Name: Subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ サブノルモサーミックマシン灌流によるヒト肝臓の機能的保存と回復法。21°Cで代謝回復と胆汁産生を評価し、移植前の臓器活力判定に有用な技術を解説します。

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米国国立衛生研究所からの資金調達は、CIMITプロジェクト第12から1732と感謝して認識されているシュライナーズ子ども病院（R01EB008678、R01DK096075、R01DK084053、R00DK088962とF32のDK103500を付与）。私たちは感謝して、この作業を支援するためのニューイングランドオルガン銀行を承認したいと思います。

ヒト組織の使用は、治験審査委員会（IRB）または同等によって審査されなければならない。ここで説明する作業は、承認され、マサチューセッツ総合病院施設内倫理委員会（第2011P001496）による免除宣言されました。 1.溶液の調製<ol><li>無菌的には、 表1に概説するようにレッド無ウィリアムズ培地Eをフェノールサプリメントを追加します。ソリューションは、使用前に新鮮な準備する必要があります。インスリンは、使用直前に追加する必要があります。 </li></ol>肝臓の2.バック表の準備<ol><li>無菌の、ドレープ表面に氷で満たされた臓器のボウルを置きます。冷たい保存液の袋に入れて残して、箱から肝臓を取り出します。ほとんどが水没肝臓にしてください。 </li><li>大動脈パッチの遠位に位置するであろう肝動脈（HA）を、特定します。 Metzenbaumはさみを使って長さに沿った様々なカットの枝を明らかにするために自由に動脈を解剖。慎重ディッセctの動脈の全長は、肝臓を供給する血管を切断防止する。目に見えるの端を持っていない枝を切断したり、結んだりしないでください。 </li><li>容器のサイズに応じて、サイズ0から4-0までの絹縫合糸を使用して肝臓を供給していないすべての動脈枝を結ぶ。 7-0プロレンのステッチと動脈の穴に結びつけるには短すぎるか、[閉じる支店。タイとは、腹腔トランク上での原点に近い脾臓、左胃動脈を切った。 </li><li>パッチの下に直接腹腔動脈を切断して、大動脈パッチを削除します。大動脈カニューレを用いて腹腔動脈にカニューレを挿入。 </li><li>門脈（PV）を特定し、ぶっきらぼうに無料でそれを分析。すべての枝を縛るとサイズ24チューブの準備セグメントとPVにカニューレを挿入。 </li><li>静脈自体を切断することなく、肝上大静脈からのダイヤフラムのセクションを削除します。直接臓器チャンバーに大静脈のドレインから流出する。 </li><li> 2フル周TIをカットssueサンプルを総胆管の端部から（2-3 mmの長さ）。スナップ液体窒素（-80℃で保存）で1を凍結し、それぞれ、組織と組織学的分析のために、10％緩衝ホルマリンに他の格納します。血管カニューレおよび膜型人工肺管からなるドレイン管と総胆管にカニューレを挿入。 </li><li> 0絹のネクタイと胆嚢管を識別し、連結する。胆嚢管は、総胆管と胆嚢の間に見出される。 </li><li>すべての空気を除去し、乳酸リンゲル（LR）ソリューションとプライムの氷冷袋チューブにフラッシュチューブセットを接続します。 </li><li>ゆっくり細流へのフラッシュの管に流量調整を設定します。門脈カニューレにフラッシュチューブを接続する前に、へそに指で門脈を閉塞し、門脈から空気を除去するためにフラッシュでカニューレと静脈を埋める。上の過度の圧力を避けるために、冷たい洗浄中に袋に肝臓の高さ以上の20以上のセンチ上昇させない静脈。 </li><li>フラッシュ簡潔時の最低点でのPVを閉塞する。漏れのPVを調べます。上記のように、血管枝は閉鎖することができる。氷のように冷たいLRの2 Lの合計PVを通して肝臓をフラッシュします。 </li><li>繰り返しますLR 1Lで2.10、HAのために2.11を繰り返します。 </li></ol> 3. SNMPシステムのプライミング<ol><li>プライム器官ボウルに灌流液の2 L（21℃）を添加し、プラ​​イムチューブにデバイスを起動することにより潅流装置。 21℃に温度を設定する、灌流の準備のために、デバイスの指示に従ってください。それぞれ、3 20mmHgの圧力とPVとHAに30 mmHgので始まります。ガソリンタンクを開き、3L /分の流量に設定されています。 </li><li>サンプルポートから0.3ミリリットルサンプルを吸引し、製造業者の説明書に従って、血液ガス分析装置でそれを実行して、HAおよびPV流入​​の両方からの血液ガスサンプルを取る。十分な酸素化を確認してください（PO 2&gt; 700 mmHg）で、pHを（7.35から7.45）。 </li><li>肝臓が接続される前に-80℃でエッペンドルフチュー​​ブとストアに= 0測定時のように灌流液の1.0ミリリットルのサンプルを取る。片刃鋼の刃を使用して肝臓から二±250mgのウェッジ検を切断し、スナップ液体窒素（-80℃で保存）で1を凍結し、10％緩衝ホルマリンに他の格納します。灌流前に肝臓を計量。 </li></ol> 4.ヒト肝灌流<ol><li>デバイスに肝臓を転送します。ステップ2.10のようにPVから空気を除去した後、PVカニューレにPV流入を接続します。同様の方法でHAを接続します。 3と30 mmHgのにPVとHA圧力を設定します。肝臓はほぼ灌流液によって水没する必要があります。脱水症状を防ぐために、湿った滅菌ガーゼで、流入血管を含む任意のドライ表面を覆う</li><li>胆汁チューブが回収容器に排出しましょう​​。胆汁ドレインの開口部がO実行す​​るために胆汁を可能にするために肝臓のレベルで以下であることを確認してください自由にUT。 </li><li>肝臓は21℃に温めた後、目標流量は、それぞれのPVとHAのために275〜325ミリリットル/ min.kg 50〜100ミリリットル/ min.kgです。すべての肝臓は灌流に異なって反応するので、最初の数分間の間に密接な流れを監視。目標流量に達していない場合、容器のいずれかの圧力を増加または減少させる。 HA上の50 mmHgのとPVで5 mmHgのを超えないようにしてください。 </li><li>試料は、研究者の好みで肝組織、灌流液および胆汁から得ることができる。私たちは、灌流の間に、最低でも次のサンプル収集レジメンをお勧めします。 <ol><li>組織生検、N = 2×250mgを、毎時間。ストレージ：-80°C、長期液体窒素とストア内の1を凍結スナップ。さらに、灌流の前および後に別の生検を取り、10％緩衝ホルマリンで固定した（n = 1） </li><li>灌流サンプル、N = 2X 1ミリリットル、最初の1時間は15分毎、その後30分ごと。 PVのINFからサンプルを描く低サンプルポート。ストレージ：-80°C長期的。 </li><li> PVおよびHA流入、及び大静脈流出の血液ガス分析。 N = 3×0.3ミリリットル、30分ごと。 PVとHA試料ポートの両方からサンプルを描画します。静脈に注射器を挿入することにより、大静脈から0.3ミリリットルのサンプルを描画し、直接血液ガス分析装置で実行されます。適切な酸素およびpHを確実にするために出力を使用してください。 </li><li>胆汁生産、N = 1×1ミリリットル、すべての時間。視覚胆汁生産を時間ごとに定量化し、回収容器からサンプルを取る。サンプリング後の容器を更新。ストレージ：ドライアイスと-80℃の長期的。 </li></ol></li><li> 3時間灌流を続けます。圧力、pHおよび酸素化を監視し、全体でサンプルを取る。灌流液に炭酸水素ナトリウムを添加することにより、彼のpHを調整します。 </li><li>肝臓が灌流されている間灌流の終わりには、最終的なサンプルを取る。肝臓を外し、胆管カニューレを削除します。 2ポスト灌流組織サンプルを取る-80℃で、10％緩衝ホルマリンに保存するために、前述したように、胆管。 </li><li>適切なバイオハザード処分ガイドラインに従ってヒト肝臓を捨てる。 </li></ol>

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</ol>

博士。 Uygun、K UygunとYarmushは、この研究（WO / 2011/002926）、および博士に関連する特許出願中の上の発明者であること。 Uygun、K UygunとYarmushは（35223分の2011 / WO）、本研究に関連する特許出願中の上の発明者であること。博士。 K Uygunとブルインスマはこの仕事に関連する仮特許出願を持っている。博士K UygunとBE Uygunはオルガンソリューションで経済的利害関係を持っている、同社は臓器保存技術の開発に注力しました。博士K UygunとUygunの利益は、金利政策の彼らの紛争に従ってMGHとパートナーズヘルスケアによって管理されていること。

虚血中に負傷した肝臓を回復しようとすると、我々は低温貯蔵の期間後に使用することができるSNMPシステムを開発しました。 Subnormothermicマシン灌流は、従来の低温貯蔵のほか、低体温と正常体温マシン灌流モダリティに対する実行可能な代替手段を提供しています。様々な異なるシステムが存在しています。すべてが異なる長所と短所の3,9,20を提供します。 SNMPは、21時の代謝酸素要求として、酸素運搬体なしで灌流を可能にし °Cは、灌流液の活発な酸素化によって満たされる。 subnormothermic条件下で還元するが、代謝が充実していると栄養豊富な灌流液のサポートが必要です。このようベルザー機械灌流液などの従来の灌流液は、組成物中で一般的に最小であると冷潅流のために設計されている。ウィリアムズE培地は、長年にわたって肝細胞培養培地として用い、及びcが含まれている暖かいex vivoでの条件の下で、特に、細胞機能をサポートするための普遍的であるomponents。 機械灌流中に行われた測定は、器官の機能を反映している。胆汁産生および酸素摂取量として直接観察可能なパラメータは、肝臓移植前に評価するために用いることができるリアルタイムの測定値である。同様に、細胞の損傷および虚血（K +、乳酸放出）のマーカーは、灌流液中に直接測定することができ、臓器機能20を示すことができる。機械灌流技術がさらに開発し、より広範な臨床応用を実現するように、ex vivoでの機能と臨床転帰との間の正確な相関関係を行うことができ、灌流パラメータは、移植または限界品質の肝臓を拒絶する決定を補助するのに有用であろう。また、ポイントオブケア分析ツールの進歩として、より洗練された分析では、マシンの間に直接利用できるようになりますperfuシオン21。 本研究では、肝臓組織学およびALTの放出によって反射された、肝臓に最小の損傷にSNMPシステムでサポートすることができることを示している。肝臓の機能回復は最高の肝臓の生存率に相関することが示されており、動物モデルでの移植の成功を強く示唆するものであるされたATP、によって反射される22。ex vivoでの肝臓移植片の移植前の回復は、ドナーの大幅な拡大を可能にする移植におけるドナーの肝臓の供給と需要の間に格差を補正し、肝プール、。

肝移植は、数十末期肝疾患に苦しむ患者の数千のための唯一の根治治療で​​ある。移植の成功は、それが移植片の急速な悪化を防止する必要があるレシピエントに移植されるまでドナーから調達された時点から、肝臓の最適な保護を容易にする。肝臓保存のための現在の標準は、「静的冷蔵」と呼ばれている：肝臓、それによって肝臓の代謝を低減し、虚血の有害な影響を減速、氷冷保存液で冷却される。この冷蔵技術は、そのような暖かい虚血や脂肪肝のショーによって損傷DCD器官としての限界品質劣る患者の転帰1の移植の成功、臓器に許可されているが。肝臓移植片の証拠そのex vivoでの機械灌流の急速に拡大ボディは、代替保存モダリティができ、潜在的にイムとしてありますこれらの限界臓器2,3のための成果を証明する。 肝移植は、自身の成功の犠牲者となっています。はるかに多くの患者が利用できる肝臓があるよりも、移植のために呼ばれ、何千人もが毎年米国で待機リストに死ぬ。ドナーの肝臓不足の現実と貧しい受信者の次善の品質の肝臓移植の増加利用を考えると、それは広く移植前に肝臓移植片のex vivoでのマシン灌流は肝移植におけるパラダイムシフトの約束を保持していることを保持されている。近年4-8のこのトピックの研究の関心が著しく増加している。様々なヨーロッパと北米センターでは低体温マシン灌流は、生理的温度での臨床導入8と正常体温マシン灌流は、最近捨て、人間の肝臓に適用されていると臨床的使用にも9に翻訳されてきた。連続的な最適化は、最適な灌流パラメータ10-12を識別しながら、大規模な開発は、様々なプロトコルが開発された。周縁質の移植片の使用は、過去10年間にわたって13 10倍以上増加している。肝臓保存（静的冷蔵）の現在の標準と比較すると、ex vivoでのマシン灌流は、臓器プールの待望の拡張につながるのすべては非常に多くの潜在的な利点を提供し、潜在的に移植後の合併症の発生率の減少。特に、現在、移植後の次善の品質の肝臓移植片を悩ま胆管合併症はかなりの問題14-18残る。 subnormothermic条件でのマシン灌流は客観的に移植19のための適合性などの移植片機能を評価するために時間ウィンドウを提供します。肝臓は、両方の灌流液aを、 エキソビボ回路で灌流されている間ndは、灌流の間に生成胆汁は臓器機能のマーカーの測定のためにサンプリングすることができる。このように、現在の基準の下での移植のために破棄され肝臓を客観的に移植に対する適性であると評価することができる「厳しく妥協」。これらの器官の多くは移植のために利用されるの生存能力評価が潜在的に可能にする。機械灌流の均等に強力な利点は、温かい/冷たい虚血により損傷を受けた肝臓の修復と改善である。 ATPは暖かく、その後の冷間虚血中非常に急速に枯渇していると前に肝臓20の移植に機械灌流の期間中にrepletedすることができます。肝臓は、そのエネルギー貯蔵及び代謝状態を補給して、予め調整され、レシピエントにおける移植後の再灌流障害の有害な影響のためのより良い準備。 この研究は、ヒトの肝臓にgrafのエクスビボ機械灌流する方法を記載技術とex vivoでの機械灌流の有益な効果の両方を勉強したい研究者にとって有用であろう研究室でTS、。我々は、移植のために減少され、その後、研究目的のために割り当てられたヒトのドナー肝臓を利用する。 標準の肝臓の調達技術は脳死ドナー（DBD）、または他の場所20でより詳細に説明循環死ドナー（DCD）で循環停止後の大動脈クロスクランプ後の肝臓の in situ動脈フラッシュに伴う。さらに、肝臓を氷ドナーの腹腔内に充填することにより、調達時に冷却される。フラッシュ液の好みは、ウィスコンシン大学またはヒスチジン - トリプトファン - ケトグルタル酸（HTK）溶液を使用して調達の大部分は、地域間で異なる。門脈の追加のバックテーブルのフラッシュは残留血液の洗い出しを向上させます。肝臓は、多くの場合、大動脈セグメントシュールを残して調達している腹腔トランクを丸め。胆嚢は、胆汁が吸引され、切開され、胆管がフラッシュされる。肝臓を氷冷保存液を含有する無菌袋に包装し、指定されたボックスまたは冷却器に輸送される。代表的な結果を得るには暖かく、冷たい虚血時間はそれぞれ、60分および12時間に制限する必要があります。人間の臓器、人間の臓器から得られた試​​料、および任意の老廃物を渡す際に伝染性の病原体のために日常的血清学的スクリーニングにもかかわらず、標準予防策が取られなければならない。 ここで、プロトコルは、市販の肝臓灌流装置を用いてsubnormothermic機械灌流を記載している。このような装置の使用は、臨床環境および研究グループおよび移植センターの間で、異なるプロトコルおよびデバイス設定の相互検証をより迅速翻訳を可能にする。

<table><tbody><tr><td>肝臓補助灌流装置</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>肝臓アシスト</td><td></td></tr><tr><td>肝臓アシスト使い捨てセット</td><td>臓器アシストB.V.</td><td>肝臓アシスト使い捨て</td><td></td></tr><tr><td>ウィリアムズミディアムE</td><td>シグマ</td><td>W1878&ndash;6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>イーライリリー&Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 5,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>MGH 薬局</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>カルボゲン ガス タンク 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>特殊ガス調整器</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer'sの解決</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10%の中立緩衝ホルマリン</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>歯付きAdson鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Debakey組織鉗子、7.75 "、2.25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaumはさみ7 "湾曲SureCutタングステン</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejoニードルホルダー5.5&ndash;7インチ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 黒編み絹縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 ナイロン縫合糸、Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>血液ガス分析機</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>バランススケール</td><td>コールパーマー</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>圧力表示ボックス</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て圧力ディスプレイセット</td><td>メドトロニック</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルド熱電対温度計とプローブ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-91500-04 および EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>どんぐり先端付き容器カニューレ、4 mm</td><td>メドトロニック</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>灌漑セット フラッシュチューブ</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>ミキシングボウル、4 L</td><td>コールパーマー</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

現在、移植可能な肝臓移植片が深刻に不足しています。 ドナーの肝臓のプールを拡大するためには、新しい臓器保存技術が必要です。 ドナー肝移植片の機械灌流は、従来の肝臓の冷蔵保存に代わるものであり、ドナー臓器プールを拡大するためのモダリティとして多くの有望性を持っています。私たちは最近、ヒト肝臓の正常体温以下の機械灌流の潜在的な利点について説明しました。 機械灌流された肝臓は、機能の改善と組織のATPレベルの回復を示しました。さらに、正常体温以下の温度での肝移植片の機械灌流により、移植に対する肝臓の機能性と適合性を客観的に評価できます。このようにして、以前は最適ではない品質のために廃棄されていた非常に多くの肝臓を、機械灌流の修復効果によって救出し、移植に利用することができます。 ここでは、このサブノーマルサーミックマシン灌流の手法について詳しく説明します。 研究に割り当てられたヒト肝移植片は、21°Cで無細胞性酸素化灌流物を使用して、肝動脈および門脈を介して灌流されます。

観察および分析の数は、流量および胆汁産生の直接リアルタイム観察、を含む、潅流中に、肝臓で行うことができる。そのような灌流液のガス分析、および生化学的灌流液の分析および組織学的分析を含むサンプル収集後に行われる事後測定のようなリアルタイム測定、。ここに述べた結果は、22灌流し、人間の肝臓からである。肝臓は、ドナーの年齢、過度の温阻血時間、生検の結果（脂肪症、炎症、線維症）と物流上の理由からなど、さまざまな理由から、移植のために拒絶された。 18肝臓を心臓死、次の調達、及び4脳死下記た。両方の場合において、ドナーは、ヘパリン30,000単位で前処理し、UW溶液でその場で、バックテーブルの上にフラッシュ。冷たい虚血時間は平均値は531±237（SD）分、平均温阻血時間は人生の撤退から測定し、27±10（SD）分であった冷たいフラッシュにサポート。事後測定を灌流した後明らかにされている間のリアルタイム観察及び測定は、潅流中に、肝臓を評価するために使用することができる。 リアルタイムの観測 肝臓を通る流れは冷たい肝臓における高抵抗の結果として、目標流量より低く始まる。肝臓は21まで温めた後、ターゲット·フローは、一般的に達成することができPV上の3 mmHgのとHA上の30 mmHgでの圧力を利用して&#160;灌流の60分（図1A）後のC°。胆汁の流れは、一般に、灌流の10分以内に観察することができ、灌流（図1B）の間に確実に生成される。胆汁量は肝臓の品質に依存し、18 ml /分/ kgの0.3ミリリットル/時間/ kgの肝臓の範囲である。より一層安定したまたはより短い温阻血時間の結果を向上させながら、より長い温阻血時間と肝臓では、胆汁流量は、先細りする傾向がある胆汁生産。 リアルタイム測定 両方の実験の目的には必須で血液ガス分析による灌流の直接的かつ頻繁な測定と同様に維持する十分な灌流状態、重要な酸素およびpH。溶存酸素分圧は、PVとHAの両方の流入に700 mmHgのよりも大きくなければならない。大静脈で測定流出酸素圧は、一般的に増加する酸素摂取量を反映して、より長い灌流低下する。以前は13であり、t = 3時間（図1C）で2.4〜9.7ミリリットルO 2 /分/ kgの灌流の開始時に0.5〜2.2ミリリットルO 2 /分/ kgの範囲であった説明したように、酸素摂取速度を算出することができる。 pHの低下は、主に、灌流液中の乳酸放出の結果として、最初の30分（図1D）において観察される。これは8.4％のナトリウムbicarboで補充によって支持することができるネイトは、約90分後にpHが戻って正常範囲に収まる。一般的に、8.4％の重炭酸ナトリウム30〜50ミリリットルを必要とされている。乳酸第一15〜30分で急速に濃度が増加するが、最初の時間（図1E）の後に死亡し始めます。 事後測定 そのようなALTなどの肝トランスアミナーゼは灌流液で測定することができる。最初の30分ではALTの大幅な増加は、一般的に虚血（図1F）の間にリリースされたALTの洗い出しを反映して観察される。 ALTは、温阻血時間13とよく相関することが示された。マシン灌流は回復エネルギー状態（図1G）を反映して、ATPのコンテンツを2.8倍に増加した。 H＆E組織学的分析は、マシン灌流（ 図1H、I）の間に持続的な追加の傷害を明らかにしなかった。これは、このプロトコルで提案検レジメンは解像度のためのものであることに留意すべきであるearchが目的や臨床目的のために適用できない場合があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> 図1：機械灌流中のヒトの肝臓の評価灌流（B）、酸素UPRATE速度（OUR）、流入の差から算出した（PVの時間当たりの定量化PVおよびHA SNMP（A）中、胆汁生産、フロースルー+ HA）および流出（大静脈）は、ラインが灌流液（F）、ATPへの灌流の間の灌流（C）、pHおよび乳酸中の入口および流出内の酸素分圧（D、E）、ALTの放出を示す中断（H）とした後（I）灌流の前に肝臓（54才DCD、19分温虚血、559分冷たい虚血）の毎時生検（G）とH＆E汚れから組織で測定されたコンテンツ。結果は、平均±SEMとして提示されている。 <aHREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

我々はsubnormothermic温度（21℃）で、ヒト肝臓移植片のex vivoでの機械灌流法を説明する。

Subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

この手順の全体的な目的は、臓器の保存、回復、および評価のために、ヒト肝臓の低体温マシン灌流を行うことです。前臨床研究の環境では、まず肝臓を装置に接続するための準備を行い、次にマシン灌流システムをプライミングし、最後に肝臓を接続して灌流を開始することでこれを達成します。マシン灌流された肝臓は、亜正常温度状態で機能的に活性化し、胆汁を生成します。最終的に、灌流中に肝臓から採取されたサンプルを分析することで、臓器の代謝回復と機能を研究することが可能です。低温灌流や正常温度灌流などの既存の保存方法に対するこの技術の主な利点は、亜正常温度マシン灌流では、体温灌流のような高い代謝要求を満たす必要がなく、肝臓の機能的回復と生存能の評価が可能である点にあります。この手法の多くの側面では、正常に完了させるために経験や実演が必要です。例えば、動脈、静脈、および胆管の解剖を含む肝臓のバックテーブル準備の実施方法に関する実演は、外科的トレーニングを受けていない研究者にとって有用です。肝臓を受け取ったら、滅菌ドレープをかけた表面に氷を満たした臓器ボウルを置き、肝臓を輸送箱から取り出し、低温保存液のバッグに大部分が浸かった状態にしてください。次に、Metzenbaum剪刀を使用して、大動脈から固有肝動脈に至る肝臓への動脈供給に沿った様々な分枝を露出させます。次に、末端が見えない分枝を切断または結紮することなく、肝臓に供給される血管を損傷しないよう、動脈の残りの部分を慎重に剥離します。動脈が単離されたら、0から4-0のシルク縫合糸を用いて、肝臓に供給されていないすべての動脈分枝を結紮します。脾動脈および胃動脈は、腹腔動脈の起始部付近で結紮し、切断します。腹腔動脈幹の周囲に大動脈パッチを作成します。次に、動脈灌流カニューレを用いて腹腔動脈幹にカニュレーションを行います。続いて門脈を剥離し、分枝の結紮や静脈の穿孔部の縫合を行った後、門脈灌流カニューレでカニュレーションします。静脈自体を切断しないように注意しながら、肝上大静脈から横隔膜の切片を切り出します。次に、総胆管の端から、全周にわたる長さ 2〜3 mm の組織サンプルを2つ切り出します。サンプルは慎重に取り扱ってください。1つのサンプルを液体窒素で急速凍結し、-80 °Cで保存し、もう1つを10%緩衝ホルマリンで保存します。次に、総胆管に血管カニューレを挿入し、小径チューブで作製したドレナージチューブを接続します。続いて、嚢管を0号のシルク糸で結紮します。フラッシュ用チューブセットを氷冷した乳酸リンゲル液バッグに接続し、チューブ内をプライミングして空気を除去します。フラッシュ用チューブの流量調節器を低速に設定し、門脈の肝門部を遮断して血管内の空気を除去します。次に、門脈内の空気を除去するために、静脈内のカニューレにフラッシュ液を満たします。この際、静脈への過剰な圧力を避けるため、バッグを肝臓の高さから20 centimeters以上高くしないように注意してください。次に、合計2 Lの氷冷乳酸リンゲル液で肝臓を洗浄します。洗浄中、門脈の最下点を短時間遮断して漏れがないかを確認します。続いて、同様に肝動脈を1 Lの溶液で洗浄します。肝臓の洗浄が行われている間に、室温のperfuse 8を2 L加えて灌流システムを充填し、装置を始動してチューブ内をプライミングします。温度を21 °Cに設定してください。次に、門脈の圧力を3 mmHgに、肝動脈の圧力を30 mmHgに設定します。カーボゲンガスボンベを開き、流量を3 L/minに設定します。続いて、門脈および肝動脈の流入側サンプルポートから血液ガス検体を採取し、製造元の指示に従って血液ガス分析装置で測定し、十分な酸素化とpHが確保されていることを確認します。必要に応じて、炭酸水素ナトリウムまたは塩化水素を用いてpHを調整してください。その後、肝臓を接続する前に、0分時の測定値として灌流液を1 mL採取し、-80 °Cで保存します。同時に、シングルエッジの鋼製メスを使用して、肝臓から約250 mgの楔状生検検体を2つ採取してください。一方のサンプルは液体窒素で急速凍結して-80°Cで保存し、もう一方は10%緩衝ホルマリンで固定します。灌流を開始する前に肝臓の重量を測定し、その後、臓器を装置の臓器チャンバーに移してカニューレ内の空気を除去します。実演した通りに行います。カニューレを挿入したら、門脈および肝動脈の流入路を適切なカニューレに接続します。灌流を開始し、濡れた滅菌ガーゼで流入血管を含む乾燥した表面をすべて覆い、肝臓が灌流液に浸っていることを確認してください。脱水を防ぐため、胆管からの胆汁は回収容器に排出させます。胆汁ドレナージの開口部を肝臓の高さかそれ以下に配置し、胆汁が自由に流れるように注意します。肝臓が21 °Cまで加温されたら、門脈の流量を275～325 mL/min/kg、肝動脈の流量を50～100 mL/min/kgに設定します。灌流中、必要に応じて灌流した肝組織および胆汁からサンプルを採取します。灌流を3時間継続し、圧力、pH、および酸素化をモニタリングしながら、必要に応じて重曹でpHを調整します。灌流終了後、最終サンプルを回収し、肝臓を切り離して胆管カニューレを除去します。最後に、先ほど示した方法で胆管の灌流後組織サンプルを2点採取し、ヒト肝臓を廃棄します。適切なバイオハザード廃棄ガイドラインに従います。冷えた肝臓は抵抗が高いため、門脈に3 mmHg、肝動脈に30 mmHgの圧力をかけても、最初は流量が低くなります。一般的に、60分間の灌流後に肝臓が21 °Cまで温まると、目標とする流量を達成できます。実験目的および適切な灌流条件を維持するために、血液ガス分析による灌流液の頻繁な測定が不可欠です。例えば、門脈および肝動脈の両方の流入側において、溶存酸素分圧は700 mmHg以上である必要があります。一方、大静脈で測定される流出酸素分圧は、酸素摂取量の増加を反映して、灌流時間が長くなるにつれて一般的に低下します。また、例えばPERFU 8を用いて肝トランスアミナーゼを測定することも可能です。一般に、灌流開始後の最初の30分間でアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の上昇が認められ、その後の灌流期間中のさらなる上昇は最小限に留まります。機械灌流肝におけるTP産生のさらなる評価では、肝臓のA TP含有量が2.8倍に増加しており、エネルギー状態の回復が反映されています。さらに、H&amp;E組織学的解析の結果、処置中に新たな損傷が生じていないことが明らかになりました。この手順に従うことで、分離した肝臓の広範な解析が可能となり、肝臓の生理学および病理学に関する独自の知見を得ることができます。このビデオを視聴することで、体外での機能評価を促進するために、肝臓を正常灌流装置を用いてどのように維持するかについて十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

そのような脂肪肝、古いドナーからの移植片、または心臓死（DCD）の後に検索された肝臓のような限界移植片は、不十分にしか従来、冷たい静的記憶を容認。私たちは、移植前に限界肝臓移植片の保存、評価、および修復のためのsubnormothermic ex vivoでの肝灌流の新規モデルを開発した。...

Subnormothermicのテクニック<em&gt;生体外</em&gt;肝臓ストレージ、評価のための灌流、およびマージナル肝移植片の修復

ここでは、ドナーの肝臓移植片の酸素化ex...

Ex Situドナー肝臓のNormothermicマシン灌流

重要な肝ドナー不足があるし、肝ドナーの条件が展開されています。常温体外肝灌流 (NEVLP) は評価し臓器の機能を変更しました。本研究は NEVLP のモデルラットを示します、保存肝傷害を軽減するために、ペグインターフェロン...

Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

ここで説明した肝臓正常温機械灌流(NMP)のブタモデルは、NMPの保存戦略、生存率評価のツール、および臓器修復のプラットフォームとしての研究にうまく使用できます。高い翻訳価値を持っていますが、技術的には困難で、労働集約的です。...

ブタのNormothermic分離肝灌流

マウス肝臓用に正常体温 外生体外...

マウスにおけるノルマザーミック Ex vivo 肝臓機械灌流

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灌流および同所性肝移植による循環器死(DCD)肝臓後のブタ提供の保存

ここでは、既存のプラットフォームの高コストと限られた柔軟性を克服するように設計された、オープンソースで変更可能な常温 ex vivo...

研究者向けに設計されたオープンソースのノーマザミック灌流システム

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神経因性疼痛、痙縮の管理のための呼吸制御型電気刺激（BreEStim）

内膜過形成（IH）及び静脈グラフト不全の発症を導くメカニズムはまだよく理解されていない。本研究では、制御された流れと圧力の下で、人間の静脈を灌流するためにex vivoでシステムが記載されている。さらにIHの開発を制限する外部メッシュ補強の効率を評価した。...

人間の伏在静脈のための手順生体外灌流および外部補強

ここでは、メルファランによる単離肝灌流(IHP)の実施方法を提示し、また、ブドウ膜黒色腫の肝転移に対する治療選択肢としてのIHPについても議論します。...

ブドウ膜黒色腫の肝転移の治療として単離した肝灌流

学ぶ サブノルモサーミックマシン灌流によるヒト肝臓の機能的保存と回復法。21°Cで代謝回復と胆汁産生を評価し、移植前の臓器活力判定に有用な技術を解説します。

Subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復

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