を翻訳し、微量の翻訳産物からタンパク質を精製することです。これは、マラリア原虫遺伝子をクローニングして、マラリア組換えRTツリータンパク質の2ステップおよび1ステップのin vitro翻訳、無細胞発現のための組換えプラスミドを調製することによって達成されます。組換えタンパク質を翻訳するために、調製したプラスミドを転写ミックスとインキュベートします。

mRNAを転写する2ステップ発現システムを使用する場合、得られたmRNAは、タンパク質翻訳のための翻訳ミックスに添加されます。ワンステップ発現システムを使用しながら、組換えプラスミドをhela細胞ライセートとインキュベートして、組換えタンパク質の転写と翻訳を行います。その後、組換えタンパク質は微量の翻訳産物から精製されます。

その結果、ウェスタンブロッティング分析に基づく発現と精製が成功したことが示されています。この技術が他の技術(コムギ胚芽発現系やウサギ網状赤血球溶解物系など)と比較した場合の主な利点は、このシステムがタンパク質を3時間で発現できることです。コーディングの最適化は必要ありません。

手頃な価格で使いやすいです。マイクロアレイ上で複数の抗原をスクリーニングできるため、治療や診断のための抗原の検出が可能になります。一般に、この方法に不慣れな人は、無細胞発現であるため、タンパク質を微量に発現するため、タンパク質の精製が非常に困難になるため、苦労します。

最初にこのシステムを使用することを思いついたのは、大腸菌を使用してタンパク質を爆発的に発現させることができず、他の発現システムが高価で時間がかかることがわかったためです。そこで、代替システムとしてhelaベースの無細胞発現系を探求することにしました。2ステップヒトin vitroタンパク質発現のためのテキストプロトコルに記載されているように、組換えプラスミドベクターDNAを含む転写混合物の20マイクロリットルを調製する。

DNAテンプレートを使用する。マイクロ遠心チューブで成分を混合し、水浴中で摂氏30度で75分間インキュベートします。次に、転写混合物の2マイクロリットルを取り、それをヘラ細胞溶解物を含む翻訳混合物の23マイクロリットルに加えます。

得られた混合物を摂氏30度で90分間インキュベートします。翻訳された製品は摂氏マイナス20度で保管してください。次に、組換えプラスミドベクター、DNAおよび彼をDNAテンプレートのためのワンステップヒト結合in vitro翻訳タンパク質発現のためのテキストプロトコールに記載されているように溶解物を含む転写および翻訳混合物の25マイクロリットルを調製する。

この反応混合物を摂氏30度で90分から6時間インキュベートし、翻訳生成物を摂氏マイナス20度で保存します。発現した組換えタンパク質を精製するには、75マイクロリットルの1つのX精製バッファーを25マイクロリットルの翻訳産物に加えて、100マイクロリットルの精製混合物を作製します。300マイクロリットルの蒸留水と300マイクロリットルの結合緩衝液を加えて、ニッケル樹脂を2回洗浄します。

樹脂を再懸濁し、14, 000 Gで1分間遠心分離して、余分なエタノールを除去します。次に、調製した精製液100マイクロリットルをニッケルキレート樹脂100マイクロリットルに加え、混合物を端部でインキュベートします。室温で60分間シェーカーを終了します。

混合物を14, 000Gで1分間遠心分離し、スーパーナートをフロースルーとラベル付けされた新しいチューブに収集します。100マイクロリットルの1 x Wash Bufferでレジンを洗浄し、1分間14, 000 GSで遠心分離し、洗浄とラベル付けされた新しいチューブにスーパーを収集します。洗濯後、この手順を2回繰り返します。

100 μリットルの1 x 溶出バッファーを樹脂に加え、エンドエンドシェーカーで15分間インキュベートします。その後、14, 000 Gs で 1 分間遠心分離します。Ellucianステップを毎回2回実行します。

上清を新しいマイクロ遠心チューブに集め、ellucianの後に溶出物として標識します。レジンは前と同じように2回洗い、摂氏4度で保管します。洗浄液や溶出サンプルを通したフローをマイナス20°C以下に保存して、ウェスタンブロッティングを行います。

まず、P偽のパラム大腸菌からのシェーン抽出物、発現した組換えR3タンパク質、調製した組換えタンパク質、およびアフィニティー法を用いて精製したタンパク質産物の別管を調製する。次に、メルカプトエタノールを含む電気泳動サンプルバッファーを各チューブに添加し、最終容量を20マイクロリットルにします。可溶化したタンパク質サンプルを作るには、チューブを2分間沸騰させます。

可溶化したタンパク質サンプルを10%SDSページゲルにロードし、ゲルを泳動した後にタンパク質を分離します。分離したタンパク質をSDSページゲルからニトロセルロース紙に電気泳動により、半乾燥ウェスタンブロッティングチャンバー内で2時間電気泳動し、ニトロセルロース紙を2%脱脂乳でブロッキングします。ニトロセルロースペーパーを、ネガティブコントロールのテキストプロトコールに記載されているポリクローナル抗体とインキュベートします。

また、ニトロセルロース紙を1〜100希釈した正常マウスおよびウサギ血清にインキュベートし、SB 2つの骨髄腫細胞からスーパーと名付けられた培養スーパーをインキュベートします。ニトロセルロースペーパーを摂氏4度で一晩インキュベートした後、ブロットバッファーで4回洗浄し、ホースラディスプレーオキシダーゼに結合した種特異的二次抗体とインキュベートし、2%ミルクで1000に希釈しました。次に、ニトロセルロースペーパーをブロットバッファーで再度4回洗浄します。

最後に、洗浄したニトロセルロース紙をカラー現像液とインキュベートし、AプラスBを暗所で30分間インキュベートし、in vitroヒト無細胞発現系を用いたマラリア原虫タンパク質の発現に成功したことが示されたように、RTツリー特異的ウサギ抗剤によって確認されたが、以前に発現した組換えタンパク質は、p FALsパレムおよびP Yoi Lee由来の寄生虫症vaeタンパク質に対する抗血清剤によって認識されなかった。 発現タンパク質に対するウサギ抗血清6 76の特異性を実証する。正常なウサギ血清は組換えタンパク質と反応しなかった。2ステップin vitroヒト無細胞発現システムおよび1ステップ結合in vitro翻訳システムを使用して翻訳します。

25 μリットルの翻訳タンパク質製品からの翻訳タンパク質の精製の成功例をここに示します。特に、maraの裂け目膜貫通タンパク質の精製に成功したことが示されています。また、遺伝子をコードするマラリア原虫RT木タンパク質からの仮想タンパク質の精製の成功も示されています。

最後に、マラリア原虫RTツリータンパク質を含むアルマジロリピートの精製が成功したことが示されています。精製後のタンパク質の収率は、開発後25マイクロリットルあたり3.5マイクログラムです。この技術は、寄生虫学分野の研究者が寄生虫のタンパク質特性評価、タンパク質間相互作用、抗体阻害研究、および寄生虫学分野におけるワクチン開発のための道を開きました。

このビデオを見れば、ヒーラーの無細胞ベースの細胞発現システムを使用して、マラリア原虫タンパク質を3時間で発現する方法を理解できるはずです。また、微量の翻訳製品からタンパク質を精製する方法についても理解できます。